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1、10申请公布号CN104212810A43申请公布日20141217CN104212810A21申请号201410472571522申请日20140917C12N15/12200601C07K14/4720060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号72发明人王建民刘冠卿晁天乐张赛赛孙艳纪志宾王桂芝刘昭华候磊54发明名称一种调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因及其应用57摘要本发明属于生物技术领域，特别提供了一种可以调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因CDNA序列及其克隆方法，该基因的CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示；应用。
2、该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，对养羊业生产具有较高的指导意义。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表6页附图2页10申请公布号CN104212810ACN104212810A1/1页21一种调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因，其特征在于其CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的FSTL1基因，其特征在于其来源于绵羊的卵泡抑素样蛋白1基因。3根据权利要求1所述的调控脂肪生长的F。
3、STL1基因，在绵羊育种中的应用。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于通过调控FSTL1基因的表达，为培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种提供科学依据。权利要求书CN104212810A1/8页3一种调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因及其应用技术领域0001本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因及其在绵羊育种中的应用。背景技术0002羊肉肉质细嫩，脂肪和胆固醇含量低，逐渐受到人们的青睐。随着羊肉价格的逐渐盘升，提高羊只生长速度、改善羊肉品质对提高动物生产者的经济效益、满足广大消费者对优质羊肉的需求具有重大意义。0003FSTL1FOLLI。
4、STATINLIKE1，又名TSC36，FRP卵泡抑素样蛋白1，它最初是在研究TGF1作用机制时从小鼠成骨细胞系中分离获得，同源性分析属于SPARC蛋白家族，拥有EC结构域和FS结构域，为细胞外糖蛋白SHIBANUMAETAL,1993。FSTL1基因在脂肪生长发育过程中起作用，研究表明，前脂肪细胞能够表达FSTL1基因，FSTL1表达下调可能是前脂肪细胞转换为脂肪细胞的重要特征WUYETAL,2010。因而认为该基因可能具有调节前脂肪细胞转化、促进脂肪细胞生成的功能。另有研究报道，发现FSTL1在早期肌肉发生中起作用尤其是胚胎期，具体可能对肌生成调节因子如MYOD1起拮抗作用MCCARTHY。
5、JJETAL,2008；FSTL1也可能具有抑制血管平滑肌细胞的迁移与分化的作用，过表达FSTL1基因刺激血管重建和抑制心血管细胞的凋亡OUCHINETAL,2008。因此，在生产实践过程中，通过调控FSTL1基因的表达能够调节小尾寒羊骨骼肌中的脂肪含量，从而达到改善小尾寒羊肉品质的重要意义，也可以指导分子育种，应用于培育生长速度快、肉质品质好的绵羊新品种。0004目前，关于FSTL1基因对脂肪生长和发育的调控还不清楚值，得深入研究。尚未见到有关小尾寒羊FSTL1基因克隆和功能的研究报道。发明内容0005基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊脂肪生长的FSTL1基因，其CDNA序列如。
6、SEQIDNO1所示，全长3617BP；该序列中的开放阅读框编码氨基酸序列如SEQIDNO2所示，共编码307个氨基酸；该基因具有调控脂肪生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊品种奠定基础，对养羊业生产有较高的现实意义。0006本发明所提供的调控脂肪生长的FSTL1基因，CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，FSTL1的CDNA序列长3617BP，该序列中的开放阅读框编码307个氨基酸。0007上述的FSTL1基因是通过如下方法获得的00081小尾寒羊脂肪总RNA的提取和反转录0009采用TRIZO。
7、L法提取小尾寒羊脂肪组织总RNA，提取的总RNA用核酸蛋白分析仪进行检测，要求总RNA吸光度OD260/280在18至20之间，并根据现有技术采用TAKARA公说明书CN104212810A2/8页4司的RRIMESCRIPTTMRTREAGENTKIT试剂盒反转录合成CDNA第一链；00102FSTL1基因CDNA序列保守区的扩增0011比对已有物种FSTL1基因的CDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤1中的CDNA第一链为模板进行PCR扩增，克隆测序得到保守区序列；00123应用降落巢式PCR法对FSTL1基因CDNA序列的3端进行扩增0013根据步骤2所得保守区序列设计FSTL1。
