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1、(10)授权公告号 CN 103300215 B (45)授权公告日 2014.08.20 CN 103300215 B (21)申请号 201310232483.3 (22)申请日 2013.06.08 A23K 1/00(2006.01) A23K 1/14(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 阮晖 李青青 徐娟 于骅 诸文颖 陈功 杜姗姗 杨璐 纪晓燚 吴渊 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 CN 101822311 A,2010.09.08, 说明书第 12。
2、-13、 18 段 . CN 102283315 A,2011.12.21, 说明书第 8-9 段 . CN 1086094 A,1994.05.04, 全文 . CN 1504103 A,2004.06.16, 实施例 1. 李进杰 . 平菇菌转化秸秆蛋白饲料研究与应 用 .当代畜牧 .2007,( 第 1 期 ), 第 26-28 页 . 刘姝等 . 茶渣经微生物固体发酵成饲料的初 步研究 . 江西农业大学学报 .2001, 第 23 卷 ( 第 1 期 ), 第 130-133 页 . (54) 发明名称 生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复 合酶兼益生菌制剂的方法 (57) 摘要 本。
3、发明公开了一种生物转化豌豆茎叶和棕榈 饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法， 包 括 ： 将经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇 菌棒、 第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第一苹果渣和第一水充分混合， 经驯化培养后形 成发酵剂 ； 将发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼 粕、 第二麦麸、 第二苹果渣和第二水充分混合， 经 发酵后， 得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。 本发明 中， 利用微生态稳定的食品级安全菌群来发酵豌 豆茎叶和棕榈饼粕制备各项性能指标较好的饲料 用复合酶兼益生菌制剂， 实现豌豆茎叶和棕榈饼 粕的低成本高效生物转化。同时， 本发明方法， 微 生物易生长， 酶活力高。
4、， 发酵过程粗放， 易于工业 化大规模生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 柯虹乔 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 (10)授权公告号 CN 103300215 B CN 103300215 B 1/1 页 2 1. 一种生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法， 其特征 在于， 包括以下步骤 ： 1) 将经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒、 第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第 一麦麸、 第一苹果渣和第一水充分混合， 经驯化培养后形成发酵剂 ； 所述的经渥。
5、堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒、 第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第一苹果渣和第一水的质量比为 10 ： 1 10 ： 1 10 ： 5 15 ： 2 8 ： 1 4 ： 0.5 2 ： 10 30 ； 所述的驯化培养的条件为在 30 45驯化培养 24 60 小时 ； 2) 将步骤 1) 中的发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦麸、 第二苹果渣和第二 水充分混合， 经发酵后， 得到饲料用复合酶兼益生菌制剂 ； 所述的发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦麸、 第二苹果渣和第二水的质量 比为 10 ： 100 800 ： 50 500 ： 10 1。
