技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及瑞香狼毒茎叶提取物抗枸杞蚜虫的应用。
背景技术
枸杞蚜虫（Aphid gosypiiGlover）是枸杞林的重大害虫,难于控制,常在枸杞生长季节暴发成灾,引起枸杞果产量降低30%～70%,产品质量大幅度下降,商品价值受到严重影响。枸杞蚜虫的危害主要引起枸杞产量下降、叶片和果实营养成分与微量元素含量发生变化。当虫口密度达到6.3头/粒红果时,即出现产量损失。虫口密度越高,产量损失越大,虫口密度与产量之间呈对数显著相关关系。防治枸杞蚜虫对枸杞的产量和品质提高具有重要意义。
化学农药的长期大量使用带来了种种弊端，如有害生物抗药性的产生、残毒以及环境污染，良莠不分地杀死大量害虫天敌，严重破坏了生态平衡。因此，符合环保、健康、持续发展理念的高效、低毒、低残留、与环境相容的生物农药开发就成为当今农药研究的主题。生物农药因其安全无毒、无残留、不污染环境而为公众所接受并迅速发展。20世纪90 年代以来, 全世界化学农药销售量以 1%～2%的速度不断下降, 而生物农药却以20%的速度递增，充分说明生物农药之于环境，之于社会效益的巨大潜力。
瑞香狼毒(Stellera Chamaejasmel L. )隶属于瑞香科狼毒属多年生草本植物，又名断肠草，有毒性，其根有逐水祛痰，散结杀虫之功效。茎高根粗，质韧不易折断，树皮有绵性纤维；地上部分呈淡褐色，不分枝，平滑无毛；叶披针形，顶生头状花序，花黄色或白色，果实为小坚果卵形，产种量大，种子生命力强，花期 6～8 月，果期 9～10 月。瑞香狼毒多生长在海拔较高、年平均温度在0℃左右的向阳山坡，广泛分布于我国东北、西北、西南等地。瑞香狼毒根部抗旱力和竞争力极强，可对周围其他植物种产生明显的郁蔽作用。另外，瑞香狼毒除了其一些药用价值外还具有一定的生态作用，还可以作为生物源农药，如杀虫剂。
瑞香狼毒的杀虫活性主要体现在其作为植物源农药方面的应用。曹挥等对瑞香狼毒根提取物进行活性测定发现瑞香狼毒的杀虫效果表现为触杀和胃毒活性。李捷等用多种测定方法比较狼毒根的4种不同提取物的杀虫效果，发现其均具有良好的杀虫效果。高平等通过SCEE对棉蚜、桔蚜和烟蚜的触杀毒性、拒食活性进行了室内研究和田间试验，结果表明：狼毒根提物对几类蚜虫的杀虫作用很好，但由于蚜虫来源的不同，杀虫效果存在一定的差异。侯太平自狼毒中得到2种强效灭蚜组分：1,5-二苯基-1-戊酮和1,5 - 2 - 1 -二苯基烯丙基环戊酮，并把它作为蚜虫生物去除剂的主要成分，且田间实验效果很好。但目前对瑞香狼毒的利用存在一定的缺陷，整株利用导致要采集整株瑞香狼毒，需要不断种植，使成本增加。
发明内容
为解决现有技术上的不足，本发明提供了瑞香狼毒茎叶提取物抗枸杞蚜虫的应用。
本发明的目的是提供瑞香狼毒茎叶提取物抗枸杞蚜虫的应用，利用生物农药替代化学农药，利用茎叶，避免采挖根部对植被、土壤的破坏。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种用于抗枸杞蚜虫的瑞香狼毒茎叶提取物，所述提取物含有瑞香狼毒黄酮，并按照以下工序获得：
分别称取茎叶干粉1kg，固液比1：25-30，加乙醇浸泡，超声50min，提取2次，过滤，滤渣重复提取，旋蒸浓缩得到初浸膏。初浸膏与硅胶拌样，旋蒸后，装入层析柱内，按照极性大小依次用有机溶剂进行洗脱，得到了两种不同的分离组分。
优选的，层析系统溶剂为乙酸乙酯相或正丁醇相。
优选的，所述提取物的浓度为0.1-0.0005mg/ml。
优选的，所述提取物的浓度为0.01，0.005，0.0025mg/ml。
所述的提取物可制作为为乳油、水悬浮剂、油悬浮剂、可湿性粉剂、颗粒剂或水分散粒剂等农药上可接受的剂型。
所述的提取物制剂包括在农药上可接受的，一种或多种选自润湿剂、分散剂、增稠剂、防冻剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、载体或填充剂的助剂。
一种用于抗枸杞蚜虫的瑞香狼毒茎叶提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）瑞香狼毒杀虫活性成分的提取
称取干燥粉碎的瑞香狼毒粉末2kg，按照料液比1：25-30，加入95%的乙醇，冷浸3天后，超声波提取2次，每次60min。重复浸提三次，过滤并合并3次滤液，利用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至1/10量时，倒出放置，进行沉淀脱糖，糖以结晶状态析出。液体再经旋转蒸发仪浓缩得初浸膏。