8、基因的3特异性内侧和外侧引物；0014以步骤1中提取的总RNA为模板，以OLIGODTAP为引物，反转录获得CDNA第一链模板；0015以3特异性外侧引物和3通用外侧引物采用降落PCR法以步骤3中CDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；0016以3特异性内侧引物和3通用内侧引物采用同样降落PCR法，以第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增；0017对第二轮PCR产物经克隆测序得到FSTL1基因CDNA序列的3端序列；00184应用RACE法对FSTL1基因CDNA序列的5端进行扩增0019以步骤1中提取的总RNA为模板依次进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、接头序列连接反应并以TAKA。
9、RA公司的5FULLRACEKITWITHTAP试剂盒反转录合成CDNA的第一链；0020根据步骤2所得保守区序列设计FSTL1基因的5特异性内侧和外侧引物；0021以5特异性外侧和5通用外侧引物，以步骤4中得到的CDNA第一链为模板进行第一轮PCR扩增；0022以5特异性内侧和5通用内侧引物，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；0023对第二轮PCR产物经克隆测序得到FSTL1基因CDNA序列的5端序列；00245全长序列拼接及克隆测序验证0025根据重叠区域对上述步骤获得的CDNA的保守区、5和3所得序列进行拼接，获得FSTL1基因的全长CDNA序列，获得了FSTL1的CD。
10、NA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0026之后发明人利用QRTPCR法测定FSTL1基因CDNA序列在小尾寒羊心、肝、肌肉等组织间的表达量，并最终发现FSTL1在肺、脂肪和血管中的表达量均显著高于其他组织P005，表明该基因具有调控脂肪生长发育的功能。通过调控FSTL1基因的表达能够调节小尾寒羊骨骼肌中的脂肪含量，从而达到改善小尾寒羊肉品质的作用。0027综上所述，本发明提供了一种可以调控脂肪生长的FSTL1基因，该基因具有调控脂肪生长发育的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，实现培育生长速度快、肌肉品质好的绵羊新品种奠定基础，具有较高的。
11、现实意义。附图说明0028图1为本发明中小尾寒羊FSTL1基因CDNA保守区一扩增图，0029图中M为DL2000分子量标准；1为FSTL1基因保守区一序列；0030图2为本发明中小尾寒羊FSTL1基因CDNA保守区二扩增图，说明书CN104212810A3/8页50031图中M为DL2000分子量标准；1为FSTL1基因保守区二序列；0032图3为本发明中小尾寒羊FSTL1基因3端扩增图，0033图中M为DL2000分子量标准；1为FSTL1基因3端序列；0034图4为本发明中小尾寒羊FSTL1基因5RACE扩增图，0035图中M为DL2000分子量标准；1为FSTL1基因5端序列；0036。
12、图5为本发明中FSTL1基因MRNA在小尾寒羊不同组织表达水平柱状图，0037图中A、B、C表示小尾寒羊各组织间的差异显著性P005；由图可见FSTL1主要在肺、脂肪和血管中表达。具体实施方式0038以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。0039下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条件或常规方法，如SAMBROOK等编著的分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,1989中所述的条件。0040实施例1脂肪组织总RNA的提取及反转录0。
13、041取小尾寒羊皮下脂肪2G，使用TIANGEN公司的RNASIMPLETOTALRNAKIT总RNA提取试剂盒CATDP419提取组织的总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行；将提取的RNA采用TAKARA公司的RRIMESCRIPTTMRTREAGENTKITCATRR037A反转录合成CDNA第一链，20保存备用。0042实施例2CDNA保守区序列的克隆与测序00431引物的设计从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种FSTL1基因的CDNA序列，以DNAMAN60软件进行比对获得保守区序列，设计该基因CDNA的保守区两对引物为0044上游引物F1GGACTCTGCGTTGATGCTC，如S。
14、EQIDNO3所示；0045上游引物F2GCTACAACCGCCAAATCAC，如SEQIDNO4所示；0046下游引物R1TAGCCAGCCATCCCCATT，如SEQIDNO5所示；0047下游引物R2CCCTCTGGTGGTCTGTAATCG，如SEQIDNO6所示。00482PCR扩增以实施例1获得的CDNA第一链为模板，应用TIANGEN的PCRMASTERMIXKT201体系进行PCR扩增，具体如下00490050保守区一PCR扩增条件是943MIN；9430SEC，5630SEC，7230SEC35CYCLES；7210MIN；4；保守区二PCR扩增条件是943MIN；9430S。
