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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710419704.6 (22)申请日 2017.06.06 (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301号 (72)发明人 吴沿友 吴沿胜 邢德科 于睿 黎明鸿 姚香平 徐小健 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种前胡植株再生体系建立方法 (57)摘要 本发明公开了一种前胡植株再生体系建立 方法， 属于植物组织培养技术领域， 该方法首先 对前胡外植体进行灭菌处理， 然后接种到愈伤组 织诱导培。
2、养基中愈伤组织诱导、 愈伤组织分化培 养， 接着选取外植体丛生芽进行生根培养， 最后 驯化移栽组培苗， 建立前胡植株再生体系。 本发 明外植体灭菌效果好、 成活率高， 愈伤组织诱导 率高、 体积大、 生长状态好， 丛生芽增殖系数高， 组培苗生根率高， 移栽成活率高， 培养条件不受 外界天气变化和病虫害的影响； 该方法成本低 廉、 经济实用、 重复性好、 生产和生长周期短， 可 用于前胡的工厂化育苗。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 107223564 A 2017.10.03 CN 107223564 A 1.一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)外植体。
3、灭菌： 以长势良好的前胡植株的根、 茎、 叶为外植体材料， 首先对外植体材料 分别用乙醇消毒后， 用无菌水冲洗； 然后分别用0.1HgCl2消毒， 无菌水冲洗； 再用无菌滤 纸吸干外植体材料表面的水分后， 无菌手术刀将根切成方块状、 茎切成段状、 叶切成方片 状； 2)愈伤组织诱导： 将1)得到的根、 茎、 叶外植体接种到愈伤组织诱导培养基中， 在黑暗 或者弱光条件下培养45周， 诱导出愈伤组织； 3)分化培养： 将2)形成的愈伤组织接种到分化培养基上， 在植物组织培养室内培养4 6周， 培养出前胡丛生芽； 4)生根培养： 选取生长健壮、 株高为34cm的前胡丛生芽， 将其切成单芽转接到生根培。
4、 养基中， 在植物组织培养室内培养810周， 得到生根的前胡无菌组培苗； 5)组培苗驯化移栽： 当前胡无菌组培苗的苗高4cm以上、 根系长度3cm以上时选取生长 健壮、 根系良好、 株高一致的前胡组培苗， 移到自然光下炼苗35天， 然后打开封口膜开口 炼苗12天； 最后适时移栽至合适的移栽基质中， 幼苗管理直至成苗， 即完成前胡植株再生 体系的建立。 2.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述乙醇的浓 度为7075。 3.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述1)中用乙 醇灭菌的时间控制在1min内， 用0.1HgCl2对根、 茎。
5、、 叶的消毒时间分别为： 1215min、 12 15min和1012min。 4.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述1)中根切 成约0.5cm3方块状， 茎切成约1.0cm小段状， 叶切成约0.25cm2方片状。 5.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述愈伤组织 培养基具体为： 根愈伤组织诱导培养基为： NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L或者2， 4-D 2.0mg/L +KT 0.5mg/L； 茎愈伤组织诱导培养基为： NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L； 叶愈伤组织诱导培 养基为： NAA 。
6、0.5mg/L+TDZ 0.05mg/L。 6.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述分化培养 基为： 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L。 7.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述生根培养 基为： 1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。 8.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述移栽基质 为： 体积比为1:1的腐质土和蛭石。 9.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述3)和4)中 植物组织培养室的温度控制在253， 空气相对湿。
