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1、(10)授权公告号 CN 103039696 B (45)授权公告日 2014.09.03 CN 103039696 B (21)申请号 201210440864.6 (22)申请日 2012.11.07 A23K 1/00(2006.01) A23K 1/14(2006.01) (73)专利权人 方希修 地址 225300 江苏省泰州市迎宾路 58 号 (72)发明人 方希修 王权 王冬梅 方圆 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11369 代理人 贺持缓 US 5201930 A,1993.04.13, CN 1168773 A,1997.12.31。
2、, JP 特开 2002-101826 A,2002.04.09, CN 101691546 A,2010.04.07, 杨春花等 . 海藻发酵饲料对樱桃谷肉鸭生长 性能的影响. 黑龙江畜牧兽医 .2012,(第4期), (54) 发明名称 一种海藻生物饲料及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种海藻发酵生物饲料制备方 法。 本发明采用放线菌、 酵母菌、 枯草芽孢杆菌、 干 酪乳杆菌和乳酸菌制备复合菌剂, 对海藻进行发 酵, 利用多种菌种之间的协同作用, 在产生大量的 纤维素酶类降解纤维的同时, 充分利用无机氮源 和有机氮源以及纤维分解产生的糖类合成菌体蛋 白, 本发明的海藻发酵生物饲料比。
3、海藻具有含量 更高的必需氨基酸, 营养价值更高, 动物吸收快, 日增重可提高 47%, 免疫力增强, 血清碱性磷酸酶 活性提高 15%, 丙氨酸转氨酶活性提高 6%, 养殖效 果作用更明显。且本发明的制备方法相比现有技 术还具有生产成本低、 周期短的特点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘晓娜 权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103039696 B CN 103039696 B 1/2 页 2 1. 一种海藻发酵生物饲料的制备方法, 其特。
4、征在于, 包括以下步骤 : 步骤一 生产菌种的制作 : 将筛选的放线菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌、 乳酸菌分别转接入装 有营养琼脂培养基的茄子瓶中, 在 35温度下培养 45 小时, 待茄子瓶表面菌苔布满, 并白 中带黄时即可取出, 然后放入 2 6的冰箱中进行保存 ; 营养琼脂培养基 : 牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g, NaCl5g, 琼脂 15 20g、 水 1000ml, pH7.0 7.2, 121灭菌 20min ; 有益菌株的液体培养 (1) 按以下重量称取各菌种 : 放线菌 15g、 枯草芽孢杆菌 45g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g ; (2) 放线菌的液体培养。
5、 挑取活化的放线菌的菌种接种于装有30ml种子培养基的100ml三角瓶中, 28, 180r/ min下培养24h作为活化的种子液, 再进行摇瓶培养, 进行第一次发酵, 取1ml种子液接入装 有 50ml 放线菌的发酵培养基的 250ml 三角瓶中, 28, 180r/min 条件下振荡培养 5 天, 将 放线菌的发酵培养基在 8000r/min 下离心 15min, 取上清液备用, 上清液即发酵液, 将第一 次发酵的发酵液按放线菌的发酵培养基的 5% 接种到放线菌的发酵培养基中, 混合均匀, 压 实、 密封发酵, 时间 3d ; 放线菌的发酵培养基的成分为 : 可溶性淀粉 2g、 硝酸钾 0。
6、.1g、 磷酸氢二钾 0.05g、 氯化 钠 0.05g、 硫酸镁 0.05g、 硫酸亚铁 0.001g、 琼脂 2g 以及水 1000ml, 放线菌的发酵培养基的 制备过程为 : 把淀粉放在烧杯里, 用5ml水调成糊状后, 倒入95mL水, 搅匀后加入其他物质, 使其他物质溶解, 在烧杯外做好记号, 加热到煮沸时加入琼脂, 不停搅拌, 待琼脂完全溶解 后, 补足失水, 调整 pH 值到 7.2 7.4, 分装后灭菌, 备用 ; (3) 枯草芽孢杆菌的液体培养 : 将称取的枯草芽孢杆菌的菌种按重量比 1 : 30 的比例接 种于 123、 45min 高温灭菌的枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵,。