（2）瑞香狼毒杀虫活性成分的分离
按照提取流程图1，瑞香狼毒乙醇相浸膏以乙醇溶解拌入10倍量的硅胶，在旋转薄膜蒸发仪蒸干后，装入层析柱内依次用乙酸乙酯、正丁醇进行洗脱分离，通过薄板检测和洗脱量为依据进行更换洗脱溶剂，分别得到不同的分离部位，即乙酸乙酯相和正丁醇相。将各不同溶剂相烘干后，备用。
优选的，所述步骤（1）中料液比1：25或1：30。
提取物在防治枸杞蚜虫中的应用。
优选的，提取物在防治枸杞3龄蚜虫中的应用
本发明的有益效果是：以地上部分代替根部作为原料，既避免了采挖根部对植被、表层土壤造成难以恢复的破坏，又可以有效地控制狼毒肆虐草原的危害。同时, 解决了变害为宝，有利于狼毒的防除以及开发利用。
附图说明
图1是瑞香狼毒提取工艺流程图。
图2是茎叶粗提物的抗虫效果。
图3是茎叶与根的粗提物对蚜虫的抗虫活性研究。
图4茎叶的乙酸乙酯相与茎叶正丁醇相对枸杞蚜虫的抗虫活性比较。
图5茎叶不同分离相组分对蚜虫的抗虫活性研究。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述：
实施例1 瑞香狼毒茎叶、根提取物提取
1.1实验材料
材料：狼毒根、茎叶，菜青虫、甜菜夜蛾幼虫。
试剂：芦丁标准品，乙醇，正丁醇，乙酸乙酯，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等及其他分析纯试剂和蒸馏水。
1.2瑞香狼毒杀虫活性成分的提取
称取干燥粉碎的瑞香狼毒粉末2kg，按照料液比1：30，加入95%的乙醇，冷浸3天后，超声波提取2次，每次60min。重复浸提三次，过滤并合并3次滤液，利用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至1/10量时，倒出放置，进行沉淀脱糖，糖以结晶状态析出。液体再经旋转蒸发仪浓缩得初浸膏。
1.3瑞香狼毒杀虫活性成分的分离
按照图1，瑞香狼毒乙醇相浸膏以乙醇溶解拌入10倍量的硅胶，在旋转薄膜蒸发仪蒸干后，装入层析柱内依次用乙酸乙酯、正丁醇进行洗脱分离，通过薄板检测和洗脱量为依据进行更换洗脱溶剂，分别得到不同的分离部位，即乙酸乙酯相和正丁醇相。将各不同溶剂相烘干后，备用。
实施例2 瑞香狼毒茎叶及根提取物抗虫活性比较
2.1瑞香狼毒生物活性测定方法
2.1.1瑞香狼毒茎叶及根粗提物的抗虫活性测定方法
取瑞香狼毒茎叶及根的粗提物各0.1g，用10mL丙酮溶解作为样品，对照组用10mL丙酮作同样处理。
2.1.1.1拒食活性测定方法
采用浸渍叶碟饲喂法进行拒食活性的测定。将新鲜的白菜叶片剪成1 cm×1 cm的叶碟，放入供试样品的丙酮稀释液内浸2~3s，自然晾干。在直径为9 cm的培养皿底部铺一层滤纸，并加蒸馏水保湿，各皿中放入对应药品处理的叶碟一片，用丙酮处理过的叶碟作对照。挑取大小一致、饥饿4h的3龄菜青虫、甜菜夜蛾幼虫，每个培养皿中放入3龄幼虫1头，以20头为一组，设3个重复。室温下饲养，若供试虫吃完1片叶碟后再加用相同方法处理过的叶碟一片，记录取食叶碟的数量。每隔24h用坐标纸记录取食叶面积，并更换新鲜浸毒叶片，连续记录72h，按照下列公式计算拒食率。
拒食率=（对照组平均取食叶面积—处理组平均取食叶面积）/对照组平均取食叶面积 ×100%
2.1.1.2触杀毒力测定方法
采用浸虫法进行触杀毒力的测定。各培养皿中放入洁净的白菜叶片。选用饥饿4h 的大小一致的3龄菜青虫、甜菜夜蛾幼虫幼虫，将幼虫入供试样品的丙酮稀释液及对照液中，浸2~3s后取出，待药液自然晾干，将幼虫放于培养皿中。每组20头虫，重复3次。分别于处理后24h、48h和72h观察， 根据下列公式记算死亡率。
校正死亡率=（处理组死亡率—对照组死亡率）/(1—对照组死亡率)×100%
2.1.2瑞香狼毒茎叶及根提取物不同分离相的抗虫活性测定方法
取实施例1乙酸乙酯相、正丁醇相各0.1g，用10mL丙酮溶解作为样品，对照组用10mL丙酮作同样处理。
2.1.2.1拒食活性测定方法
实验方法同“2.1.1.1” 拒食活性测定方法。
2.1.2.2触杀毒力测定方法
实验方法同“2.1.1.2” 触杀毒力测定方法。
2.2 实验结果与分析
2.2.1瑞香狼毒茎叶及根粗提物的抗虫活性
2.2.1.1瑞香狼毒茎叶及根粗提物对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的拒食作用
由表1可以看出24h时，茎叶及根的粗提物对菜青虫的平均拒食率达到最高，根粗提物对菜青虫的平均拒食率为82.61%，茎叶粗提物对菜青虫的平均拒食率为84.06%；4个处理组取食面积均与对照差异显著。