7、度保持在4060， 光照时长为12h/ d， 光照强度为15002000lx。 10.根据权利要求1所述的一种前胡植株再生体系建立方法， 其特征在于， 所述培养基 为MS固体培养基， 培养基中琼脂为8.0g/L， 蔗糖浓度为30g/L， pH为5.86.0。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107223564 A 2 一种前胡植株再生体系建立方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 涉及一种植株再生体系建立方法， 具体涉及 一种前胡植株再生体系建立方法。 背景技术 0002 前胡始载于 名医别录 ， 至今有1500多年的悠久用药历史。 安徽宁国以盛产道地 药材前胡而。
8、著称且该地所产前胡以个大皮黑、 条长肉黄、 质地柔软、 气味浓郁等特点著称， 在中药界享有 “宁前胡” 之美誉。 由于连年采挖， 野生资源逐渐枯竭， 上世纪90年代末由宁国 医药局牵头开展了野生前胡改家种试验并取得成功。 目前人工栽培的前胡根部分叉现象严 重， 伴有变异发生导致前胡种性退化， 品质下降。 前胡生产上多采用种子繁殖和分根繁殖， 分根繁殖系数低， 用种量大， 长期分根无性繁殖易导致种性退化， 而种子繁殖萌发率低， 出 苗不整齐， 生长周期长。 另外， 前胡栽培品一般次年就出现抽薹现象， 这些问题严重制约了 前胡的可持续发展， 既难满足市场需求， 又不易获得经济效益。 0003 因此。
9、， 如何提高前胡繁殖效率成为前胡资源保护和市场供需需要解决的关键技 术。 利用组织培养技术可以遗传母本优良性状， 避免种性退化和遗传变异， 高繁殖率为前胡 工厂化育苗提供可能； 目前前胡组织培养的相关报道并不多见。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种前胡植株再生体系建立方法， 该方法外植体灭菌效果 好、 成活率高， 愈伤组织诱导率高、 体积大、 生长状态好， 丛生芽增殖系数高， 组培苗生根率 高， 移栽成活率高。 0005 本发明采取以下技术方案： 0006 一种前胡植株再生体系建立方法， 包括以下步骤： 0007 1)外植体灭菌： 以长势良好的前胡植株的根、 茎、 叶为外植体材料， 。
10、首先对外植体 材料分别用7075乙醇消毒后， 用无菌水冲洗； 然后分别用0.1HgCl2消毒， 无菌水冲 洗； 再用无菌滤纸吸干外植体材料表面的水分后， 无菌手术刀将根切成约0.5cm3方块状， 茎 切成约1.0cm小段状， 叶切成约0.25cm2方块状； 0008 2)愈伤组织诱导： 将1)得到的根、 茎、 叶外植体接种到愈伤组织诱导培养基中， 在 黑暗或者弱光条件下培养45周， 诱导出愈伤组织； 0009 3)分化培养： 将2)形成的愈伤组织接种到分化培养基上， 在植物组织培养室内培 养46周， 培养出前胡丛生芽； 0010 4)生根培养： 选取生长健壮、 株高为34cm的前胡丛生芽， 将。
11、其切成单芽转接到生 根培养基中， 在植物组织培养室内培养810周， 得到生根的前胡无菌组培苗； 0011 5)组培苗驯化移栽： 当前胡无菌组培苗的苗高4cm以上、 根系长度3cm以上时选取 生长健壮、 根系良好、 株高一致的前胡组培苗， 移到自然光下炼苗35天， 然后打开封口膜 开口炼苗12天； 最后适时移栽至合适的移栽基质中， 幼苗管理直至成苗， 即完成前胡植株 说 明 书 1/7 页 3 CN 107223564 A 3 再生体系的建立。 0012 进一步， 所述1)中用乙醇灭菌的时间控制在1min内， 用0.1HgCl2对根、 茎、 叶的 消毒时间分别为： 1215min、 1215mi。
12、n和1012min。 0013 进一步， 所述愈伤组织培养基具体为： 根愈伤组织诱导培养基： NAA 0.5mg/L+6- BA2.0mg/L或者2， 4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L； 茎愈伤组织诱导培养基为： NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L； 叶愈伤组织诱导培养基为： NAA 0.5mg/L+TDZ 0.05mg/L。 0014 进一步， 所述分化培养基为： 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L。 0015 进一步， 所述生根培养基为： 1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。 0016 进一步， 所述移栽基质为： 体积比为1。