6、00 ： 5 60 ： 100 1500 ； 所述的发酵采用固态发酵， 所述的固态发酵的条件为 ： 料厚度为 5cm 20cm， 自然通 风， 在 30 45发酵 2 7 天。 2. 根据权利要求 1 所述的生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌 制剂的方法， 其特征在于， 步骤 1) 中， 所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌 棒、 第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第一苹果渣和第一水的质量比为 10 ： 5 ： 5 ： 10 ： 5 ： 2 ： 1 ： 22 25。 3. 根据权利要求 1 所述的生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌 制剂的。
7、方法， 其特征在于， 步骤 1) 中， 所述的驯化培养的条件为在 35 40驯化培养 36 48 小时。 4. 根据权利要求 1 所述的生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌 制剂的方法， 其特征在于， 步骤 2) 中， 所述的发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦 麸、 第二苹果渣和第二水的质量比为 10 ： 300 600 ： 150 300 ： 30 60 ： 15 30 ： 400 1000。 5. 根据权利要求 1 所述的生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生 菌制剂的方法， 其特征在于， 步骤 2) 中， 所述的固态发酵的条件为 ： 固态发酵的料厚度。
8、为 10cm 15cm， 自然通风， 在 35 40发酵 4 5 天。 权 利 要 求 书 CN 103300215 B 2 1/8 页 3 生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌 制剂的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物发酵领域， 具体涉及一种采用微生态稳定的食品级安全菌群发 酵豌豆茎叶和棕榈饼粕， 制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法。 背景技术 0002 我国是一个耕地极度紧张的人口大国， 饲料原料特别是能量饲料和蛋白饲料的需 求均存在巨大缺口。 0003 木质纤维素是地球上最丰富、 最廉价的可再生资源。农产品与食品的生产加工过 程也产生大量木质纤维素类副产物。 木质纤。
9、维素种类繁多， 例如各种农作物秸秆、 城市纤维 质垃圾、 农产品加工副产物如玉米芯、 蔬菜茎叶、 果蔬渣等， 木质纤维素的成分主要包括纤 维素、 半纤维素、 木质素和果胶等， 因其大宗廉价而成为自然界中具有重大应用价值的复杂 底物， 但由于木质纤维素的组成与结构复杂， 因而难以被单胃动物消化。 实现木质纤维素等 非粮物质高效低成本生物转化， 使其替代玉米等谷物作为能量饲料， 将是饲料产业发展的 重要增长点。 0004 饼粕是一类富含蛋白质的大宗农业副产物。随着养殖产业的快速发展， 对蛋白 资源需求量也越来越大， 而且动物性优质蛋白资源 （如鱼粉） 来源有限， 价格近年来一直在 快速上涨， 因此。
10、， 以饼粕为蛋白饲料， 将大大缓解饲料蛋白资源紧张局面， 且能够降低饲料 成本。饼粕种类繁多， 包括大豆饼粕、 棉籽 （仁） 饼粕、 油菜籽饼粕、 花生 （仁） 饼粕、 向日葵 （仁） 饼粕、 茶籽饼粕、 芝麻饼粕等， 但饼粕中含有非常多样的毒性物质和抗营养物质。例如 硫苷在有水情况下经芥子酶分解出异硫氰酸酯和腈等有毒物质， 使动物甲状腺肿大， 新陈 代谢紊乱， 甚至造成皮下出血， 还影响肾上腺皮质、 脑垂体和肝等器官的功能。抗营养物质 alpha-半乳糖苷化合物则使动物肠道胀气从而影响消化功能。 而且饼粕在富含蛋白质的同 时也含相当高的植物纤维成分， 单胃动物消化不易。如果能够高效低成本地消。
11、除饼粕中的 毒性和抗营养物质并进行生物转化， 则各类饼粕将被充分地开发为蛋白饲料原料并替代鱼 粉等高价动物性饲料蛋白， 成为未来饲料产业发展的又一个重要增长点。 0005 微生物发酵是实现木质纤维素和饼粕类农业副产物低成本高效生物转化的有效 途径。 木质纤维素基本上是碳水化合物， 饼粕富含蛋白质， 两者组合可为微生物提供营养丰 富、 比例恰当的发酵基质， 而系统生物学理论则为通过微生物发酵实现木质纤维素和饼粕 的低成本高效生物转化提供了新策略。根据系统生物学理论， 微生物群落与其酶系以及其 所处底物环境是一个不可分割的完整系统， 其形成是长期自然进化和平衡的结果。在此系 统中， 不同微生物所产。