15、EC，5630SEC，7215MIN35CYCLES；7210MIN；4。获得保守区序列，扩增结果见附图1、说明书CN104212810A4/8页62；为验证获得的条带是否是保守区目标序列进行如下步骤37；00513扩增条带胶回收PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳后，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR胶回收产物进行纯化回收；00524连接PMD18T载体与步骤3中回收产物的摩尔比控制在1318；依TAKARA公司PMD18T载体试剂盒说明书NO6011进行连接反应；00535连接产物转化取5L连接产物，依TIANGEN公司大肠杆菌感受态细胞DH5CB101使用说。
16、明进行转化及细菌的培养操作；00546菌液PCR鉴定吸取1L菌液作模板，依据2中PCR扩增条件进行扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；00557克隆产物测序分析吸取1ML步骤6中获得的阳性菌液送SANGONBIOTECH公司测序分析，经测序得到序列长为522BP的CDNA保守区一目标序列和序列长为1597BP的CDNA保守区二目标序列。0056实施例3CDNA3端序列的克隆与测序0057采用降落巢式PCR法克隆CDNA序列的3端，具体步骤如下00581引物的设计与合成根据实施例2所得FSTL1基因CDNA保守区的测序结果，设计两条上游嵌套式引物，3GSPGCCTTAGTTTCCTCAGTG，如。
17、SEQIDNO7所示，和3NGSPCAGGTCGTGCTATGATGTAG，如SEQIDNO8所示；并合成两条下游3通用引物，3UPGACTCGAGTCGATCGA，如SEQIDNO9所示，和OLIGODTAPGACTCGAGTCGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQIDNO10所示；00592反转录合成CDNA第一链取4L实施例1中提取的总RNA，利用实施例1中反转录试剂盒，加入OLIGODTAP为引物反转录合成CDNA第一链；00603外侧PCR扩增以3GSP和3UP为上下游引物，以步骤2中的CDNA第一链为模板，依TAKARA公司HSDNAPOLYMERASEPCR反。
18、应试剂盒NOR010A体系进行，具体如下00610062降落PCR扩增条件9830S；9810S，7030S，7215MIN3CYCLES；9810S，6830S，7215MIN4CYCLES；9810S，6630S，7215MIN5CYCLES；9810S，6430S，7215MIN6CYCLES；9810S，6230S，7215MIN8CYCLES；9810S，6030S，7215MIN10CYCLES；7210MIN；4；00634内侧PCR扩增以3NGSP和3UP为上下游引物，步骤3的扩增产物为模板，依上述步骤3中反应条件和扩增程序进行PCR扩增，得到3端目标序列，扩增结果见附图3；说。
19、明书CN104212810A5/8页700645扩增条带胶回收PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳后，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR胶回收产物进行纯化回收；00656连接PJET12载体与步骤5中回收产物的摩尔比控制在1318；依THERMOSCIENTICFERMENTAS公司CLONEJETTMPCRCLONINGKIT试剂盒说明书进行连接反应。00667连接产物转化取5L连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞DH5CB101使用说明进行转化及细菌的培养操作；00678菌液PCR鉴定吸取1L菌液作模板，依据步骤3中PCR扩增条件进行扩增，1琼脂。
20、糖凝胶电泳检测目的条带；00689PCR产物的克隆测序吸取1ML步骤8中获得的阳性菌液送SANGONBIOTECH公司测序分析，经测序得到序列长为1377BP的CDNA3端目标序列。0069实施例4CDNA5端序列的克隆与测序0070采用RACE法克隆5端序列，步骤如下00711引物的设计与合成根据实施例2所得FSTL1基因CDNA保守区的测序结果，设计两条下游嵌套式引物，5GSPTCCTAGCCAGCCATCCCCAT，如SEQIDNO11所示，和5NGSPAGTCATTTCCTCCTCTGCCTG，如SEQIDNO12所示；并合成两条上游5通用引物，5OUTERPRIMERCATGGCTA。
21、CATGCTGACAGCCTA，如SEQIDNO13所示，和5INNERPRIMERCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如SEQIDNO14所示；00722去磷酸化处理0073配制去磷酸反应液00740075混匀，50反应1H；0076加入20LCH3COONA3MOL/L，PH52，然后加入130L的RNASEFREEDDH2O后轻轻混匀。随后加入200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0077加入02ML氯仿，吹打混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0078加入2LNACARRIER后均匀混匀，。
