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1、(10)授权公告号 CN 102762104 B (45)授权公告日 2014.08.06 CN 102762104 B (21)申请号 201180010309.3 (22)申请日 2011.02.25 PCT/CN2010/070763 2010.02.26 CN A23B 7/02(2006.01) A23L 1/212(2006.01) (73)专利权人 诺维信公司 地址 丹麦鲍斯韦 (72)发明人 韩明光 赵娟 闫爱华 吴桂芳 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 谢梦欣 CN 101099528 A,2008.01.09, CN 1588631 A,200。
2、5.03.02, JP 2004057157 A,2004.02.26, CN 1362034 A,2002.08.07, JP 2000024425 A,2000.01.25, CN 1294633 A,2001.05.09, CN 1153606 A,1997.07.09, (54) 发明名称 用于制备果干的酶预处理 (57) 摘要 本发明涉及一种用于果干制备的工艺， 所述 工艺包括在干燥步骤前将果实与多聚半乳糖醛酸 酶接触。 多聚半乳糖醛酸酶能进一步与果胶酯酶、 果胶裂合酶、 果胶酸裂合酶、 木葡聚糖酶、 - 葡 聚糖酶、 淀粉酶和脂肪酶组合使用。 (66)本国优先权数据 (85)PCT。
3、国际申请进入国家阶段日 2012.08.21 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CN2011/071301 2011.02.25 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2011/103812 EN 2011.09.01 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐彦 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 (10)授权公告号 CN 102762104 B CN 102762104 B 1/1 页 2 1. 一种用于果干制备的工艺， 该工艺包括在预处理过程中用多聚半乳糖。
4、醛酸酶处理果 实。 2. 权利要求 1 的工艺， 其中所述工艺包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一种选自下组的 酶处理果实 ： 果胶酯酶、 果胶裂合酶、 果胶酸裂合酶、 木葡聚糖酶、 - 葡聚糖酶、 淀粉酶和 脂肪酶。 3. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述工艺包括用多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶处理果 实。 4. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述酶处理之后是干燥步骤。 5. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述多聚半乳糖醛酸酶源自曲霉属 (Aspergillus) 的 菌株。 6. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述多聚半乳糖醛酸酶源自棘孢曲霉 (Aspergillus ac。
5、uleatus) 的菌株。 7. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 10-80范围内的温度进行。 8. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 10-70范围内的温度进行。 9. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 10-60范围内的温度进行。 10. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 15-50范围内的温度进行。 11. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 15-40范围内的温度进行。 12. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 20-40范围内的温度进行。 13. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理在 4-8。