12、酶的种类和活力各有不同， 只有共存于同一系统中并且共享系统所 提供的环境因素， 才能有效转化底物。在自然界中普遍存在由诸多种属不同微生物构成的 微生态稳定平衡的野生微生物群落， 例如瘤胃微生物群落、 沼气微生物群落、 堆肥微生物群 落、 饲料青贮微生物群落、 高等动物肠道微生物群落、 植物内生菌群落、 白腐真菌群落、 食木 性昆虫肠道内生菌群落等。 这些野生微生物群落在其所处特定野生环境中可进行稳定混合 说 明 书 CN 103300215 B 3 2/8 页 4 发酵， 并且由于其所产酶系的多样性， 可以对复杂底物进行生物转化。因此， 根据系统生物 学理论， 通过在天然菌群的基础上， 构建一。
13、个产酶与发酵能力强大而又适合木质纤维素和 饼粕基质环境的微生态稳定菌群， 可望实现木质纤维素和饼粕类的低成本高效生物转化。 0006 普洱茶是一种发酵茶， 其在渥堆发酵过程中形成了菌相复杂但微生态稳定的 菌群， 即普洱茶渥堆菌群， 该菌群包括曲霉属 (Aspergiltus)、 根霉属 (Rhizopus)、 青 霉属 (Penicillium)、 木霉属 (Trichoderma)、 近平滑假丝酵母 (C.parapsilosis)、 无 名假丝酵母 (C.famata)、 西弗假丝酵母 (C.cifferrii)、 克鲁费酵母 (Saccharomyces kluyoerii)、 罗伦隐球。
14、酵母 (Cryptococcus laurentii)、 担子菌 （Basidiomycetes） 、 乳 杆菌属 (Lactobacillus)、 芽孢杆菌属 (Bacillus)、 短杆菌属 (Brevibaterium)、 球菌属 (Staphylococcus)、 线菌属 (Actinoplanes)、 链霉菌属 (Streptomyces) 等， 其中包括丝状 真菌、 酵母和细菌， 既有产酶微生物又有益生菌， 具备了丰富而强大的产酶能力、 发酵转化 能力和益生功效， 可望应用于木质纤维素和饼粕类农业副产物的生物转化。 0007 食用菌是一大类以木质纤维素为基质进行生长繁殖的食品级安全。
15、大型真菌， 重 要食用菌种类包括平菇 (Pleurotus ostreatus)、 扇形侧耳 (Pieurotus flabellatus)、 肺形侧耳 (Pleurotus pulmonarius)、 凤尾菇 (Pleurotus sajor-caju)、 香菇 (Lentinus edobes)、 虎皮香菇(Lentinus tiginus)、 金针菇(Flamulina velutipes)、 灵芝(Gannodema lucidum)、 裂褶菌 (Schizophyllum commune)、 脉射菌 (Phlebia radiata)、 云芝 (Coriolus versicolor。
16、)、 榆黄蘑 (Plearotus citrinopileatus)、 姬菇 (Plearotus cornucopiae)、 杏 鲍 菇 (Pleurotus eryngii)、木 耳 (Auricularia auricular)、羊 肚 菌 (Morchella esculenta)、 茶 树 菇 (Agrocybe cylindracea)、 黄 伞 (Pholiota adipose)、 双 孢 蘑 菇 (Agaricus bisporus)、 斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)、 猴头菌(Hercicium erinaceum)、 姬松茸(Agaricus blaz。
17、ei)、 滑菇(Pholiota nameko)等。 由于食用菌在生长繁殖过程中向 基质中分泌大量木质纤维素酶类， 故其基质对农业副产物特别是木质纤维素类农业副产物 具有很强的生物转化能力。 发明内容 0008 本发明提供了一种生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制 剂的方法， 采用微生态稳定的食品级安全菌群来发酵豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合 酶兼益生菌制剂， 实现豌豆茎叶和棕榈饼粕的低成本高效生物转化。 0009 一种生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方法， 包括 以下步骤 ： 0010 1） 将经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒、 第一豌。
18、豆茎叶、 第一棕榈饼 粕、 第一麦麸、 第一苹果渣和第一水充分混合， 经驯化培养后形成发酵剂 ； 0011 2） 将步骤 1） 中的发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦麸、 第二苹果渣和 第二水充分混合， 经发酵后， 得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0012 普洱茶是一种历史悠久、 公认安全的饮品， 经渥堆发酵的普洱熟茶内形成的普洱 茶渥堆菌群是食品级安全菌群， 香菇和茶树菇是日常食用的食品级安全大型真菌， 其菌棒 中含有丰富的木质纤维素酶类。豌豆茎叶和棕榈饼粕是两种大宗农业副产物。将经渥堆 发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒与第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第一。