22、再加入02ML异丙醇，混匀后冰上冷却10MIN，随后13000G4离心20MIN，弃上清；0079加入500L的预冷的70乙醇进行漂洗，13000G4离心5MIN，弃上清后，室温放置2MIN充分干燥；加入7LRNASEFREEDDH2O溶解沉淀，得到CIAPTREATEDRNA。00803“去帽子”反应0081配制“去帽子”反应液0082说明书CN104212810A6/8页80083将上述试剂混匀，37，反应1H，得到CIAP/TAPTREATED的RNA。008445RACE接头的连接0085依下表配制溶液0086008765保温5MIN后，放置2MIN冰上，然后加入下述试剂0088008。
23、916，反应1H；0090加入20L的CH3COONA3MOL/L，PH52于以上反应液中，然后加入140L的RNASEFREEDH2O，再加200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，吹打混匀后于室温、13000G离心5MIN；0091取出上层水相，加入200L氯仿，充分混匀后于13000G离心5MIN，取上层水相加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加入200L异丙醇，混匀后于冰上冷却10MIN；009213000G4离心20MIN，弃上清。加入500L预冷的70乙醇漂洗，13000G4离心5MIN，弃上清后干燥；0093加入6LRNASEFREEDDH2O溶解沉淀，得到LIGATEDRNA。。
24、00945反转录合成CDNA第一链0095反转录体系为0096说明书CN104212810A7/8页90097混匀后3010MIN；421H；7015MIN，生成反转录产物，20保存备用。00986外侧PCR扩增以5OUTERPRIMER和5GSP为上下游引物，以5中反转录合成的CDNA第一链为模板，扩增体系为00990100扩增程序为943MIN；9430S，5530S，721MIN20CYCLES；7210MIN；4；01017内侧PCR扩增以外侧PCR产物为模板，扩增体系为01020103扩增程序为943MIN；9430S，5530S，721MIN30CYCLES；7210MIN；4。反。
25、应结束后，取5LPCR反应液进行电泳检测，扩增结果见附图4。01048PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物转化及测序同实施例2，经测序得到长为928BP的CDNA5端目标序列。0105实施例5全长CDNA序列的拼接与克隆测序0106根据重叠区域对实施例2、3和4中所得序列采用DNAMAN60软件进行拼接，获得FSTL1基因的CDNA全长序列；序列全长为3617BP，序列见SEQIDNO1。说明书CN104212810A8/8页100107实施例6CDNA编码蛋白的氨基酸序列分析0108登录HTTP/GENESMITEDU/GENSCANHTML分析FSTL1的CDNA序列，。
26、确定编码蛋白的氨基酸序列。FSTL1的编码区编码307个氨基酸，具有如SEQIDNO2所述的氨基酸序列。0109实施例7小尾寒羊各组织中FSTL1基因的表达分析01101小尾寒羊组织采集选取小尾寒羊周岁母羊三只，分别取心、肝、肾、肺、背最长肌、脂肪和血管组织23G，立即投入液氮保存备用。01112组织RNA的提取及反转录取步骤1各种组织200MG，总RNA提取及反转录合成CDNA第一链方法同实施例1。01123设计引物说明根据实施例5中的全长CDNA序列设计荧光定量引物，引物扩增片段长度为80200BP，引物序列如下011301144QRTPCR反应以GAPDH为内参基因，依照TAKARA公司。
27、的PREMIXEXTAQTMDRR081A说明书加样，反应体系为15L，具体成份如下01150116将上述试剂混匀，所有反应重复三份，采用SYBRGREENI染料法在MX3000P荧光定量仪上以两步法进行PCR扩增9510MIN；40CYCLES9530S，6030S，7220S。01175结果的分析统计反应结果经MX3000P配套软件对所得CT值进行初步分析。每个基因表达的相对值根据标准曲线运用2CT法进行计算，基因的表达水平表示为2CTSE。用SAS92软件中的ONEWAYANOVA法进行差异显著性分析，差异显著性表达水平为P005和差异极显著水平为P001。小尾寒羊各组织FSTL1MRN。
28、A表达水平见附图5。结果显示FSTL1在这些组织中均有表达，而在肺、脂肪和血管中大量表达且显著高于其他组织P005。表明该基因具有调控脂肪生长的功能。0118定量PCR结果表明，FSTL1在这7种组织中均有表达，在肺、血管和脂肪组织中大量表达，说明通过调控FSTL1基因的表达，能够调节小尾寒羊骨骼肌中的脂肪含量，从而达到改善小尾寒羊肉品质的作用，也可以指导分子育种，应用于培育生长速度快、肉质品质好的绵羊新品种。说明书CN104212810A101/6页1100010002序列表CN104212810A112/6页120003序列表CN104212810A123/6页130004序列表CN104212810A134/6页140005序列表CN104212810A145/6页150006序列表CN104212810A156/6页16序列表CN104212810A161/2页17图1图2图3图4说明书附图CN104212810A172/2页18图5说明书附图CN104212810A18。