6、 范围内的 pH 进行。 14. 权利要求 13 的工艺， 其中所述处理在 6-7 范围内的 pH 进行。 15. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理以不少于 3 分钟的反应时间进行。 16. 权利要求 15 的工艺， 其中所述处理以 3 分钟至 48 小时范围内的反应时间进行。 17. 权利要求 15 的工艺， 其中所述处理以或 5 分钟至 24 小时范围内的反应时间进行。 18. 权利要求 15 的工艺， 其中所述处理以 5 分钟至 5 小时范围内的反应时间进行。 19. 权利要求 15 的工艺， 其中所述处理以 5 分钟至 1 小时范围内的反应时间进行。 20. 权利要求 15。
7、 的工艺， 其中所述处理以 10 至 30 分钟范围内的反应时间进行。 21. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述处理以按果实重量不少于 0.5的酶剂量进行。 22. 权利要求 21 的工艺， 其中所述处理以按果实重量 0.5 -5% 范围内的酶剂量进行。 23. 权利要求 21 的工艺， 其中所述处理以按果实重量 0.5 -1% 范围内的酶剂量进行。 24. 权利要求 21 的工艺， 其中所述处理以按果实重量 1 -1% 范围内的酶剂量进行。 25. 权利要求 21 的工艺， 其中所述处理以按果实重量 2 -1% 范围内的酶剂量进行。 26. 权利要求 1 或 2 的工艺， 其中所述果。
8、实选自下组 ： 葡萄、 樱桃番茄、 李子 / 梅子、 杏、 酸果蔓、 蓝莓和樱桃。 27. 权利要求 26 的工艺， 其中所述果实为葡萄。 权 利 要 求 书 CN 102762104 B 2 1/10 页 3 用于制备果干的酶预处理 0001 涉及序列表 0002 本申请含有计算机可读形式的序列表。将该计算机可读形式通过提述并入本文。 技术领域 0003 本发明涉及一种用于制备果干的工艺， 包括在干燥步骤前将果实与多聚半乳糖醛 酸酶接触。 背景技术 0004 从葡萄转变为葡萄干有三个主要操作 ： 预处理、 干燥和干燥后操作(Food Reviews International， 23:257。
9、-280,2007)。 0005 预处理的目的是提高葡萄皮对水分的渗透性。基于蜡质层的疏水性质， 皮充当了 保护屏障。 由浆果皮角质层的蜡质中的这种疏水分子屏障导致的低水分扩散性可能会导致 费时的干燥工艺。已有文献提出过葡萄干燥工艺中的化学预处理。一种常见的实践是在预 处理中应用油乳胶或稀释的碱性溶液， 其通过减少葡萄表皮的水分转移的阻力和提高内部 水分的扩散系数来加速干燥过程。 常用的稀释的碱性溶液包括碳酸钾溶液和氢氧化钠溶液 等 (Journal of Food Engineering 39(1999)211-216)。 0006 根据耕作条件， 世界不同区域的葡萄干燥工艺不同。有 3 种。
10、主要方法用来干燥果 实 ： 晒干、 阴干和机械干燥。晒干法有几个不利之处， 包括由灰尘和昆虫传染导致的环境污 染可能性、 降雨引起的物理的微生物性变质和由强烈日光照射导致的褪色。 对于果干生产， 特别是需要高通量时， 安全、 快速和可控的机械干燥是有吸引力的。 0007 通过晒干或其它干燥技术生产出干葡萄后， 必需将它们输送到合适的处理单元。 根据干燥方法， 干燥后操作可能不同。一般来说， 在干燥后操作的过程中， 洗涤葡萄干以除 去果干表面和小梗上的灰尘 ； 洗涤之后， 旋转干燥葡萄干以除去水 ； 然后清洁葡萄干， 这包 括分开每个葡萄干， 除去茎和外来物质， 和除去不合格的葡萄干 ； 并且最。
11、后， 使用食品级的 油和化学物质来使葡萄干更好看且避免微生物。在干燥后操作之后， 葡萄干已准备好进行 包装。 0008 JP2004057157 描述了干燥后操作之后， 对果干进行酶处理， 所述酶处理造成对味 道的修饰。 0009 到目前为止， 大多数研究者专注于预处理和干燥， 从而优化果干生产工艺以使操 作更节能和有利于环境。 发明内容 0010 本发明的目的是提供一种用于果干制备的酶工艺， 所述工艺包括在预处理过程中 用多聚半乳糖醛酸酶处理果实。 0011 在本发明的具体的实施方案中， 所述工艺包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一种选 自下组的酶的组合来处理果实 ： 果胶酯酶、 果胶裂合酶、 果。