13、:1的腐质土和蛭石。 0017 进一步， 所述3)和4)中植物组织培养室的温度控制在253， 空气相对湿度保持 在4060， 光照时长为12h/d， 光照强度为15002000lx。 0018 进一步， 所述培养基为MS固体培养基， 培养基中琼脂为8.0g/L， 蔗糖浓度为30g/L， pH为5.86.0。 0019 本发明有以下技术效果： 0020 1)将新型植物生长调节剂TDZ(噻苯隆)首次应用到伞形科前胡属中药材前胡组织 培养中， 并发现对前胡叶片愈伤的形成具有良好效果。 0021 2)前胡叶片诱导产生的愈伤组织体积大， 生长状态好， 可用于次生代谢产物生产 和细胞工程。 0022 3)。
14、利用植物组织培养技术对前胡优良性状进行保留并世代传递， 避免种性退化和 遗传变异； 利用植物组织培养技术对前胡进行再生体系构建， 培养条件不受外界天气变化 和病虫害的影响； 该方法成本低廉、 愈伤组织诱导率高、 重复性好、 生产和生长周期短。 附图说明 0023 图1为本发明愈伤组织诱导培养中的根愈伤组织图； 0024 图2为本发明愈伤组织诱导培养中的茎愈伤组织图； 0025 图3为本发明愈伤组织诱导培养中的叶愈伤组织图； 0026 图4为本发明分化培养基中长成的丛生芽图； 0027 图5为本发明生根培养基长成的宁前胡无菌组培苗图； 0028 图6为本发明生根培养基长成的宁前胡组培苗的生根图；。
15、 0029 图7为本发明生根组培苗长成的宁前胡再生植株图。 具体实施方式 0030 下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明， 但本发明的保护范围并 不限于此。 0031 本发明的详细实施过程及内容如下： 0032 (1)外植体灭菌： 以长势良好的宁前胡植株的根、 茎、 叶为外植体材料， 分别用75 乙醇消毒30s， 无菌水冲洗35次； 然后用0.1HgCl2分别对根、 茎、 叶消毒15、 12和10min， 无菌水冲洗35次后， 用无菌滤纸吸干根、 茎、 叶表面的水分， 无菌手术刀将根切成0.5cm3 的方块， 茎切成长度为1.0cm的小段， 叶切成0.25cm2的方块。 说 明 书。
16、 2/7 页 4 CN 107223564 A 4 0033 本实施例中用75乙醇+0.1HgCl2对宁前胡根、 茎、 叶进行消毒， 是通过消毒剂 筛选实验， 得到根、 茎、 叶消毒的结果而确定的； 结果见表1。 0034 表1消毒剂对消毒效果的影响 0035 0036 由表1可知， 本实施例的75乙醇+0.1HgCl2对宁前胡根、 茎、 叶3种外植体消毒 效果好、 成活率高。 0037 确定消毒剂组合后， 对消毒时间范围进行筛选实验， 其中根的消毒时间为8、 10、 12、 15、 20min， 茎和叶的消毒时间为5、 8、 10、 12、 15min， 结果见表2。 0038 表2消毒时间。
17、对灭菌效果的影响 0039 0040 由表2可知， 本实施例的根采用75乙醇30s+0.1HgCl2 15min的消毒效果最佳， 茎采用75乙醇30s+0.1HgCl212min的消毒效果最佳， 叶采用75乙醇30s+0.1 HgCl210min的消毒结果最佳。 0041 (2)愈伤组织诱导： 将(1)得到的根、 茎、 叶外植体接种到愈伤组织诱导培养基中， 黑暗或者弱光条件下培养(实验条件的筛选见表5、 6)， 根、 茎、 叶的具体培养时间为： 45 周； 其中， 通过不同激素组合对外植体愈伤组织诱导影响的实验， 见表3及表7， 确定根愈伤 组织诱导培养基为： MS+NAA 0.5mg/L+6。
18、-BA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L或者MS+2， 4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L， 最高诱导率达78.89； 茎愈伤组织诱导培养 说 明 书 3/7 页 5 CN 107223564 A 5 基为： MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L， 最高诱导率达80.00； 叶愈 伤组织诱导培养基为： MS+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L， 最高诱导率 达95.56； pH为5.86.0； 根、 茎、 叶诱导愈伤组织的形态特征， 见表4； 0042。