7、 发酵时通气量维持在 1 : 1, 发酵时间 28h, 待 pH 值上升到 7.5 时停止发酵 ; 枯草芽孢杆菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 2g、 大豆粉 3g、 硫酸铵 0.7g、 玉米淀粉 5g、 糖蜜 14g, 磷酸二氢钾 0.8g, 磷酸二氢钠 2g、 硫酸镁 1g、 无菌水 67.5g, 其中, 枯草芽孢杆 菌的发酵培养基中加入 0.2% 吐温为产物促进剂 ; (4) 干酪乳杆菌的液体培养 将称取的干酪乳杆菌按重量比 1 : 30 比例接种于 123、 45min 高温灭菌的干酪乳杆菌 的发酵培养基中, 发酵时通气量维持在 1 : 1, 发酵时间 28 小时, 待 pH 值上升。
8、到 7.5 时停止 发酵, 干酪乳杆菌的发酵培养基的成分为 : 牛肉膏5g、 蛋白胨10g、 乳糖5g、 吐温80 (Tween80) 1g、 L- 半胱氨酸 0.1g、 H2O1000ml, pH7, 121, 灭菌 15min, 其中, 在干酪乳杆菌的发酵培养 基中添加 0.05% 0.2% 的植酸质作为产物促进剂 ;(5) 乳酸菌的液体培养 选择植物乳杆菌和干酪乳杆菌进行乳酸菌的液体培养, 将称取的植物乳杆菌和干酪乳 杆菌混合在一起进行复合培养, 将混合菌苔按重量比按 1 : 30 的比例接种于 123、 45min 高温灭菌的乳酸菌的发酵培养基中, 接种后液体在发酵罐中搅拌 30min。
9、, 发酵罐的转速为 220r/min, 搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置57天, 静置过程中每天测定发酵罐内 权 利 要 求 书 CN 103039696 B 2 2/2 页 3 的液体的pH值并释放产出的气体, 发酵过程中抽样3次, 显微镜下检测菌体生长情况, 当活 菌总数达到 20 亿 /ml 的浓度和 pH 值达到 3.0 4.0 时停止发酵 ; (6) 乳酸菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 6g、 大豆粉 3g、 硫酸钱 0.8g、 玉米淀粉 5g、 糖蜜 15g、 磷酸二氢钾 1g, 磷酸二氢钠 1.8g、 硫酸镁 1g 以及无菌水 66.4g, (7) 将上述放线菌、 枯草芽孢。
10、杆菌、 干酪乳杆菌和乳酸菌的菌液仍按放线菌 15g、 枯草芽 孢杆菌 45g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g 的比例混合, 得到复合菌液 ; 步骤二 海藻固体发酵培养基的制备 : 海藻粉碎, 过 20 60 目筛, 灭菌, 冷却待用 ; (1) 将复合菌液按重量比 1 : 30 的比例接入 123、 45min 高温灭菌的海藻固体发酵培 养基中, 在海藻固体发酵培养基中添加植酸质0.2%为产物促进剂, 搅拌35min至均匀, 倒入 50 70kg 消毒双层饲料袋中密封发酵, 温度 30 35, 时间 8 天 ; (2) 发酵过程中取样三次, 测定水分和 pH 值, 发酵结束后取样, 测。
11、定水分为 35 40%、 pH 值为 4.5 6.0 ; 步骤三干燥、 粉碎和包装 (1) 干燥 : 将步骤二发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥, 温度控制在 40, 时 间 15 小时, 干燥完成的物料水份控制在 12% ; (2) 粉碎 : 转入粉碎机进行粉碎, 物料温度控制在 45以下, 粉碎后的物料过 50 目筛 网, 筛后粗料重新粉碎 ; (3) 筛后装入带有内袋的桶或袋中, 扎紧袋口, 系好标识牌, 转入成品库有序堆放 : 取样 检测, 主要参数 : 水份12%、 活菌数2030亿/g、 总蛋白量16% : 物理性状 : 浅绿色粉末状固 体 ; (4) 计量打包 : 选用塑料模。
12、密闭包装 ; 每包重量为 25kg。 权 利 要 求 书 CN 103039696 B 3 1/9 页 4 一种海藻生物饲料及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种海藻发酵生物饲料的制备方法, 尤其涉及一种利用复合菌种为原 料制备海藻发酵生物饲料的方法。 背景技术 0002 海藻是一种生活在海洋里的含叶绿素或其他辅助色素的低等自养植物, 能进行光 合作用, 把海洋中的无机质转化为有机质。海藻类植物资源丰富, 种类繁多。目前发现的 海藻类植物约有 1 万多种, 可分为绿藻门、 褐藻门、 蓝藻门和红藻门等 10 个门类, 按形态分 为大型海藻和微藻两类, 其中, 大型海藻有褐藻中的海带、 。