12、胶酸裂合酶、 木葡聚糖酶、 - 葡 说 明 书 CN 102762104 B 3 2/10 页 4 聚糖酶、 淀粉酶和脂肪酶。 0012 在本发明的具体的实施方案中， 所述工艺包括用多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的 组合来处理果实。 0013 在另一具体的实施方案中， 本发明的酶处理之后是干燥步骤。 0014 特别地， 本发明用于生产葡萄干。 因为生产果干的机理和工艺是相似的， 本发明可 以适用于果实如葡萄、 樱桃番茄、 李子 / 梅子 (plum)、 杏、 酸果蔓 (cranberry)、 蓝莓和樱桃 等来生产它们的果干。 0015 本发明可以在接近中性 pH 下进行， 这意味着所述工艺通过减少。
13、流出液负载 (effluent load) 而对环境更有利。本发明处理过的果实甚至可以在后续干燥步骤中在相 对短的时间内达到最优的脱水结果， 这会节省能量。 0016 发明详述 0017 葡萄皮结构 0018 葡萄的皮由表皮和 6 到 10 层小厚壁细胞组成， 在控制干燥过程中起着关键作用。 葡萄浆果的皮的层数、 其大小和体积是品种特异的问题。不同来源的葡萄在皮中的层数上 可能有很大不同。外表皮被无生命层覆盖， 所述无生命层即角质层、 皮孔、 蜡质和厚角组织 下皮细胞(collenchymatous hypodermal cell)。 基于蜡质层的疏水性质， 皮充当抵抗真菌 病原体的保护屏障。。
14、它进一步减少蒸发导致的失水并保护葡萄免于紫外线和物理伤害。皮 还控制浆果和周围环境的气体交换。 0019 蜡质由无定形层和角质层内蜡质二者构成， 所述无定形层由一系列重叠的疏水小 板组成， 所述角质层内蜡质存在于外表皮结构中。 无定形层只允许水以蒸汽的形式转移。 但 是， 皮的角质层中蜡质的存在是干燥的障碍， 需重点提及的是通过化学处理来除去蜡质以 提高干燥速度时， 需要特别注意， 原因是其对干燥产品贮存期限和安全性的强烈影响。 0020 用于制备果干的预处理工艺 0021 文献一定程度上已经提出了葡萄干燥工艺中的化学预处理的效果。 应用油乳胶或 碱性溶液的预处理是一种常见的实践， 通过减少葡。
15、萄表皮对水分转移的阻力和提高内部水 分的扩散系数来加速干燥过程。 常用于预处理的碱性溶液包括碳酸钾溶液和氢氧化钠溶液 等， 一般 pH 值大于 11。 0022 预处理会导致干燥速度加快， 尤其在干燥过程的早期阶段。化学物质的组成、 浓 度、 pH 和温度及预处理时间是皮的各层微结构变化的有效因素。预处理工艺有关的物理和 化学现象能继而影响葡萄干燥参数。因此， 为了生产出在干燥操作后能够简单和安全地进 行加工的产品， 控制预处理和干燥条件是必须的。 0023 本发明人惊讶地发现多聚半乳糖醛酸酶能够在用于制备果干的预处理步骤中使 用， 若需要与至少一种酶组合使用， 所述酶包括但不限于果胶酯酶、 。
16、果胶裂合酶、 果胶酸裂 合酶、 木葡聚糖酶、 - 葡聚糖酶、 淀粉酶和 / 或脂肪酶。 0024 在本发明的具体的实施方案中， 所述工艺包含用多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的 组合来处理果实。 0025 本发明的酶预处理后可以是干燥步骤。根据工业需要， 干燥步骤后的最终重量减 轻达到大约 70% 或甚至更高。 0026 进一步地， 干燥步骤之后可以是干燥后操作， 以清洁葡萄干和 / 或施用食品级的 说 明 书 CN 102762104 B 4 3/10 页 5 油和化学物质。 0027 本发明的酶预处理工艺可以在 10 0、 15 5 或 20 0 以上的温度进行。典型 的温度在 10-80 0、。
17、 10-70 0、 10-60 0、 15-50 0、 30-50 0、 15-40 0、 20-40 度进、 15-30 0 或 20-30 0 的范围内。更优选地， 其在室温下进行。 0028 本发明的酶预处理工艺可以优选在pH 4-8、 4-7或5-7的范围内进行， 更优选地是 在接近中性的 pH， 比如 pH 5.5-7、 5.5-6.5 或 6-7 进行。在接近中性的 pH 下进行的处理具 有工业价值， 其使预处理步骤之后处理废水溶液的过程更简单。 0029 本发明的反应时间应该不少于 3 分钟， 优选地不少于 5 分钟， 更优选地不少于 10 分钟， 并且甚至更优选地不少于 15 。