19、苹 说 明 书 CN 103300215 B 4 3/8 页 5 果渣和第一水等基质混合后， 通过驯化培养， 使普洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合 形成微生态稳定的食品级安全菌群， 该菌群既拥有普洱茶渥堆菌群的丰富而强大的产酶能 力、 发酵转化能力和益生功效， 又适应基质环境， 同时， 基质环境中含有丰富的来源于香菇 菌棒和茶树菇菌棒的木质纤维素酶类， 可对豌豆茎叶 （即第一豌豆茎叶和第二豌豆茎叶） 和 棕榈饼粕 （即第一棕榈饼粕和第二棕榈饼粕） 进行低成本高效生物转化。因此， 得到的发酵 剂性能较好。 0013 用发酵剂内微生态稳定的食品级安全菌群对豌豆茎叶和棕榈饼粕进行发酵， 将豌 豆茎。
20、叶和棕榈饼粕转化为饲料用复合酶兼益生菌制剂， 得到的饲料用复合酶兼益生菌制剂 的各项性能指标较好。 0014 在发酵剂制备与发酵过程中， 豌豆茎叶作为主要碳源， 棕榈饼粕作为主要氮源， 构 成了发酵基质中的基本成分。麦麸 （即第一麦麸和第二麦麸） 富含维生素和矿质元素， 苹果 渣 （即第一苹果渣和第二苹果渣） 富含维生素和微生物可快速利用的可发酵性糖， 添加麦麸 和苹果渣可为微生物发酵过程提供充分的生长因子 （如有关酶的辅助因子） 和快速利用碳 源。 0015 步骤 1） 中， 作为优选， 所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒、 第一 豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第。
21、一苹果渣和第一水的质量比为 10 ： 1 10 ： 1 10 ： 515 ： 28 ： 14 ： 0.52 ： 1030， 在上述质量比的原料下， 有利于普洱茶渥堆菌群与 天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群， 得到发酵性能更好的发酵剂。进一步优 选， 所述的经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒、 第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一麦麸、 第一苹果渣和第一水的质量比为 10 ： 5 ： 5 ： 10 ： 5 ： 2 ： 1 ： 22 25， 该质量比的原料 下制成的发酵剂， 其发酵性能最优异。 0016 作为优选， 所述的驯化培养的条件为在 30 45驯化培养 24 60 小。
22、时， 该驯 化培养的条件有利于普洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合形成微生态稳定的食品级 安全菌群， 制备发酵性能更好的发酵剂。进一步优选， 所述的驯化培养的条件为在 35 40驯化培养 36 48 小时， 该驯化培养的条件能够制备发酵性能最优异的发酵剂。 0017 步骤 2） 中， 作为优选， 所述的发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦麸、 第 二苹果渣和第二水的质量比为 10 ： 100 800 ： 50 500 ： 10 100 ： 5 60 ： 100 1500， 上述质量比的原料下， 经发酵后， 有利于得到各项性能指标更好的饲料用复合酶兼益生菌 制剂。进一步优选， 所述的。
23、发酵剂、 第二豌豆茎叶、 第二棕榈饼粕、 第二麦麸、 第二苹果渣和 第二水的质量比为 10 ： 300 600 ： 150 300 ： 30 60 ： 15 30 ： 400 1000， 有利于得到 各项性能指标最好的饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0018 作为优选， 所述的发酵采用固态发酵， 微生物易生长， 酶活力高， 并且制备简单， 有 利于工业化推广利用。更进一步优选， 所述的固态发酵的条件为 ： 料厚度为 5cm 20cm， 自 然通风， 在 30 45发酵 2 7 天。该固态发酵条件有利于得到各项性能指标更为优异 的饲料用复合酶兼益生菌制剂。 进一步优选， 所述的固态发酵的条件为 ： 。