13、裙带菜、 巨藻, 绿藻中的苔条、 石 药以及红藻中的紫菜、 石花菜等, 微藻是形态最小的单细胞海藻, 其直径只有几微米, 但贮 量巨大。海藻经过加工可制成海藻粉。海藻粉中淀粉含量达 25, 蛋白质含量 12 50, 并含有各种常量和微量元素, 特别富含维生素 A、 B1、 B2、 B6、 B12、 C、 烟酸、 叶酸和胡萝卜素。 海藻所含的微量元素和各种维生素的量远超过陆地植物, 海藻具有极高的营养又和保健功 效。 0003 同时, 海藻中含有海藻多糖、 甘露醇、 丙稀酸、 核苷类、 萜类、 大环内酯和生物碱等 生物活性物质。 近年来, 对大型海藻的生物活性物质的研究已引起广泛的兴趣, 并已开。
14、发出 紫菜多糖、 褐藻淀粉硫酸脂、 藻酸双脂钠 (PSS) 、 肾海康等多种海藻药物。海藻中的抗病、 抗 应激因子如丙烯酸、 萜烯类、 溴化酚类和某些含硫化合物等, 对许多病原菌 (如金黄色葡萄 菌、 大肠杆菌等) 均有抑制作用, 对提高水产动物的免疫力及对环境的适应能力、 耐低氧能 力有很大帮助。分布较广的多节泡叶藻 (Ascophyllum nodosum) 含有酚类物质, 具有广谱强 抗微生物作用。从漂浮马尾藻 (Sargassumnatans) 中萃取分离出的马尾藻素复合物能抑制 金色葡萄球菌、 大肠杆菌、 普通变形菌的生长。石莼 (Ul-valinza) 、 车网藻 (cystoph。
15、yllum hakodatense) 、 钝形凹顶藻 (laurenciaobtusa) 因含有溴酚化合物、 萜烯类等, 具有抗生素 的特性。 海藻中的抗菌物质不会使细菌产生抗药性, 对环境不会造成不良的影响, 在生产上 有一定的应用价值。 0004 从海藻中可分离出硫酸多糖。硫酸多糖能够与病毒结合形成非感染性的多糖 病毒复合物, 干扰病毒的吸附和透入过程 (Ehresmann 假说) 。Venkateswaran 等用海藻多 糖进行抗原 HBsA 和抗体 anti-HBs 结合的抑制试验。试验表明 : 在浓度 0.5% 时, 鹿角菜属 (Pelvetia fastigiata) 多糖的抑制率。
16、为 91%(2.2%) ; 墨角藻 (Fucus disticus) 硫酸酯 多聚糖的抑制率为 92.9% ; 卡拉胶 (、 、 ) 为 62%。在组织培养中, 硫酸多糖这类天然 聚阴离子性物质均不利于如小核糖核酸病毒、 粘病毒、 疱疹病毒等多种动物病毒的生长。 李 凡等从海带中提取褐藻糖胶, 试验发现, 这种多糖混合物可抗 RNA 病毒和 DNA 病毒。在石花 菜属和皱波角叉菜属的海藻中都发现有抗病毒活性的硫酸多糖存在。 0005 我国的海藻粉生产及应用还处于起步阶段。现在技术中, 海藻饲料的制备方法都 还存在着不足, 如生产成本高、 周期长、 养殖效果作用不明显等问题。 说 明 书 CN 。
17、103039696 B 4 2/9 页 5 发明内容 0006 本发明提供了一种利用多种菌种发酵海藻、 提高海藻发酵生物饲料的营养价值 的、 生产成本低、 周期短的海藻发酵生物饲料的制备方法。 0007 本发明的技术方案为 : 0008 一种海藻发酵生物饲料的制备方法, 包括以下步骤 : 0009 步骤一、 使用按重量计 1525 份放线菌、 15 25 份酵母菌、 30 45 份枯草芽孢杆 菌、 20 35 份干酪乳杆菌和 20 35 份乳酸菌中的两种或两种以上制备复合菌剂 ; 0010 步骤二、 使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻。 0011 优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法。
18、中, 所述复合菌剂的制备过程包 括以下步骤 :(1) 按照所述步骤一的重量比分别称取所选择的菌种, 并对各菌种单独进行 培养 ;(2) 按照与所述步骤 (1) 的比例, 将单独培养得到的各菌液混合。 0012 优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤二中, 使用所述步骤 一制备的复合菌剂发酵海藻, 通过以下过程实现 : 将海藻制备成海藻固体发酵培养基, 将复 合菌剂按 1:2530 的比例接种于海藻固体发酵培养基中发酵, 发酵温度为 3035, 发酵时 间为 810 天。 0013 优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 将复合菌剂接种于海藻固体 发酵培养基中, 还。
19、向海藻固体发酵培养基中添加0.05%0.2%的植酸质。 优选的是, 所述的 海藻发酵生物饲料的制备方法中, 复合菌剂发酵海藻固体发酵培养基的发酵产物的 pH 值 为 4.56.0, 水分的质量含量为 40%。优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法, 还包 括 : 步骤三、 将所述步骤二的发酵产物干燥, 干燥温度为 4045, 干燥时间为 1416h, 干燥 完成后发酵产物的水分在 12% 以下。优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所 述步骤 (1) 中, 放线菌的培养方法为 : 将放线菌的菌种培养成种子液, 将种子液接种于放线 菌发酵培养基中进行第一次发酵, 第一次发酵条件。