由表2可以看出24h时，茎叶及根的粗提物对甜菜夜蛾幼虫的平均拒食率达到最高，根粗提物对甜菜夜蛾幼虫的平均拒食率为81.69%，茎叶粗提物对甜菜夜蛾幼虫的平均拒食率为82.39%；4个处理组取食面积均与对照差异显著。
由表1和表2可以得出，茎叶及根的粗提物对对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫都有很好的拒食作用，茎叶粗提物要好于根粗提物。
表1 瑞香狼毒茎叶粗提物与根粗提物对菜青虫的拒食作用
表2 瑞香狼毒茎叶粗提物与根粗提物对甜菜夜蛾幼虫的拒食作用
2.2.1.2瑞香狼毒茎叶及根粗提物对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的触杀作用
由表3可以看出，茎叶及根粗提物对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的触杀作用随着时间的延长生物活性增强。72h后，茎叶及根粗提物对菜青虫和甜菜夜蛾幼的校正死亡率都达到最高，根粗提物对菜青虫和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分别为100%和99.86%，茎叶粗提物分别为99.96%和100%。茎叶粗提物对菜青虫、甜菜夜蛾幼的校正死亡率一直比及根粗提物的高。
综上所述，茎叶及根的粗提物对对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫都有很好抗虫作用，总体来说，茎叶粗提物要好于根粗提物。
表3 瑞香狼毒茎叶粗提物与根粗提物对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的触杀作用
2.2.2瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同分离相的抗虫活性
2.2.2.1瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同分离相对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的拒食作用
由表4可以看出， 24h后，各相对菜青虫的拒食率达到最高。根乙酸乙酯相拒食率达到90.85%，茎叶乙酸乙酯相拒食率达到92.25%，根正丁醇相拒食率达到65.49%，茎叶正丁醇相拒食率达到69.72%。4个处理组取食面积均与对照差异显著。
由表5可以看出，24h后，各相对甜菜夜蛾幼虫的拒食率达到最高。根乙酸乙酯相拒食率达到90.41%，茎叶乙酸乙酯相拒食率达到92.47%，根正丁醇相拒食率达到65.07%茎叶正丁醇相拒食率达到68.49%。4个处理组取食面积均与对照差异显著。
表4 瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同溶剂相对菜青虫的拒食作用
表5 瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同溶剂相对甜菜夜蛾幼虫的拒食作用
由表4和表5可以看出，相同浓度相同时间内，瑞香狼毒茎叶及根粗提物的乙酸乙酯相的生物活性比正丁醇相高。
2.2.2.2瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同分离相对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的触杀作用
由表6可以看出，乙酸乙酯相校正死亡率比正丁醇相高，生物活性强。
24h后，根乙酸乙酯相对菜青虫和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分别为71.86%和70.41%，茎叶乙酸乙酯相紧随其后分别为73.58%和71.96%；根正丁醇相对菜青虫和甜菜夜蛾幼的校正死亡率分别为50.51%和49.07%，茎叶正丁醇相的分别为52.46%，50.09%；48h后，各相生物活性进一步增强，校正死亡率都有所增加；72h后，根，茎叶乙酸乙酯相对菜青虫和甜菜夜蛾幼的校正死亡率都达到百分之百，根，茎叶正丁醇相也都达到了百分之九十以上。通过以上数据证明，相同浓度相同时间内，乙酸乙酯萃取物对菜青虫和甜菜夜蛾幼的触杀活性最强，正丁醇萃取物活性较弱。
表6 瑞香狼毒茎叶及根粗提物不同溶剂相对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫的触杀作用