24、固态发酵的料厚度 为 10cm 15cm， 自然通风， 在 35 40发酵 4 5 天， 该固态发酵条件有利于得到各项 性能指标最优异的饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0019 饲料中的营养成分按照化学组成划分主要是碳水化合物 （如淀粉、 纤维素、 半纤 维素、 果胶质） 、 蛋白质、 杂环类及非典型糖等化合物 （如木质素、 alpha- 糖苷类、 植酸、 单宁 说 明 书 CN 103300215 B 5 4/8 页 6 等） 。在饲料中添加对这些化合物进行预消化或转化的酶， 对于提高畜禽生产性能具有显著 效应。目前， 纤维素酶、 半纤维素酶如木聚糖酶、 淀粉酶、 蛋白酶、 alpha- 半乳糖。
25、苷酶、 植酸 酶等都作为饲料用酶制剂在饲料生产中广泛使用， 并且在使用中通常组合多种酶成为复合 酶制剂进行添加。 复合酶制剂中所包含的酶种越多， 对饲料进行预消化或转化的效力越高。 本发明采用的菌群为普洱茶渥堆菌群与发酵基质中的天然菌群融合形成的微生态稳定的 食品级安全菌群， 微生物种类丰富， 能够发酵生产出种类非常丰富的饲料用复合酶， 对其功 效的评价通过对各有关酶活力的测定进行。 0020 益生菌通过调理肠道功能对提升动物健康水平具有显著功效。 乳酸菌是最主要的 益生菌。本发明采用的菌群中， 最主要的来源是普洱茶渥堆菌群， 其中含有大量乳酸菌， 这 些乳酸菌经过固态发酵大量增殖， 成为益生。
26、菌制剂， 对其功效的评价通过对乳酸菌数量的 测定进行。 0021 通过各有关酶活力的测定结果和乳酸菌数量的测定结果， 可知， 本发明制备的产 物非常适合作为饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0022 与现有技术相比， 本发明具有如下优点 ： 0023 本发明中， 生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方 法， 将经渥堆发酵的普洱熟茶、 香菇菌棒、 茶树菇菌棒与第一豌豆茎叶、 第一棕榈饼粕、 第一 麦麸、 第一苹果渣和第一水等基质混合后， 通过驯化培养， 使经渥堆发酵的普洱熟茶中的普 洱茶渥堆菌群与基质中的天然菌群融合形成微生态稳定的食品级安全菌群， 该微生态稳定 的食品级安全菌群既。
27、拥有普洱茶渥堆菌群的丰富而强大的产酶能力、 发酵转化能力和益生 功效， 又适应基质环境， 同时， 基质环境中含有丰富的来源于香菇菌棒和茶树菇菌棒的木质 纤维素酶类， 可对豌豆茎叶和棕榈饼粕进行低成本高效生物转化。用发酵剂内微生态稳定 的食品级安全菌群对豌豆茎叶和棕榈饼粕进行发酵， 将豌豆茎叶和棕榈饼粕转化为饲料用 复合酶兼益生菌制剂， 得到的饲料用复合酶兼益生菌制剂的各项性能指标较好。 0024 本发明中， 生物转化豌豆茎叶和棕榈饼粕制备饲料用复合酶兼益生菌制剂的方 法， 在发酵剂内微生态稳定的食品级安全菌群作用下， 发酵可采用固态发酵， 微生物易生 长， 酶活力高， 发酵过程粗放， 不需严格。
28、无菌条件， 后处理简便， 无废水排放， 设备构造简单、 投资少、 能耗低、 易操作， 易于工业化大规模生产， 具有良好的经济效益和广阔的应用前景。 具体实施方式 0025 实施例中的香菇菌棒和茶树菇菌棒均采用浙江天泉莫干山菇业有限公司生产的 市售产品， 豌豆茎叶从种植地自行采集， 棕榈饼粕采用南京市泓宇化工有限公司生产的市 售产品， 麦麸采用大丰市金麦缘麦仁厂生产的市售产品， 苹果渣采用万荣县双荣生态农牧 有限公司生产的市售产品。 0026 实施例 1 0027 1） 将 10kg 经渥堆发酵的普洱熟茶、 5kg 香菇菌棒、 5kg 茶树菇菌棒与 10kg 豌豆茎 叶、 5kg棕榈饼粕、 2k。
29、g麦麸、 1kg苹果渣、 22kg水充分混合， 在35驯化培养48小时后， 形成 发酵剂 ； 0028 2） 将步骤1） 中的发酵剂20kg与600kg豌豆茎叶、 300kg棕榈饼粕、 60kg麦麸、 30kg 苹果渣、 800kg水充分混合， 采用固态发酵， 料厚度为15cm， 自然通风， 在40发酵4天， 得到 说 明 书 CN 103300215 B 6 5/8 页 7 饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0029 经测定， 本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为 ： 羧甲基纤维素酶 活力达到 33.22IU/g ； 总纤维素酶活力达到 3.97IU/g ； beta- 葡萄糖苷酶活力达。
30、到 8.75IU/ g ； 葡聚糖内切酶活力达到 28.87IU/g ； 木聚糖酶活力达到 30.23IU/g ； beta- 木糖苷酶活力 达到 3.14IU/g ； 聚半乳糖醛酸酶活力达到 68.89IU/g ； 果胶酸酯裂解酶活力达到 65.24IU/ g ； 漆酶活力达到 71.24IU/g ； 甘露聚糖酶活力达到 27.70IU/g ； alpha- 半乳糖苷酶活力达 到 8.34IU/g ； alpha 淀粉酶活力达到 120.40IU/g ； 蛋白酶活力达到 98034IU/g ； 植酸酶活力 达到 92.06IU/g ； 单宁酶活力达到 1005IU/g ； 乳酸菌密度达到 2。