20、为在 2530下振荡培养 5 天, 将第一次 发酵的发酵液再接种于放线菌发酵培养基内进行第二次发酵。 0014 优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤 (1) 中, 枯草芽孢杆 菌的培养方法为 : 将枯草芽孢杆菌的菌种接种于枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵, 其中, 枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂, 干酪乳杆菌的培养方法为 : 将干酪乳杆 菌的菌种接种于干酪乳杆菌的发酵培养基中发酵, 其中, 干酪乳杆菌的发酵培养基中添加 有产物促进剂。 0015 优选的是, 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤 (1) 中, 乳酸菌的培 养方法为 : 将乳酸菌的菌种接种。
21、于乳酸菌的发酵培养基中发酵, 当检测到乳酸菌的发酵培 养基内的活菌总数达到20亿/ml, 且乳酸菌的发酵培养基内的液体的pH值达到34时停止 发酵。 0016 本发明具有以下有益效果 : 0017 (1) 本发明采用放线菌、 酵母菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌和乳酸菌制备复合菌 剂, 对海藻进行发酵, 利用多种菌种之间的协同作用, 在产生大量的纤维素酶类降解纤维的 同时, 充分利用无机氮源和有机氮源以及纤维分解产生的糖类合成菌体蛋白, 本发明的海 藻发酵生物饲料比海藻具有含量更高的必需氨基酸, 营养价值更高, 动物吸收快, 日增重可 提高 47%, 免疫力增强, 血清碱性磷酸酶活性提高 15。
22、%, 丙氨酸转氨酶活性提高 6%, 养殖效果 说 明 书 CN 103039696 B 5 3/9 页 6 作用更明显。 0018 (2) 本发明中复合菌剂的制备过程为对放线菌、 酵母菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆 菌和乳酸菌进行单独的液体培养, 再将培养完成的菌液混合后用于海藻的固体发酵, 上述 过程保证了菌种的高速生长, 有效控制生产周期, 降低生产成本, 固体发酵过程则使得代谢 产物完成保留。 0019 (3) 本发明的海藻发酵生物饲料所含的高浓度乳酸能显著提高水产动物的消化吸 收功能, 同时肽聚糖增加了水产动物对病原体的免疫能力。 0020 (4) 枯草芽孢杆菌和乳酸菌发酵海藻, 在产。
23、生多肽与氨基酸的同时, 能够提高纤维 素的分解, 提高了养殖动物对海藻发酵生物饲料的吸收和利用, 为养殖动物提供最佳的营 养生长条件。 0021 (5) 在复合菌剂发酵海藻的过程中, 向海藻固体发酵培养基中添加植酸质作为产 物促进剂, 大大提高发酵过程中酶活和产物的数量。 0022 (6) 利用混合菌种发酵海藻制备海藻发酵生物饲料, 提高了海藻的利用率, 降低了 生产成本, 同时使用常用的发酵及生产设备, 易于在动物养殖中推广。 0023 (7) 本发明采用农业部 658 公告允许添加的微生物菌种, 在养殖动物体内无有害 残留, 同时减少了抗生素在养殖中的使用量, 提供了一种安全、 绿色的生物。
24、饲料, 本发明的 海藻发酵生物饲料适用于禽畜、 宠物与水产动物等的养殖。 附图说明 0024 图 1 为本发明的海藻发酵生物饲料的制备方法的工艺流程图。 具体实施方式 0025 如图 1 所示, 本发明提供一种海藻发酵生物饲料的制备方法, 包括以下步骤 : 步骤 一、 使用按重量计 1525 份放线菌、 15 25 份酵母菌、 30 45 份枯草芽孢杆菌、 20 35 份 干酪乳杆菌和2035份乳酸菌中的两种或两种以上制备复合菌剂 ; 步骤二、 使用所述步骤 一制备的复合菌剂发酵海藻。 0026 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述复合菌剂的制备过程包括以下步 骤 :(1) 按照所述步骤。