18、分钟。本发明的酶处理的合适持续时间可以从几分钟到 几小时， 比如从约 3 分钟到约 48 小时， 或从约 5 分钟到约 24 小时， 或从约 5 分钟到约 12 小 时， 或从约 5 分钟到 5 小时， 优选地从约 5 分钟到约 1 小时， 更优选地从约 5 分钟到约 30 分 钟， 更优选地从约 10 分钟到约 30 分钟， 甚至更优选地约 15 分钟到 1 小时， 以及最优选地约 20 分钟到约 1 小时。 0030 本发明的酶应该以有效量添加。术语 “有效量” 的意思是指和碱性化学预处理相 比， 足以产生增强的干燥效果的量。 应该理解的是，“有效量” 会依赖于各种参数， 包括 ： 酶的 。
19、水溶液的浓度， 溶液的 pH， 应用溶液的持续时间， 溶液的温度和葡萄的种类， 例如皮的厚度、 葡萄体积的大小和其它的果实特征。 本发明中使用的剂量可以根据本领域中已知的方法来 决定。 0031 在具体的实施方案中， 本发明中使用的酶的量不少于待处理果实的 0.5 ( 以 酶蛋白对果实重量计算， 即每千克果实 0.5 克酶蛋白 )， 更优选地， 大于果实重量的 1或 2。在进一步的具体的实施方案中， 酶量在果实重量的 0.5 -5%、 0.2 -5%、 0.5 -1%、 1 -1%、 2 -1%、 4 -2% 或 4 -1% 范围内。这些量指的是下面指示的各种酶的量。 0032 酶 0033 。
20、多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 0034 多聚半乳糖醛酸酶 (EC 3.2.1.15) 催化果胶酸盐和其它聚半乳糖醛酸中的 1,4-D- 半乳糖艾杜糖醛键 (1,4-D-galactosiduronic linkage) 的随机水解。其它 名称的实例为 ： 果胶解聚酶 ； 果胶酶 ； 多聚半乳糖醛酸内切酶 ； 内切多聚半乳糖醛酸酶 ； 和 半乳糖醛酸内切酶。系统名为多聚 (1,4-D- 半乳糖醛酸酐 ) 聚糖水解酶。 0035 酶的来源对于在本发明方法中的使用并不关键。 相应地， 酶可从任何来源如植物、 微生物或动物中获得。 酶优选从微生物来源如细菌或真菌中获得， 比如丝状真菌或酵母， 并 且可以。
21、通过本领域中通常使用的技术获得。 0036 在优选的实施方案中， 酶从真菌来源获得。例如， 酶可以从酵母菌株如假丝 酵 母 属 (Candida)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 毕 赤 酵 母 属 （Pichia)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces) 或 西 洋 蓍 霉 属 (Yarrowia) 获 得 ； 或者从丝状真菌菌株如枝顶孢霉属 (Acremonium)、 曲霉属 (Aspergillus)、 短梗霉属 (Aureobasidium)、 金孢子菌属(Chrysosporium)、。
22、 隐球菌属(Cyptococcus)、 Filibasidium、 镰孢属(Fusarium)、 腐质霉属(Humicola)、 梨孢菌属(Magnaporthe)、 丛梗孢属(Monilia)、 毛 霉 菌 属 (Mucor)、 毁 丝 霉 属 (Myceliophthora)、 新 考 玛 脂 霉 属 (Neocallimastix)、 脉 孢 菌 属 (Neurospora)、 拟 青 霉 属 (Paecilomyces)、 青 霉 属 (Penicillium)、 平 革 菌 说 明 书 CN 102762104 B 5 4/10 页 6 属 (Phanerochaete)、瘤 胃 壶。
23、 菌 属 (Piromyces)、裂 褶 菌 属 (Schizophyllum)、小 核 菌 属 (Sclerotium)、侧 孢 菌 属 (Sporotrichum)、踝 节 菌 属 (Talaromyces)、热 子 囊 菌 属 (Thermoascus)、 梭 孢 壳 属 (Thielavia)、 弯 颈 霉 属 (Tolypocladium) 或 木 霉 属 (Trichoderma) 菌株获得。 0037 在具体的实施方案中， 根据本发明使用的多聚半乳糖醛酶来源于曲霉， 特别是棘 孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)。优选地， 根据 US 6,159,718 获得的。
24、是多聚半乳糖醛酸 酶 I、 II 或 III。更优选地， 所述多聚半乳糖醛酸酶具有与本发明中 SEQ ID NO:1 的成熟多 肽至少70%、 至少75%、 至少80%、 至少85%、 至少90%、 至少91%、 至少92%、 至少93%、 至少94%、 或至少 95%、 至少 96%、 至少 97%、 至少 98%、 至少 99%、 或至少 100% 的同一性程度 ( 下文中的 “同源多肽” )。 0038 在一个优选的方面， 同源多肽具有取代、 缺失和 / 或缺失一个或多个 ( 或几个 ) 氨 基酸的 SEQ ID NO:1 的成熟多肽。更优选地， 多聚半乳糖醛酸酶具有取代、 缺失和 / 。