31、.71108CFU/g。 0030 实施例 2 0031 1） 将 10kg 经渥堆发酵的普洱熟茶、 5kg 香菇菌棒、 5kg 茶树菇菌棒与 10kg 豌豆茎 叶、 5kg棕榈饼粕、 2kg麦麸、 1kg苹果渣、 25kg水充分混合， 在35驯化培养48小时后， 形成 发酵剂 ； 0032 2） 将步骤1） 中的发酵剂20kg与600kg豌豆茎叶、 300kg棕榈饼粕、 60kg麦麸、 30kg 苹果渣、 800kg水充分混合， 采用固态发酵， 料厚度为15cm， 自然通风， 在40发酵4天， 得到 饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0033 经测定， 本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标。
32、为 ： 羧甲基纤维素酶 活力达到 32.47IU/g ； 总纤维素酶活力达到 3.89IU/g ； beta- 葡萄糖苷酶活力达到 8.68IU/ g ； 葡聚糖内切酶活力达到 28.78IU/g ； 木聚糖酶活力达到 30.35IU/g ； beta- 木糖苷酶活力 达到 3.07IU/g ； 聚半乳糖醛酸酶活力达到 68.76IU/g ； 果胶酸酯裂解酶活力达到 65.31IU/ g ； 漆酶活力达到 71.15IU/g ； 甘露聚糖酶活力达到 27.62IU/g ； alpha- 半乳糖苷酶活力达 到 8.24IU/g ； alpha 淀粉酶活力达到 119.56IU/g ； 蛋白酶活力。
33、达到 98126IU/g ； 植酸酶活力 达到 92.23IU/g ； 单宁酶活力达到 1015IU/g ； 乳酸菌密度达到 2.69108CFU/g。 0034 实施例 3 0035 1） 将 10kg 经渥堆发酵的普洱熟茶、 5kg 香菇菌棒、 5kg 茶树菇菌棒与 10kg 豌豆茎 叶、 5kg棕榈饼粕、 2kg麦麸、 1kg苹果渣、 25kg水充分混合， 在40驯化培养36小时后， 形成 发酵剂 ； 0036 2） 将步骤1） 中的发酵剂10kg与600kg豌豆茎叶、 300kg棕榈饼粕、 60kg麦麸、 30kg 苹果渣、 1000kg 水充分混合， 采用固态发酵， 料厚度为 10c。
34、m， 自然通风， 35发酵 5 天， 得到 饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0037 经测定， 本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为 ： 羧甲基纤维素酶 活力达到 34.25IU/g ； 总纤维素酶活力达到 4.17IU/g ； beta- 葡萄糖苷酶活力达到 8.68IU/ g ； 葡聚糖内切酶活力达到 27.04IU/g ； 木聚糖酶活力达到 33.20IU/g ； beta- 木糖苷酶活力 达到 3.29IU/g ； 聚半乳糖醛酸酶活力达到 67.73IU/g ； 果胶酸酯裂解酶活力达到 68.20IU/ g ； 漆酶活力达到 70.04IU/g ； 甘露聚糖酶活力达到 28.84。
35、IU/g ； alpha- 半乳糖苷酶活力达 到 8.50IU/g ； alpha 淀粉酶活力达到 117.93IU/g ； 蛋白酶活力达到 97536IU/g ； 植酸酶活力 达到 97.65IU/g ； 单宁酶活力达到 1093IU/g ； 乳酸菌密度达到 2.80108CFU/g。 0038 实施例 4 0039 1） 将 10kg 经渥堆发酵的普洱熟茶、 1kg 香菇菌棒、 1kg 茶树菇菌棒与 5kg 豌豆茎 叶、 2kg棕榈饼粕、 1kg麦麸、 0.5kg苹果渣、 10kg水充分混合， 在45驯化培养24小时后， 形 说 明 书 CN 103300215 B 7 6/8 页 8 成。
36、发酵剂 ； 0040 2） 将步骤1） 中的发酵剂20kg与200kg豌豆茎叶、 100kg棕榈饼粕、 20kg麦麸、 10kg 苹果渣、 200kg 水充分混合， 采用固态发酵， 料厚度为 5cm， 自然通风， 在 45发酵 2 天， 得到 饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0041 经测定， 本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为 ： 羧甲基纤维素酶 活力达到 30.12IU/g ； 总纤维素酶活力达到 3.66IU/g ； beta- 葡萄糖苷酶活力达到 8.01IU/ g ； 葡聚糖内切酶活力达到 28.61IU/g ； 木聚糖酶活力达到 29.81IU/g ； beta- 木糖苷酶。
