技术领域
本发明属于干细胞领域，涉及干细胞保存，具体涉及保存介质添加剂在脐带干细胞和/或脂肪干细胞保存方面的应用。
背景技术
脐带源间充质干细胞(脐带干细胞)具有自我更新、多项分化潜能以及较强的免疫调节作用，而且其来源丰富、易于培养，这些特性使其在组织损伤性疾病和免疫性疾病的治疗中有重要的应用价值。研究显示，脐带源间充质干细胞已经在多种疾病的临床试验中应用，包括神经系统疾病、心脏疾病、肝纤维化、骨科疾病及自身免疫性疾病，还可应用于降低器官移植后的免疫排斥反应，提高器官移植的成功率。人脂肪间充质干细胞(脂肪干细胞)最早从人抽脂手术中分离获得，具有很强的增殖和多向分化能力。在临床研究中，脂肪间充质干细胞在细胞移植及组织工程等方面也有着广泛的应用前景。
由于种种原因，制备的干细胞时常不能立即应用，因此保存介质、保存温度和保存时间对细胞活性的影响是广大基础研究者和临床应用人员最关心的问题。干细胞的活性会影响到患者的医疗安全和疗效。目前，间充质干细胞的保存介质通常选用0.9％氯化钠溶液(即生理盐水)、5％葡萄糖溶液或1％人血白蛋白溶液，其中0.9％氯化钠溶液最为常用；保存温度通常选用4℃低温保存，保存时间通常控制在6h以内。现有技术的缺陷在于：(1)考虑到温度对干细胞活性的影响，通常采用4℃低温保存，但是临床应用是在常温下使用的，这就导致在干细胞保存、应用时分别需要增加降温、升温步骤，而且这种降温、升温必须非常缓慢，费时费事；(2)为了保证干细胞的活性在80％以上(考虑到安全和疗效，临床应用的干细胞活性通常不应低于80％)，干细胞在保存介质中的保存时间应控制在6h内，这个时间是非常紧张的，对距离稍长的运输是一个挑战。
因此，有必要寻找新的保存介质或保存介质添加剂，以维持脐带干细胞或脂肪干细胞在常温(25℃)及较长保存时间(＞6h)保存条件下的活性。
发明内容
现有技术的缺陷在于：(1)考虑到温度对干细胞活性的影响，通常采用4℃低温保存，但是临床应用是在常温下使用的，这就导致在干细胞保存、应用时分别需要增加降温、升温步骤，而且这种降温、升温必须非常缓慢，费时费事；(2)为了保证干细胞的活性在80％以上(考虑到安全和疗效，临床应用的干细胞活性通常不应低于80％)，干细胞在保存介质中的保存时间应控制在6h内，这个时间是非常紧张的，对距离稍长的运输是一个挑战。因此，本发明的目的在于寻找新的保存介质或保存介质添加剂，以维持脐带干细胞或脂肪干细胞在常温(25℃)及较长保存时间(＞6h)保存条件下的活性(不低于80％)。
本发明目的通过下述技术方案实现：
一种脐带间充质干细胞的保存介质，为0.9％氯化钠溶液，该溶液中还含有有效浓度的蕨素A、蕨素B或蕨素C。
蕨素A、蕨素B或蕨素C用作脐带间充质干细胞保存介质添加剂的用途。
进一步地，所述保存介质为0.9％氯化钠溶液。
蕨素A、蕨素B或蕨素C在制备脐带间充质干细胞保存介质方面的应用应用。
一种脐带间充质干细胞的保存介质，为0.9％氯化钠溶液，该溶液中还含有姬蕨酮。
姬蕨酮用作脐带间充质干细胞保存介质添加剂的用途。
进一步地，所述保存介质为0.9％氯化钠溶液。
姬蕨酮在制备脐带间充质干细胞保存介质方面的应用应用。
一种脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞的保存介质，为0.9％氯化钠溶液，该溶液中还含有有效浓度的乌药烯酮。
乌药烯酮用作脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞保存介质添加剂的用途。
进一步地，所述保存介质为0.9％氯化钠溶液。
乌药烯酮在制备脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞保存介质方面的应用应用。
一种脂肪间充质干细胞的保存介质，为0.9％氯化钠溶液，该溶液中还含有人参萜醇B。