25、一的重量比分别称取所选择的菌种, 并对各菌种单独进行培养 ;(2) 按照与所述步骤 (1) 的比例, 将单独培养得到的各菌液混合。 0027 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤二中, 使用所述步骤一制备的 复合菌剂发酵海藻, 通过以下过程实现 : 将海藻制备成海藻固体发酵培养基, 将复合菌剂按 1:2530 的比例接种于海藻固体发酵培养基中发酵, 发酵温度为 3035, 发酵时间为 810 天。 0028 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 将复合菌剂接种于海藻固体发酵培养基 中, 还向海藻固体发酵培养基中添加 0.05% 0.2% 的植酸质。 0029 所述的海藻发酵生物饲料的。
26、制备方法中, 复合菌剂发酵海藻固体发酵培养基的发 酵产物的 pH 值为 4.56.0, 水分的质量含量为 40%。 0030 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法, 还包括 : 步骤三、 将所述步骤二的发酵产物 干燥, 干燥温度为 4045, 干燥时间为 1416h, 干燥完成后发酵产物的水分在 12% 以下。 说 明 书 CN 103039696 B 6 4/9 页 7 0031 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤 (1) 中, 放线菌的培养方法为 : 将放线菌的菌种培养成种子液, 将种子液接种于放线菌发酵培养基中进行第一次发酵, 第 一次发酵条件为在 2530下振荡培养 5 天, 。
27、将第一次发酵的发酵液再接种于放线菌发酵 培养基内进行第二次发酵。 0032 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤 (1) 中, 枯草芽孢杆菌的培养方 法为 : 将枯草芽孢杆菌的菌种接种于枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵, 其中, 枯草芽孢杆 菌的发酵培养基中添加有产物促进剂, 干酪乳杆菌的培养方法为 : 将干酪乳杆菌的菌种接 种于干酪乳杆菌的发酵培养基中发酵, 其中, 干酪乳杆菌的发酵培养基中添加有产物促进 剂。 0033 所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中, 所述步骤 (1) 中, 乳酸菌的培养方法为 : 将乳酸菌的菌种接种于乳酸菌的发酵培养基中发酵, 当检测到乳酸菌的发酵培养基内的。
28、活 菌总数达到 20 亿 /ml, 且乳酸菌的发酵培养基内的液体的 pH 值达到 34 时停止发酵。 0034 我国微生物资源丰富, 用于工业发酵的微生物主要包括细菌、 放线菌、 酵母菌和霉 菌。 饲料工业常用的细菌包括枯草芽孢杆菌、 乳酸杆菌、 醋酸杆菌、 地衣芽孢杆菌、 纳豆芽孢 杆菌和蜡样芽孢杆菌等, 其适宜生长温度是 30 37, 适宜 pH 为 7.0 7.2 ; 常用的放线 菌适宜生长温度是 25 30, 适宜 pH 为 7.0 7.2 ; 常用的酵母菌包括啤酒酵母、 假丝酵 母和红酵母, 适宜的生长温度是 24 32, 适宜 pH 为 3.0 6.0 ; 常用的霉菌包括黑曲霉、 。
29、米曲霉、 白地霉和木霉, 其适宜的生长温度是2530, 适宜pH为3.06.0。 酵母或细菌 等单细胞菌类能够产生单细胞蛋白 (SPC) , 多细胞的丝状真菌类能够产生菌体蛋白 (MBP) 。 0035 本发明所使用的菌种均为通常认为是安全的可直接饲用的微生物菌种, 包括 酵母菌、 放线菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌、 乳酸菌。本发明中采用由江苏畜牧兽医 职业技术学院营养饲料研究所保存的放线菌 (Actinomycetes, 简写为 Am-1) 、 酵母菌 (Saccharomyces, 简写为 SC-2) 、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis, 简写为 BS-2) 、 干。
30、酪乳 杆菌 (Lactobacillus casei LC-15) 、 乳酸菌 (Lactobacillus, 简写为 LB-1) 。 0036 放线菌是一类具有线状结构的革兰氏阳性细菌, 在放线菌的生活周期中, 基生菌 丝逐步发育成气生菌丝, 并在气生菌丝上形成分生胞子。放线菌是一种能产生多种有益代 谢产物且具有很高经济价值的菌种, 如放线菌是产生抗生素活性物质最大的一类原核微生 物。到目前为止从放线菌的代谢产物中发现的具有生物活性的物质大约有 12000 种, 大约 占整个天然生物活性物质的 50% 左右。放线菌群具有较强的分解复杂含氮和不含氮有机物 的能力, 对自然界物质转化和土壤改良起。