37、活力 达到 2.75IU/g ； 聚半乳糖醛酸酶活力达到 62.77IU/g ； 果胶酸酯裂解酶活力达到 59.12IU/ g ； 漆酶活力达到 64.55IU/g ； 甘露聚糖酶活力达到 25.22IU/g ； alpha- 半乳糖苷酶活力达 到 7.63IU/g ； alpha 淀粉酶活力达到 110.12IU/g ； 蛋白酶活力达到 90135IU/g ； 植酸酶活力 达到 83.12IU/g ； 单宁酶活力达到 923IU/g ； 乳酸菌密度达到 2.45108CFU/g。 0042 实施例 5 0043 1） 将 10kg 经渥堆发酵的普洱熟茶、 10kg 香菇菌棒、 10kg 茶树。
38、菇菌棒与 15kg 豌豆 茎叶、 8kg棕榈饼粕、 4kg麦麸、 2kg苹果渣、 30kg水充分混合， 在30驯化培养60小时后， 形 成发酵剂 ； 0044 2） 将步骤 1） 中的发酵剂 10kg 与 800kg 豌豆茎叶、 500kg 棕榈饼粕、 100kg 麦麸、 60kg 苹果渣、 1500kg 水充分混合， 采用固态发酵， 料厚度为 20cm， 自然通风， 30发酵 7 天， 得到饲料用复合酶兼益生菌制剂。 0045 经测定， 本实施例的饲料用复合酶兼益生菌制剂的性能指标为 ： 羧甲基纤维素酶 活力达到 30.07IU/g ； 总纤维素酶活力达到 3.54IU/g ； beta- 。
39、葡萄糖苷酶活力达到 8.07IU/ g ； 葡聚糖内切酶活力达到 28.23IU/g ； 木聚糖酶活力达到 29.86IU/g ； beta- 木糖苷酶活力 达到 2.67IU/g ； 聚半乳糖醛酸酶活力达到 62.36IU/g ； 果胶酸酯裂解酶活力达到 59.46IU/ g ； 漆酶活力达到 64.62IU/g ； 甘露聚糖酶活力达到 25.34IU/g ； alpha- 半乳糖苷酶活力达 到 7.58IU/g ； alpha 淀粉酶活力达到 110.08IU/g ； 蛋白酶活力达到 90214IU/g ； 植酸酶活力 达到 82.03IU/g ； 单宁酶活力达到 908IU/g ； 乳酸。
40、菌密度达到 2.46108CFU/g。 0046 各种酶活力及乳酸菌密度测定方法如下 ： 0047 一、 羧甲基纤维素酶、 总纤维素酶和 beta- 葡萄糖苷酶的酶活力的测定 0048 总纤维素酶 （即滤纸纤维素酶 （FPase） 、 羧甲基纤维素酶 （CMCase） 、 beta 葡萄糖 苷酶活力的测定按照国际纯化学与应用化学联合会 （International Union of Pure and Applied Chemistry） 的规定程序进行 （详见 “Ghose TK,1987.Measurements of cellulase activities.Pure Appl Chem,。
41、59,257-268.” ） 。 0049 滤纸纤维素酶 （FPase） 活力单位 ： 以 Whatman No.1 滤纸 (1.06.0cm=50.0mg) 为 底物， 50下， 50mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH=4.8) 中反应 60min， 以每分钟释放 1mol 还原糖 为一个酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0050 羧甲基纤维素酶 （CMCase） 活力单位 ： 以 2%(w/v) 羧甲基纤维素为底物， 50下， 50mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH=5.5) 中反应 30min， 以每分钟释放 1mol 还原糖为一个酶活力 国际单位 （IU） ， 表示为 IU/。
42、g 干重。 0051 beta葡萄糖苷酶活力单位 ： 2mL醋酸盐缓冲液中加入1mL对硝基酚-葡萄糖苷 (p-nitrophenyl glucopyranoside,pNPG)(1mM) 作为底物， 50下反应 30min， 430nm 比色 说 明 书 CN 103300215 B 8 7/8 页 9 测定， 以每分钟释放1mol对硝基酚(p-nitrophenol)(pNP)为一个酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0052 二、 葡聚糖内切酶、 木聚糖酶、 beta- 木糖苷酶、 聚半乳糖醛酸酶和果胶酸酯裂解酶 的酶活力的测定 0053 葡聚糖内切酶、 木聚糖酶、 聚。
43、半乳糖醛酸酶和果胶酸酯裂解酶活力测定分别 以羧甲基纤维素、 桦木木聚糖酶、 聚半乳糖醛酸和果胶酸为底物， 具体按照有关文献 (Cheilas T,Stoupis T,Christakopoulos P,Katapodis P,Mamma D,Hatzinikolaou DG,Kekos D,Macris BJ,2000.Hemicellulolytic activity of Fusarium oxysporum grown on sugar beet pulp.Production of extracellular arabinanase.Process Biochem,35,557-561。