19、 表3不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响 0043 0044 0045 表4不同外植体诱导愈伤组织的比较 0046 0047 由表4可知， 本发明实施例的宁前胡植株再生体系中， 叶片是最好的愈伤诱导材料 选择， 其次依次是茎段和块根。 0048 表5光照条件对叶片愈伤组织诱导的影响 说 明 书 4/7 页 6 CN 107223564 A 6 0049 0050 由表5可知， 本发明实施例的宁前胡植株再生体系中， 避光条件下进行宁前胡叶片 愈伤组织的诱导， 有利于愈伤组织形成和提高诱导率。 0051 表6黑暗处理对叶片愈伤组织诱导的影响 0052 0053 由表6可知， 本发明实施例的宁前。
20、胡植株再生体系中， 黑暗培养周期过短或者过长 都影响愈伤形成和生长； 黑暗培养一周后逐渐增加光照强度有利于愈伤组织形成， 保持愈 伤组织健康生长。 0054 表7激素对愈伤组织继代的影响 0055 0056 由表7可知， 本发明实施例的宁前胡植株再生体系中， MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L对宁前胡愈伤组织增殖和分化效果最好， 其中分化率高达66.67， 增殖系数为 说 明 书 5/7 页 7 CN 107223564 A 7 4.63， 愈伤生长状态较好， 体积较大。 0057 (3)分化培养： 将(2)形成的愈伤组织接种到分化培养基上， 在温度为25， 空气相 对湿度。
21、保持在4060， 光照时长为12h/d， 光照强度为15002000lx植物组织培养室内 培养， 根、 茎、 叶的具体培养时间为： 45周， 培养出株高为34cm的宁前胡丛生芽， 其中， 通 过激素对不定芽分化影响的实验， 见表8， 确定分化培养基为： MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L， pH为5.86.0。 0058 表8激素对不定芽分化的影响 0059 0060 由表8可知， 本发明实施例的宁前胡植株再生体系中， MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的不定芽诱导培养基对不定芽的增殖和分化效果最明显， 诱导出的不定芽芽体数。
22、 量多且壮实、 长势好、 叶色浓绿， 在后续培养过程中生长情况优良。 说 明 书 6/7 页 8 CN 107223564 A 8 0061 (4)生根培养： 选取生长健壮的宁前胡丛生芽， 将其切成单芽转接到生根培养基 中， 保持植物组织培养室内培养条件不变， 培养810周， 得到生根的宁前胡无菌组培苗， 其 中， 通过不同激素组合对宁前胡生根影响的实验， 见表9， 确定生根培养基为： 1/2MS+ NAA0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L， pH为5.86.0。 0062 表9不同激素组合对宁前胡生根影响 0063 0064 由表9可知， 本发明实施例的宁。
23、前胡植株再生体系中， 宁前胡组培苗最佳生根培养 基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L。 0065 (5)组培苗驯化移栽： 当宁前胡组培苗苗高达4cm以上、 根系长度达3cm以上时选取 生长健壮、 根系良好、 株高一致的宁前胡组培苗， 移到自然光下炼苗35天， 然后打开封口 膜开口炼苗12天； 最后适时移栽到移栽基质(体积比为1:1的腐质土和蛭石， 移栽基质的 确定见移栽基质对组培苗移栽影响的实验， 表10)中， 幼苗管理直至成苗， 即完成宁前胡植 株再生体系建立。 0066 表10移栽基质对组培苗移栽的影响 0067 0068 0069 由表10可知， 本发明实施例的宁前胡植株再生体系中， 腐质土和蛭石的体积比为 1:1的混合基质最适宜宁前胡再生植株的生长。 0070 所述实施例为本发明的优选的实施方式， 但本发明并不限于上述实施方式， 在不 背离本发明的实质内容的情况下， 本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进-替换 或变型均属于本发明的保护范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 107223564 A 9 图1 图2 图3 图4 说 明 书 附 图 1/2 页 10 CN 107223564 A 10 图5 图6 图7 说 明 书 附 图 2/2 页 11 CN 107223564 A 11 。