31、着重要作用。 0037 饲用芽抱杆菌是一类好氧菌, 能在一定条件下产生芽抱, 具有耐高温, 耐酸碱和耐 压等特点。目前所用的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、 环状芽孢杆菌、 蜡 样芽孢杆菌以及东洋芽孢杆菌等有益的种类。它们的特点是可以产生大量的胞外酶 (蛋白 酶、 淀粉酶和半纤维素水解酶等) , 这些酶类可以促进饲料的消化和吸收, 提高饲料的利用 率, 从而促进动物生长。枯草芽孢杆菌生长环境多样, 可利用的营养物质种类十分丰富, 这 决定了其自身含有丰富的产酶系统, 具备生产多种酶的应用潜力。 研究资料表明, 枯草芽孢 杆菌能够产生蛋白酶、 淀粉酶、 纤维素酶、 葡聚糖酶、 植酸。
32、酶、 果胶酶和木聚糖酶 等十几种酶。 0038 乳酸菌是一类可以分解糖类产生乳酸的细菌的总称, 通常为厌氧或兼性厌氧生 说 明 书 CN 103039696 B 7 5/9 页 8 长, 缺点是大部分乳酸菌不耐高温, 经 80处理 5 分钟, 死亡率在 70% 80%, 所以在颗粒饲 料制备过程中损失率较大。但这类菌能耐酸, 在 pH 值为 3 到 4.5 时仍能生长, 对胃的酸性 环境有一定的耐受性, 在动物体内可以通过生物拮抗、 降低 pH 值来阻止和抑制致病菌的进 入和定植, 减少亚硝氨、 氨、 粪臭素等有害物质的产生, 维持肠道中正常的生态平衡。 乳酸菌 在动物肠道内繁殖可以产生多种抑。
33、制性化合物, 包括细菌素、 类细菌素类物质以及各种对 抗性物质, 如过氧化氢和某些有机酸等。保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌, 均为乳杆菌属, 厌 氧和兼性厌氧, 耐酸, 最适 pH 通常是 5.5 5.8 或更低些。干酪乳杆菌发酵核糖成乳酸和 乙酸, 不产生 CO2。 0039 典型的酵母菌是单细胞真菌, 具有氧化和发酵两种代谢方式, 能特征性发酵一系 列碳水化合物, 以出芽方式进行无性繁殖。酵母指以碳水化合物 (淀粉、 糖蜜, 以及味精、 造 纸、 酒精等高浓度有机废液) 为主要原料, 经液态通风培养酵母菌, 并从其发酵醪中分离酵 母菌体 (不添加其它物质) , 酵母菌体经干燥后制得的产品。酵母。
34、所含有的营养物质极为丰 富。其中, 蛋白质含量可高达 40% 80%, 比大豆高 10% 20%, 比肉、 鱼、 奶酪高 20% 以上 ; 氨基酸的组成较为齐全, 含有人体必需的 8 种氨基酸, 尤其是谷物中含量较少的赖氨酸。 0040 由于枯草芽孢杆菌是产芽孢菌, 后期发酵液体呈碱性, 而两种乳酸菌是典型的酸 性培养细菌, 所以直接复合培养有很大的难度, 因此本发明对各菌种进行单独的液体培养, 然后再将培养后的菌种混合后进行海藻固体发酵培养基的固体发酵, 既保证了各菌种活菌 数量, 保证各菌种具有高速的生产速度, 又在固体发酵过程中最大程度的保留代谢产物, 保 证了海藻发酵生物饲料的应用效果。
35、。 0041 实施例一 0042 步骤一 0043 生产菌种的制作 : 将筛选的放线菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌、 乳酸菌分别转接 入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中, 将酵母菌转接入酵母膏麦芽汁琼脂作培养基的茄子瓶 中, 在 35温度下培养 45 小时, 待茄子瓶表面菌苔布满, 并白中带黄时即可取出, 然后放入 2 6的冰箱中进行保存 ; 0044 营养琼脂培养基 : 牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g, NaCl5g, 琼脂 15 20g、 水 1000ml, PH7.0 7.2。121灭菌 20min。 0045 淀粉培养基 : 蛋白胨 10g、 NaC15g、 牛肉膏 5g、 可溶性淀粉 。
36、2g、 蒸馏水、 琼脂 15 20g, 121灭菌 20min。 0046 有益菌株的液体培养 : 0047 (1) 按以下重量百分比例称取各菌种 : 放线菌 15g、 酵母菌 15g、 枯草芽孢杆菌 30g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g。 0048 (2) 放线菌的液体培养 0049 挑取活化的放线菌的菌种接种于装有 30ml 种子培养基的 100ml 三角瓶中, 28, 180r/min 下培养 24h 作为活化的种子液。再进行摇瓶培养, 进行第一次发酵, 取 1ml 种子 液接入装有 50ml 放线菌的发酵培养基的 250ml 三角瓶中, 28, 180r/min 条件下振荡培。