44、;Jayani RS,Saxena S,Gupta R,2005.Microbial pectinolytic enzymes:a review.Process Biochem,40,2931-2944.)。每分钟释放 1mol 还原糖为一个 酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0054 beta- 木 糖 苷 酶 活 力 测 定 以 硝 苯 基 糖 苷 （p-nitrophenyl glycoside）为 底 物，具 体 按 照 有 关 文 献 (Mamma D,Koullas D,Fountoukidis G,Kekos D,Macris BJ,Koukios E,19。
45、96.Bioethanol from sweet sorghum:Simultaneous saccharification and fermentation of carbohydrates by a mixed microbial culture.Process Biochem,31,377-381.)。 每分钟释放1mol p-nitrophenol为一个酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0055 三、 漆酶的酶活力的测定 0056 漆 酶 活 力 通 过 对 ABTS(2,2 -azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulf onic。
46、 acid) 的氧化而测定， 反应体系为柠檬酸钠缓冲液 （pH=3.0）中加入 100L 的 20mM ABTS 再 用 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 （pH=3.0）定 容 至 1mL， ABTS 氧 化 率 通 过 420nm 吸 收 值 而 确 定， 具 体 按 照 有 关 文 献 (Susan Grace Karp,Vincenza Faraco,Antonella Amore,Leila Birolo,Chiara Giangrande,Vanete Thomaz Soccol,Ashok Pandey,Carlos Ricardo Soccol.Characterization of。
47、 laccase isoforms produced by Pleurotus ostreatus in solid state fermentation of sugarcane bagasse.Bioresource Technology,2012,114,735-739.)。 每分钟氧化1mol ABTS为一个酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0057 四、 甘露聚糖酶的酶活力的测定 0058 甘露聚糖酶的活力测定以角豆胶为底物， 1g酶粉于40、 pH5.0条件下， 1min水解 角豆胶生成相当于 1mol 甘露糖还原物质， 即为 1 个酶活力单位， 表示为 IU。
48、/g 干重。 0059 五、 alpha- 半乳糖苷酶的酶活力的测定 0060 alpha- 半 乳 糖 苷 酶 活 力 测 定 体 系 为 “0.1mL 酶 液 +0.8mL0.2M 醋 酸 盐 缓 冲 液 (pH4.8)+0.1mL2mM pNPG” ， 50 反 应 15min 后，加 3mL0.2M Na2CO3终 止 反 应， 405nm 处测吸收值， 具体按照有关文献 (Dey PM,Pridham JB,1972.Biochemistry of alpha-galactosidase.Adv Enzymol,36,911-930.)。 每 分 钟 释 放 1mol 对 硝 基 酚。
49、 （paranitrophenol） 为一个酶活力国际单位 （IU） ， 表示为 IU/g 干重。 0061 六、 alpha- 淀粉酶的酶活力的测定 0062 alpha- 淀粉酶活力测定体系为 “150L 酶液 +200L0.2% 可溶性淀粉， 以 0.1M 说 明 书 CN 103300215 B 9 8/8 页 10 Tris-HCl 缓 冲 液 (pH=7.0) 为 溶 液 体 系” ， 37 反 应 30min 后， 加 400l3,5-dinitro salicylic acid 终止反应并沸水浴保持 5min， 冷却至室温 25后加 8mL 蒸馏水稀 释， 489nm 处 测 吸 收 值， 具 体 按 照 有 。