25、或插入 至少 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的 SEQ ID NO:1 的成熟多肽。 0039 本发明中使用的 “同一性” 参数描述两个氨基酸序列之间的相关性。就本发明 而言， 两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如 EMBOSS 程序包 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite， Rice 等， 2000， Trends in Genetics 16:276-277 ； http:/emboss.org)( 优选版本 3.0.0 或更新的版本 ) 的 Needle 程序中执行 。
26、的 Needleman-Wunsch 算法 (Needleman 和 Wunsch， 1970， J.Mol.Biol.48:443-453) 来测定 的。使用的可选参数是 ： 缺口产生罚分为 10， 缺口延伸罚分为 0.5， 和 EBLOSUM62(BLOSUM62 的 EMBOSS 版本 ) 取代矩阵。将标记为 “最长同一性” 的 Needle 输出 ( 使用 -nobrief 选项 获得 ) 用作百分比同一性并且是如下计算的 ： 0040 ( 相同的残基 x100)/( 比对的长度 - 比对中的缺口总数 ) 0041 就本发明而言， 两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如 EMBO。
27、SS 程序 包 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite， Rice 等， 2000， 见上 ； http:/emboss.org)( 优选版本 3.0.0 或更新的版本 ) 的 Needle 程序中执行的 Needleman-Wunsch 算法 (Needleman 和 Wunsch， 1970， 见上 ) 测定。使用的可选参数是 ： 缺 口产生罚分为 10， 缺口延伸罚分为 0.5， 和 EDNAFULL (NCBI NUC4.4 的 EMBOSS 版本 ) 取代 矩阵。将标记为 “最长同一性” 的 Needle 。
28、输出 ( 使用 -nobrief 选项获得 ) 用作百分比同 一性并且是如下计算的 ： 0042 ( 相同的脱氧核糖核苷酸 x100)/( 比对的长度 - 比对中的缺口总数 ) 0043 此处上下文中描述的序列中的基本同源的多肽的特征为在成熟多肽中具有一个 或多个(或几个)氨基酸取代、 缺失和/或插入。 优选地， 氨基酸改变对性质是较不重要的， 即保守的氨基酸取代或插入， 其不显著影响蛋白质的折叠和 / 或活性 ； 小缺失， 典型的为 1 到大约 9 个氨基酸， 优选地从 1 到大约 15 个氨基酸， 且最优选地从 1 到大约 30 个氨基酸 ； 小的氨基或羧基末端延伸， 如氨基末端甲硫氨酸残。
29、基 ； 多至约5到10个残基的小接头肽， 优 选地从 10 到 15 个残基， 且最优选地从 20 到 25 个残基， 或通过改变净电荷或另外的功能来 帮助纯化的小延伸， 比如多聚组氨酸标签， 抗原性表位， 蛋白质 A， CBM 或其它结合域。 0044 保守取代的实例是在以下组之内 ： 碱性氨基酸组 ( 精氨酸、 赖氨酸和组氨酸 )、 酸性氨基酸组 ( 谷氨酸和天冬氨酸 )、 极性氨基酸组 ( 谷氨酰胺和天冬酰胺 )、 疏水性氨 说 明 书 CN 102762104 B 6 5/10 页 7 基酸组 ( 亮氨酸、 异亮氨酸和缬氨酸 )、 芳族氨基酸组 ( 苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸 ) 和小。
30、 氨基酸组 ( 甘氨酸、 丙氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸和甲硫氨酸 )。通常不改变比活性 (specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的， 并且由例如H.Neurath和R.L.Hill， 1979， 于The Proteins， Academic Press， New York 中描述。最常发生的交换是 Ala/Ser、 Val/Ile、 Asp/ Glu、 Thr/Ser、 Ala/Gly、 Ala/Thr、 Ser/Asn、 Ala/Val、 Ser/Gly、 Tyr/Phe、 Ala/Pro、 Lys/Arg、 Asp/Asn、 Leu/Ile、 Leu/Val、 Ala。