人参萜醇B用作脂肪间充质干细胞保存介质添加剂的用途。
进一步地，所述保存介质为0.9％氯化钠溶液。
人参萜醇B在制备脂肪间充质干细胞保存介质方面的应用应用。
一种脂肪间充质干细胞的保存介质，为0.9％氯化钠溶液，该溶液中还含有有效浓度的白木香醇或去氢白木香醇。
白木香醇或去氢白木香醇用作脂肪间充质干细胞保存介质添加剂的用途。
进一步地，所述保存介质为0.9％氯化钠溶液。
白木香醇或去氢白木香醇在制备脂肪间充质干细胞保存介质方面的应用应用。
本发明对现有技术的贡献：
现有技术的缺陷在于：(1)考虑到温度对干细胞活性的影响，通常采用4℃低温保存，但是临床应用是在常温下使用的，这就导致在干细胞保存、应用时分别需要增加降温、升温步骤，而且这种降温、升温必须非常缓慢，费时费事；(2)为了保证干细胞的活性在80％以上(考虑到安全和疗效，临床应用的干细胞活性通常不应低于80％)，干细胞在保存介质中的保存时间应控制在6h内，这个时间是非常紧张的，对距离稍长的运输是一个挑战。本发明提供的化合物可以用作脐带干细胞或脂肪干细胞的保存介质添加剂，维持脐带干细胞或脂肪干细胞在常温(25℃)及较长保存时间(＞6h)保存条件下的活性(不低于80％)。
附图说明
图1为化合物结构式；
图2为各组人脐带间充质干细胞常温保存12h的细胞贴壁率(％)；
图3为各组人脐带间充质干细胞常温保存12h的分化能力；
图4为各组人脂肪间充质干细胞常温保存12h的细胞贴壁率(％)；
图5为各组人脂肪间充质干细胞常温保存12h的分化能力。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。
实施例1：保存介质对脐带间充质干细胞常温保存活性的影响
一、实验材料
蕨素A、蕨素B、蕨素C、人参萜醇B、乌药烯酮、姬蕨酮、白木香醇和去氢白木香醇纯度不低于98％，化学结构式如图1所示。
脐带间充质干细胞成骨、成脂诱导分化培养基购自广州赛业生物科技有限公司。
胎牛血清、α-MEM培养基购自Gibco。
二、实验方法
1、人脐带间充质干细胞的分离和培养
实验在无菌条件下操作：取健康足月剖宫产新生儿近胎儿段脐带15cm，立即剔除动静脉，剪碎至约1mm3大小，PBS洗涤后分装于离心管中，每管分别加入0.2％Ⅰ型胶原酶、0.2％Ⅲ型胶原酶、0.1％透明质酸酶，于37℃震荡孵育3h，再加入0.1％胰蛋白酶、DNA酶(15U/mL)37℃震荡孵育30min；加入PBS，滴管反复吹打以使细胞充分离散后于1500r/min条件下离心10min，收集细胞沉淀，PBS洗涤，用含10％胎牛血清的α-MEM完全培养基(添加双抗)重悬，接种到T-25cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2条件下培养，每2～3d用完全培养基半量换液，待细胞融合至约85％时传代。
2、人脐带间充质干细胞的分组及不同保存介质处理
取第3代对数生长期的脐带间充质干细胞，消化，按如下分组使用对应的溶液作为保存介质制成单细胞悬液，于25℃条件下保存12h，测定细胞活性和多向分化能力。
现有技术组：0.9％生理盐水；
药物干预组：0.9％生理盐水配制的蕨素A、蕨素B、蕨素C、人参萜醇B、乌药烯酮、姬蕨酮、白木香醇或去氢白木香醇溶液，药物干预的浓度为50μM，添加体积百分含量为万分之五的DMSO作为溶媒助溶；
溶媒对照组：0.9％生理盐水，添加体积百分含量为万分之五的DMSO。
3、贴壁实验测定细胞活性
取第3代对数生长期的脐带间充质干细胞，消化，按上述分组使用对应的溶液作为保存介质制成1.5×106/mL单细胞悬液，于25℃条件下保存12h；保存12h后，用含10％胎牛血清的α-MEM完全培养基(添加双抗)洗涤并重悬细胞，每组以1×104/孔接种于24孔板；37℃、5％CO2条件孵育24h；孵育24h后，用40g/L多聚甲醛固定20min，结晶紫染液100μL染色15min，PBS洗涤，倒置显微镜下计数，并按照如下公式计算细胞贴壁率(％)。