37、养 5 天。将放线菌的发酵培养基在 8000r/min 下离心 15min, 取上清液备用, 上清液即发酵液。 将第一次发酵的发酵液按放线菌发酵培养基的 5% 接种到放线菌发酵培养基中, 混合均匀, 压实、 密封发酵, 时间 3d。 说 明 书 CN 103039696 B 8 6/9 页 9 0050 放线菌的发酵培养基的成分为 : 可溶性淀粉 2g、 硝酸钾 0.1g、 磷酸氢二钾 0.05g、 氯化钠 0.05g、 硫酸镁 0.05g、 硫酸亚铁 0.001g、 琼脂 2g 以及水 1000ml。放线菌的发酵培养 基的制备过程为 : 把淀粉放在烧杯里, 用 5ml 水调成糊状后, 倒入 。
38、95mL 水, 搅匀后加入其他 物质, 使其他物质溶解。 在烧杯外做好记号, 加热到煮沸时加入琼脂, 不停搅拌, 待琼脂完全 溶解后, 补足失水。调整 pH 值到 7.2 7.4, 分装后灭菌, 备用。 0051 (3) 酵母菌的液体培养 0052 将酵母菌的菌种接种于酵母菌发酵培养基中发酵。 0053 酵母菌的发酵培养基的成分为 : 蔗糖 3g、 NaNO30.3g、 K2HPO40.1g、 KCl0.05g、 MgSO4 7H2O0.05g、 FeSO40.001g、 琼脂1.52g以及蒸馏水100ml, pH7.07.2, 灭菌20min。 0054 (4) 枯草芽孢杆菌的液体培养 00。
39、55 将称取的枯草芽孢杆菌的菌种按重量比 1 : 25 的比例接种于 121、 30min 高温灭 菌的枯草芽孢杆菌的发酵培养基中, 发酵时通气量维持在 1 : 1, 发酵时间 28h, 待 PH 值上升 到 7.5 时停止发酵。 0056 枯草芽孢杆菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 2g、 大豆粉 1.5g、 硫酸铵 0.5g、 玉米 淀粉3g、 糖蜜10g、 磷酸二氢钾0.2g、 磷酸二氢钠0.3g、 磷酸镁0.1g以及无菌水82.4g, 其中 还添加 0.05% 0.2% 的植酸质作为产物促进剂。 0057 (5) 干酪乳杆菌的液体培养 0058 将称取的干酪乳杆菌按重量比 1 : 3。
40、0 比例接种于 123、 45min 高温灭菌的干酪乳 杆菌的发酵培养基中, 发酵时通气量维持在 1 : 1, 发酵时间 28 小时, 待 PH 值上升到 7.5 时 停止发酵。 0059 干酪乳杆菌的发酵培养基的成分为 : 牛肉膏 5g、 蛋白胨 10g、 乳糖 5g、 吐温 80 (Tween80) 1g、 L- 半胱氨酸 0.1g、 H2O1000ml, pH7, 121, 灭菌 15min。其中, 在干酪乳杆菌 的发酵培养基中添加 0.05% 0.2% 的植酸质作为产物促进剂。 0060 (6) 乳酸菌的液体培养 0061 本实施例中选择植物乳杆菌和干酪乳杆菌进行乳酸菌的液体培养。 将。
41、称取的植物 乳杆菌和干酪乳杆菌混合在一起进行复合培养。将混合菌苔按重量比 1 : 25 的比例接种于 12l、 30min 高温灭菌的乳酸菌的发酵培养基中, 接种后液体在发酵罐中搅拌 30min, 发酵 罐的转速为220r/min, 搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置57天, 静置过程中每天测 定发酵罐内的液体的 PH 值并释放产出的气体。发酵过程中抽样 3 次, 显微镜下检测菌体生 长情况, 当活菌总数达到 20 亿 /ml 的浓度和 PH 值达到 3.0 4.0 时停止发酵。 0062 乳酸菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 3g、 大豆粉 1g、 硫酸按 0.3g、 玉米淀粉 2g、 糖。
42、蜜 10g、 磷酸二氢钾 0.2g、 磷酸二氢钠 0.3g、 磷酸镁 0.2g 以及水 83g。 0063 (7) 将上述放线菌、 酵母菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌和乳酸菌的菌液仍按放线 菌 15g、 酵母菌 15g、 枯草芽孢杆菌 30g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g 的比例混合, 得到复合 菌液。 0064 步骤二海藻发酵生物饲料的制备 0065 海藻固体发酵培养基的制备 : 海藻粉碎, 过 20 60 目筛, 灭菌, 冷却待用。 0066 (1) 将复合菌液按重量比 1 : 25 的比例接入 121、 30min 高温灭菌的海藻固体发 酵培养基中, 在海藻固体发酵培养基中添。
43、加植酸质0.2%为产物促进剂, 搅拌35min至均匀, 说 明 书 CN 103039696 B 9 7/9 页 10 倒入 50 70kg 消毒双层饲料袋中密封发酵, 温度 30 35, 时间 8 天。 0067 (2) 发酵过程中取样三次, 测定水分和 PH 值, 发酵结束后取样, 测定水分为 35 40%、 PH 值为 4.5 6.0 ; 0068 步骤三干燥、 粉碎和包装 0069 (1) 干燥 : 将步骤二的发酵产物放入培养箱干燥, 温度控制在 40, 时间 15 小时, 干燥完成的物料水份控制在 12% ; 0070 (2) 粉碎 : 转入粉碎机进行粉碎, 物料温度控制在 45以下。