31、/Glu 和 Asp/Gly。 0045 能够根据本领域已知的方法， 例如定点诱变或丙氨酸分区诱变 (Cunningham 和 Wells， 1989， Science 244:1081-1085) 来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一 技术中， 将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基， 并且测试所得突变分子的酶活性 以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见 Hilton 等， 1996， J.Biol. Chem.271:4699-4708。 酶的活性部位或其它的生物学相互作用也能够通过结构的物理分析 而测定， 如通过以下这些技术 ： 如核磁共振、 晶体学、 电子衍射或光亲和标记，。
32、 连同推定的接 触位点氨基酸的突变来测定。参见， 例如， de Vos 等， 1992， Science 255:306-312 ； Smith 等， 1992， J.Mol.Biol.224:899-904 ； Wlodaver 等， 1992， FEBS Lett.309:59-64。必需氨基 酸的身份 (identity) 也能够从分析与亲本多肽相关的多肽的同一性来推断。 0046 能够使用已知的诱变、 重组和 / 或改组 (shuffling) 方法， 然后是有关的筛选方 法， 例 如 那 些 由 Reidhaar-Olson 和 Sauer， 1988， Science 241:53。
33、-57 ； Bowie 和 Sauer， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156 ； WO 95/17413 ； 或 WO 95/22625 公开的那 些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、 缺失、 和 / 或插入。能够使用的其它方法 包括易错 PCR、 噬菌体展示 ( 例如， Lowman 等， 1991， Biochem.30:10832-10837 ； 美国专利 5,223,409 号 ； WO 92/06204) 和区域定向的诱变 (Derbyshire 等， 1986， Gene 46:145 ； Ner 等， 1988， DNA 7:1。
34、27)。 0047 诱变 / 改组方法能够与高通量、 自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的 克隆的、 诱变的多肽的活性 (Ness 等， 1999， Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从 宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的 DNA 分子， 并且使用本领域内标准方法快速测序。这 些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性， 并且能够应用于未知结构 的多肽。 0048 在一个具体的实施方案中， 本发明中使用的多聚半乳糖醛酸酶的量不少于待处理 果实的 0.5 ( 以酶蛋白对果实的重量计算 )， 更优选地， 大于果实的 1或大于 2。在更 进一步的具。
35、体的实施方案中， 酶量在果实重量的 0.5 -5%、 0.2 -5%、 0.5 -1%、 1 -1%、 2 -1%、 4 -2%、 或 4 -1% 范围内。 0049 果胶酯酶 (PE) 0050 果胶酯酶 (EC 3.1.1.11) 催化的反应为 ： 果胶 +n 水 =n 甲醇 + 果胶酸盐。其它 名称的实例为 ： 果胶脱甲氧基化酶 ； 果胶甲酯酶 ； 和果胶甲基酯酶。系统名为果胶甲酯酶 (pectin pectylhydrolase)。 0051 来源于棘孢曲霉和大型亚灰树花菌 (Meripilus giganteus) 的果胶酯酶分别在 WO94/25575 和 WO97/31102 中。
36、描述。 0052 在一个具体的实施方案中， 根据本发明使用的果胶酯酶具有与本发明中的 SEQ ID NO:2 的成熟多肽具有至少 70%、 至少 75%、 至少 80%、 至少 85%、 至少 90%、 至少 91%、 至少 92%、 说 明 书 CN 102762104 B 7 6/10 页 8 至少93%、 至少94%、 或至少95%、 至少96%、 至少97%、 至少98%、 至少99%、 或至少100%同一性 程度的氨基酸序列 ( 下文中的 “ 同源多肽 “)。 0053 在一个优选的方面， 同源多肽具有取代、 缺失和 / 或插入一个或多个 ( 或几个 ) 氨 基酸的 SEQ ID N。