细胞贴壁率(％)＝已贴壁细胞总数/接种细胞总数×100％
4、多向分化能力测定
取第3代对数生长期的脐带间充质干细胞，消化，按上述分组使用对应的溶液作为保存介质制成1.5×106/mL单细胞悬液，于25℃条件下保存12h；保存12h后，以3×104/孔接种于6孔板中，分别以成骨诱导和成脂诱导培养基培养；成骨诱导经茜素红S染色观察钙矿化结节形成，成脂诱导经油红O染色观察脂质沉积形成。诱导培养18d后，倒置显微镜下随机取5个视野，按照如下公式计算矿化面积百分率(％)或成脂面积百分率(％)。
矿化面积百分率(％)＝矿化结节面积/视野面积×100％
成脂面积百分率(％)＝脂质沉积面积/视野面积×100％
5、数据处理
采用SPSS 17.0软件处理，数据以均值±标准差表示，组间比较采用Student’s t-检验，P<0.05被认为组间差异有显著性意义。
三、实验结果
1、各化合物对人脐带间充质干细胞常温保存活性的影响
反映细胞活性的指标不仅需反映细胞的生理状态更需反映细胞功能，脐带间充质干细胞为贴壁细胞，黏附能力下降直接影响移植后疗效，本领域技术人员知道，贴壁实验是检测细胞活性方法中最精准的(参考文献：评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标，中国组织工程研究，2013)，因此本发明通过观察细胞贴壁率来评价脐带间充质干细胞活性。
实验结果如表1和图2所示，与现有技术组相比，溶媒对照组细胞贴壁率无显著差异，说明万分之五的DMSO在常温条件下不会明显影响人脐带间充质干细胞的活性；与溶媒对照组相比，蕨素A、蕨素B、蕨素C、姬蕨酮、乌药烯酮组细胞贴壁率显著升高，而人参萜醇B、白木香醇、去氢白木香醇组细胞贴壁率无显著差异，说明蕨素A、蕨素B、蕨素C、姬蕨酮、乌药烯酮可以显著提高人脐带间充质干细胞的常温保存活性，而人参萜醇B、白木香醇、去氢白木香醇作用不明显。
表1各组人脐带间充质干细胞常温保存12h的细胞贴壁率(％)
2、各化合物对人脐带间充质干细胞常温保存分化能力的影响
实验结果如表2和图3所示，与现有技术组相比，溶媒对照组细胞分化能力无显著差异，说明万分之五的DMSO在常温条件下不会明显影响人脐带间充质干细胞的分化能力；与溶媒对照组相比，各化合物组细胞分化能力无显著差异，说明各化合物在常温条件下不会明显影响人脐带间充质干细胞的分化能力(部分化合物还促进成骨、成脂分化)。
表2各组人脐带间充质干细胞常温保存12h的分化能力
综上可见，本发明提供的化合物可以用作脐带干细胞的保存介质添加剂，维持脐带干细胞在常温(25℃)及较长保存时间(＞6h)保存条件下的活性(不低于80％)。
实施例2：保存介质对脂肪间充质干细胞常温保存活性的影响
一、实验材料
蕨素A、蕨素B、蕨素C、人参萜醇B、乌药烯酮、姬蕨酮、白木香醇和去氢白木香醇纯度不低于98％，化学结构式如图1所示。
脂肪间充质干细胞成骨、成脂诱导分化培养基购自广州赛业生物科技有限公司。
胎牛血清、低糖DMEM培养基购自Gibco。
二、实验方法
1、人脂肪间充质干细胞的分离和培养
实验在无菌条件下操作：取健康志愿者的脂肪组织，PBS洗涤，去除脂肪表面的结缔组织和血管，剪碎至约1mm3大小，加入0.1％Ⅰ型胶原酶，37℃消化45min，期间每5min取出剧烈震荡，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1500r/min离心10min，去除上层漂浮的脂肪组织，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心，收集细胞沉淀，PBS洗涤，用含10％胎牛血清的低糖DMEM完全培养基(添加双抗)重悬，接种到T-25cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2条件下培养，每2～3d用完全培养基半量换液，待细胞融合至约85％时传代。