44、, 粉碎后的物料过 50 目 筛网, 筛后粗料重新粉碎 ; 0071 (3) 筛后装入带有内袋的桶或袋中, 扎紧袋口, 系好标识牌, 转入成品库有序堆放 : 取样检测, 主要参数 : 水份12%、 活菌数2030亿/g、 总蛋白量16% ; 物理性状 : 浅绿色粉末 状固体。 0072 (4) 计量打包 : 选用塑料模密闭包装 ; 每包重量为 25kg。 0073 实施例二 0074 步骤一 0075 生产菌种的制作 : 将筛选的放线菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌、 乳酸菌分别转接 入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中, 在 35温度下培养 45 小时, 待茄子瓶表面菌苔布满, 并白中带黄时即可取。
45、出, 然后放入 2 6的冰箱中进行保存 ; 0076 营养琼脂培养基 : 牛肉膏 3g、 蛋白胨 10g, NaCl5g, 琼脂 15 20g、 水 1000ml, PH7.0 7.2。121灭菌 20min。 0077 淀粉培养基 : 蛋白胨 10g、 NaC15g、 牛肉膏 5g、 可溶性淀粉 2g、 蒸馏水、 琼脂 15 20g, 121灭菌 20min。 0078 有益菌株的液体培养 0079 (1) 按以下重量百分比称取各菌种 : 放线菌 15g、 枯草芽孢杆菌 45g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g。 0080 (2) 放线菌的液体培养 0081 同实施例一 0082 (3。
46、) 枯草芽孢杆菌的液体培养 : 将称取的枯草芽孢杆菌的菌种按重量比 1 : 30 的比 例接种于 123、 45min 高温灭菌的液体培养基中发酵, 发酵时通气量维持在 1 : 1, 发酵时间 28h, 待 PH 值上升到 7.5 时停止发酵。 0083 枯草芽孢杆菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 2g、 大豆粉 3g、 硫酸铵 0.7g、 玉米淀 粉 5g、 糖蜜 14g, 磷酸二氢钾 0.8g, 磷酸二氢钠 2g、 硫酸镁 1g、 无菌水 67.5g。其中, 枯草芽 孢杆菌的发酵培养基中加入 0.2% 吐温为产物促进剂。 0084 (4) 干酪乳杆菌的液体培养 0085 同实施例一 00。
47、86 (5) 乳酸菌的液体培养 0087 本实施例中选择植物乳杆菌和干酪乳杆菌进行乳酸菌的液体培养。 将称取的植物 乳杆菌和干酪乳杆菌混合在一起进行复合培养。将混合菌苔按重量比按 1 : 30 的比例接种 于 123、 45min 高温灭菌的乳酸菌的发酵培养基中, 接种后液体在发酵罐中搅拌 30min, 发 酵罐的转速为220r/min, 搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置57天, 静置过程中每天 说 明 书 CN 103039696 B 10 8/9 页 11 测定发酵罐内的液体的 PH 值并释放产出的气体。发酵过程中抽样 3 次, 显微镜下检测菌体 生长情况, 当活菌总数达到 20 亿 /。
48、ml 的浓度和 PH 值达到 3.0 4.0 时停止发酵。 0088 (6) 乳酸菌的发酵培养基的成分为 : 豆粕粉 6g、 大豆粉 3g、 硫酸钱 0.8g、 玉米淀粉 5g、 糖蜜 15g、 磷酸二氢钾 1g, 磷酸二氢钠 1.8g、 硫酸镁 1g 以及无菌水 66.4g。 0089 (7) 将上述放线菌、 枯草芽孢杆菌、 干酪乳杆菌和乳酸菌的菌液仍按放线菌 15g、 枯 草芽孢杆菌 45g、 干酪乳杆菌 20g、 乳酸菌 20g 的比例混合, 得到复合菌液。 0090 步骤二 0091 海藻固体发酵培养基的制备 : 海藻粉碎, 过 20 60 目筛, 灭菌, 冷却待用。 0092 (1) 将复合菌液按重量比 1 : 30 的比例接入 123、 45min 高温灭菌的海藻固体发 酵培养基中, 在海藻固体发酵培养基中添加植酸质0.2%为产物促进剂, 搅拌35min至均匀, 倒入 50 70kg 消毒双层饲料袋中密封发酵, 温度 30 35, 时间 8 天 ; 0093 (2) 同实施例一 ; 0094 步骤三干燥、 粉碎和包装 0095 (1)干燥 : 将步骤 4 发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥, 。