37、O:2 的成熟多肽。更优选地， 果胶酯酶具有取代、 缺失和 / 或插入 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的 SEQ ID NO:2 的成熟多肽。 0054 在一个具体的实施方案中， 本发明中使用的果胶酯酶的量不少于待处理果实的 0.5 ( 以酶蛋白对果实重量计算 )、 更优选地， 相对于果实大于 1或大于 2。在进一步 的具体的实施方案中， 酶量相对于果实重量在 0.5 -5%、 0.2 -5%、 0.5 -1%、 1 -1%、 2 -1%、 4 -2%、 或 4 -1% 的范围内。 0055 果胶酸裂合酶 0056 果胶酸裂合酶 (EC 4.2.2.2)。
38、 催化 (1,4)-D- 聚半乳糖醛酸的消除分解 (eliminative cleavaeg) 得到在其非还原端具有 4- 脱氧 -D- 半乳糖 -4-enuronosyl 基 (4-deoxy-alpha-D-galact-4-enuronosyl group) 的寡糖。其它名称的实例为 ： 果胶酸 反式消去酶 (pectate transeliminase) ； 多聚半乳糖醛酸反式消去酶 (polygalacturonic transeliminase) ； 和果胶内甲基反式消去酶 (endopectin methyltranseliminase)。系统 名是 (1,4)-D- 聚半乳糖醛。
39、酸裂解酶。在一个具体的实施方案中， 根据本发明使用的果 胶酸裂合酶来源于芽孢杆菌属。 0057 果胶裂合酶 0058 果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)催化(1,4)-D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除裂解得到 在其非还原端具有 4- 脱氧 -6- 氧 - 甲基 -D- 半乳糖 -4-enuronosyl 基的寡糖。果胶 裂合酶可能以如下名字为人所知 ： 果胶反式消去酶 (pectin transeliminase) ； 果胶内裂 合酶 (endo-pectin lyase) ； 多聚甲基半乳糖醛酸反式消去酶 (polymethylgalacturonic transeliminase) ； 果胶甲。
40、基反式消去酶 (pectin methyltranseliminase) ； 果胶溶解酶 (pectolyase)。 0059 根据本发明优选微生物的果胶裂合酶。 微生物果胶裂合酶可以来源于细菌或真菌 ( 包括丝状真菌和酵母 )。微生物果胶裂合酶优选从真菌中获得。真菌可以是属于担子菌 亚门 (subdivision Basidiomycotina) 或子囊菌亚门 (subdivision Ascomycotina) 的菌 株。合适的实例包括可来源于曲霉属菌种菌株的果胶裂合酶。WO 94/21786 中描述了一种 来源于棘孢曲霉的果胶裂合酶。 0060 来源于黑曲霉和米曲霉的菌株的果胶裂合酶是优。
41、选的。 适用于本发明的商业果胶 裂合酶组合物是 CITROZYM PREMIUM、 PECTINEX SMASH XXL、 NOVOFERM P 和 NOVOFERM 可从 Novozymes A/S 获得。 0061 脂肪酶 0062 合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的。包括化学或遗传上修饰的突变体。脂肪 酶例如可以是三酰基甘油脂肪酶 (EC3.1.1.3)， 磷脂酶 A2(EC 3.1.1.4)， 溶血磷脂酶 (EC 3.1.1.5)， 甘油一酯脂肪酶 (EC 3.1.1.23)， 半乳糖脂肪酶 (EC3.1.1.26)， 磷脂酶 A1(EC 3.1.1.32)， 脂蛋白脂肪酶 (EC 3.。
42、1.1.34)。 0063 有用的脂肪酶的实例包括疏棉状腐质霉 (Humicola lanuginose) 脂肪酶， 例如， 如在 EP 258068 和 EP 305216 中描述的， 曼赫根毛霉 (Rhizomucor miehei) 脂肪酶， 例如， 说 明 书 CN 102762104 B 8 7/10 页 9 如在 EP 238023 中描述的。其它类型的脂肪分解酶如角质酶可能也有用， 例如， 如在 WO 88/09367 描述的来源于门多萨假单胞菌 (Pseudomonas mendocina) 的角质酶， 或来源于豌 豆腐皮镰孢 (Fusarium solani pisi) 的角。