2、人脂肪间充质干细胞的分组及不同保存介质处理
取第3代对数生长期的脂肪间充质干细胞，消化，按如下分组使用对应的溶液作为保存介质制成单细胞悬液，于25℃条件下保存12h，测定细胞活性和多向分化能力。
现有技术组：0.9％生理盐水；
药物干预组：0.9％生理盐水配制的蕨素A、蕨素B、蕨素C、人参萜醇B、乌药烯酮、姬蕨酮、白木香醇或去氢白木香醇溶液，药物干预的浓度为50μM，添加体积百分含量为万分之五的DMSO作为溶媒助溶；
溶媒对照组：0.9％生理盐水，添加体积百分含量为万分之五的DMSO。
3、贴壁实验测定细胞活性
取第3代对数生长期的脂肪间充质干细胞，消化，按上述分组使用对应的溶液作为保存介质制成1.5×106/mL单细胞悬液，于25℃条件下保存12h；保存12h后，用含10％胎牛血清的低糖DMEM完全培养基(添加双抗)洗涤并重悬细胞，每组以1×104/孔接种于24孔板；37℃、5％CO2条件孵育24h；孵育24h后，用40g/L多聚甲醛固定20min，结晶紫染液100μL染色15min，PBS洗涤，倒置显微镜下计数，并按照如下公式计算细胞贴壁率(％)。
细胞贴壁率(％)＝已贴壁细胞总数/接种细胞总数×100％
4、多向分化能力测定
取第3代对数生长期的脂肪间充质干细胞，消化，按上述分组使用对应的溶液作为保存介质制成1.5×106/mL单细胞悬液，于25℃条件下保存12h；保存12h后，以3×104/孔接种于6孔板中，分别以成骨诱导和成脂诱导培养基培养；成骨诱导经茜素红S染色观察钙矿化结节形成，成脂诱导经油红O染色观察脂质沉积形成。诱导培养18d后，倒置显微镜下随机取5个视野，按照如下公式计算矿化面积百分率(％)或成脂面积百分率(％)。
矿化面积百分率(％)＝矿化结节面积/视野面积×100％
成脂面积百分率(％)＝脂质沉积面积/视野面积×100％
5、数据处理
采用SPSS 17.0软件处理，数据以均值±标准差表示，组间比较采用Student’s t-检验，P<0.05被认为组间差异有显著性意义。
三、实验结果
1、各化合物对人脂肪间充质干细胞常温保存活性的影响
脂肪间充质干细胞也为贴壁细胞，因此本发明参照实施例1中评价人脐带间充质干细胞的方法通过观察细胞贴壁率来评价脂肪间充质干细胞活性。
实验结果如表3和图4所示，与现有技术组相比，溶媒对照组细胞贴壁率无显著差异，说明万分之五的DMSO在常温条件下不会明显影响人脂肪间充质干细胞的活性；与溶媒对照组相比，人参萜醇B、白木香醇、去氢白木香醇、乌药烯酮组细胞贴壁率显著升高，而蕨素A、蕨素B、蕨素C、姬蕨酮组细胞贴壁率无显著差异，说明人参萜醇B、白木香醇、去氢白木香醇、乌药烯酮可以显著提高人脂肪间充质干细胞的常温保存活性，而蕨素A、蕨素B、蕨素C、姬蕨酮作用不明显。
表3各组人脂肪间充质干细胞常温保存12h的细胞细胞贴壁率(％)
2、各化合物对人脂肪间充质干细胞常温保存分化能力的影响
实验结果如表4和图5所示，与现有技术组相比，溶媒对照组细胞分化能力无显著差异，说明万分之五的DMSO在常温条件下不会明显影响人脂肪间充质干细胞的分化能力；与溶媒对照组相比，各化合物组细胞分化能力无显著差异，说明各化合物在常温条件下不会明显影响人脂肪间充质干细胞的分化能力(部分化合物还一定程度促进成骨、成脂分化)。
表4各组人脂肪间充质干细胞常温保存12h的分化能力
综上可见，本发明提供的化合物可以用作脂肪干细胞的保存介质添加剂，维持脂肪干细胞在常温(25℃)及较长保存时间(＞6h)保存条件下的活性(不低于80％)。
上述实施例旨在具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员理应知道，不应该将本发明的保护范围局限于上述具体实施例。