上述实验结果表明，茎叶与根提取物及其不同分离相对菜青虫、甜菜夜蛾幼虫均具有一定的抗虫活性。总体来说，茎叶粗提物的抗虫活性要好于根粗提物；相同浓度相同时间内，瑞香狼毒茎叶及根粗提物的乙酸乙酯相的生物活性比正丁醇相高。
实施例3 瑞香狼毒茎叶提取物抗枸杞蚜虫作用
3.1. 瑞香狼毒茎叶提取物对枸杞蚜虫的抗虫活性测定方法
3.1. 1瑞香狼毒茎叶粗提物对枸杞蚜虫的抗虫活性测定方法
将所提取的瑞香狼毒茎叶的粗提物以及不同的分离相取一定量，用一定浓度的丙酮稀释液稀释，配置样品溶液浓度分别为0.01，0.005，0.0025mg/ml。以丙酮作为对照组。
（1） 触杀毒力测定
根据张宗炳的方法，对所试蚜虫进行直接浸渍查看各组分的抗虫效果。取一定大小的平皿，分别在底部铺一层滤纸和一个大小一致的新鲜枸杞叶片，并用移液器加入1ml蒸馏水保持湿度。选取室内饲养的3龄蚜虫30头，每一处理浓度为90头。按照浓度由低到高的顺序，分别将三龄蚜虫放在纱布内在预先配好的各供试样品及对照液中中浸泡10s，取出沥干，吸去药液，置于准备好的平皿中，盖上盖以防止蚜虫爬失。
上述每个处理组均重复3次，置于( 25±1) ℃、相对湿度80%左右、光周期为L/D= 16/8 h的培养箱内。每隔12h，检查死亡与成活个数，计算死亡率，连续记录72h。按照下列公式计算校正死亡率。
校正死亡率=（实验组蚜虫死亡率-对照组蚜虫死亡率）/（1-对照组蚜虫死亡率）×100%
（2） 内吸毒力测定
采用先浸叶后接虫的方法。将不经药物处理的且不含蚜虫虫卵的枸杞叶片，取大小一致，于配置好的药液里浸泡15秒，取出晾干，放入处理好的含滤纸并湿润的平皿中，每个皿中分别用毛笔移入室内饲养的3龄蚜虫30头，每一处理浓度为90头。重复三次试验。
3.1.2茎叶的乙酸乙酯相与茎叶正丁醇相对枸杞蚜虫的抗虫活性比较
将瑞香狼毒茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相用丙酮稀释，分别配置成浓度为0.01、0.005mg/ml的样品溶液，以丙酮作为对照组。分别测定其触杀毒力与内吸毒力，方法同“3.1.1”。
3.2.结果与分析
3.2.1瑞香狼毒茎叶粗提物的抗虫活性分析
3.2. 1.1 触杀活性分析
通过浸虫法研究茎叶粗提物对蚜虫的防治效果发现，茎叶粗提物对蚜虫具有明显防治的效果，粗提物浓度与校正死亡率成正比，浓度越高，抗虫活性越明显；抗虫活性具有明显的时间依赖性（图2）。
3.2. 1.2 内吸活性分析
采用浸叶法对茎叶粗提物进行枸杞蚜虫的抗虫活性研究显示，不同粗提物浓度时，茎叶粗提物的抗虫活性差异显著，浓度越高，抗虫活性越强；且其抗虫活性具有一定的时间依赖性（图3）。
3.2.2瑞香狼毒茎叶提取物不同分离相的抗虫活性比较
3.2.2.1触杀活性分析
通过上述两个实验，选取浓度分别为0.01与0.005 mg/ml 的茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相作为2个剂量进行比较，结果如图4所示：茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相浓度均达到0.01 mg/ml时，茎叶乙酸乙酯相的抗虫活性显著；在茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相浓度均为0.005 mg/ml时，茎叶乙酸乙酯相的抗虫活性略好于茎叶正丁醇相。结果表明，茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相在相同浓度时，茎叶提取物的乙酸乙酯相抗虫效果比正丁醇相显著。
3.2.2.2 内吸活性
使用浸叶法对茎叶乙酸乙酯相与茎叶正丁醇相进行枸杞蚜虫的抗虫活性研究，选用茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相的浓度分别为0.01与0.005 mg/ml两个剂量进行抗虫活性比较，结果如图5所示，当茎叶乙酸乙酯相与正丁醇相在相同浓度时，茎叶乙酸乙酯相处理组的抗虫效果显著高于茎叶正丁醇相，且抗虫活性具有一定的时间依赖性。
本实验选用了瑞香狼毒茎叶粗提取物及其不同分离相分别进行抗虫实验并进行活性比较，研究表明，茎叶提取物及其不同分离相对枸杞蚜虫均具有一定的抗虫活性，茎叶乙酸乙酯相效果比正丁醇相要好，都具有一定的剂量时间依赖性。
以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。