43、质酶 ( 例如在 WO 90/09446 中描述 )。 0064 特 别 适 用 的 脂 肪 酶 是 如 M1 LipaseTM、 Luma fastTM和 LipomaxTM(Genencor)、 LipolaseTM和Lipolase UltraTM(可从Novozymes A/S获得)， 以及Lipase P“Amano“(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.) 的脂肪酶。 0065 淀粉酶 0066 合适可用的淀粉酶包括例如细菌或真菌来源的 - 淀粉酶 (EC 3.2.1.1)、 - 淀粉酶 (EC 3.2.1.2) 和 / 或葡糖淀粉酶 (EC 3.2.1.3)。。
44、包括化学或遗传修饰的突 变体。例如， 淀粉酶包括获得自地衣芽胞杆菌 (B.licheniformis) 的特殊菌株的 - 淀 粉酶， 其在 GB1,296,839 中有更详细的描述。相关的商业上可以获得的淀粉酶包括 TermamylTMUltra、和 ( 都可从 Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark 获得 ) 以及和 P( 可从 DSM,Holland 获得 ) 以及Purastar OxAm 和 PoweraseTM( 可从 Danisco A/S 获得 )。 0067 木葡聚糖酶 0068 根据本发明， 木葡聚糖酶定义为任何对底物木葡聚糖有活性， 能够催化木葡聚糖。
45、 溶解为木葡聚糖糖寡糖的酶。 0069 根据本发明木葡聚糖酶优选由微生物如真菌或细菌产生。 有用的木葡聚糖酶的实 例是家族 12 木葡聚糖水解内切葡聚糖酶。另一个有用的实例是由木霉属 (Trichoderma) 产生的木葡聚糖酶， 特别是EGIII。 木葡聚糖酶也可以是具有木葡聚糖酶活性以及对不溶性 纤维素的低活性和对可溶性纤维素的高活性的内切葡聚糖酶， 例如， 家族 7 内切葡聚糖酶， 可获得自例如特异腐质霉。 实施例 0070 材料和试剂 0071 葡萄 ： 来源于中国的绿葡萄， 来源于中国的紫葡萄 ( 从中国北京的超市购买 ) 0072 化学物质 ： Na2HPO412H2O、 C6H8。
46、O7H2O 0073 柠檬酸盐缓冲液 (pH4.0， 50mM) ： 9.964g Na2HPO412H2O 和 4.656gC6H8O7H2O 溶解 于 1L 去离子水。 0074 柠檬酸盐缓冲液 (pH5.5， 50mM) ： 9.964g Na2HPO412H2O 和 4.656gC6H8O7H2O 溶解 于 1L 去离子水 (pH 值用 0.1mol/L NaOH 溶液调整为 5.5)。 0075 柠檬酸盐缓冲液 (pH6.5， 50mM) ： 9.964g Na2HPO412H2O 和 4.656gC6H8O7H2O 溶解 于 1L 去离子水 (pH 值用 0.1mol/L NaOH。
47、 溶液调整为 6.5)。 0076 多聚半乳糖醛酸酶 (PG) ： 棘孢曲霉多聚半乳糖醛酸酶， 如本发明中 SEQID NO:1 的 氨基酸 40-378 的成熟肽所示 ( 根据 US 6,159,718 获得 ) 0077 果胶酯酶 (PE) ： 棘孢曲霉果胶酯酶， 如本发明中 SEQ ID NO:2 的氨基酸 18-331 的 成 熟 肽 所 示 (UNIPROT:Q12535，在 “Pectin methyl esterase from Aspergillus aculeatus ： expression cloning in yeast and characterization of 。
48、the recombinant 说 明 书 CN 102762104 B 9 8/10 页 10 enzyme“ ； Biochem.J.319:705-712(1996) 中描述 ) 0078 重量损失测定 0079 葡萄通过分析天平称重并记录。在酶处理之后， 将葡萄干燥并再次称重。重量损 失定义为 ： ( 处理前重量 - 处理后重量 )/ 处理前重量。 0080 实施例 1 ： 用多聚半乳糖醛酸酶预处理葡萄 0081 在下列 5 个烧杯中加入 100g 葡萄 ( 来源于中国的绿葡萄 )。 0082 组 1 ： 向 200ml NaOH 浓度为 15g/l、 溶液 pH 值为 13.0 的 。
49、NaOH 溶液中加入 100g 葡 萄。 0083 组 2 ： 向 200ml 柠檬酸盐缓冲液 (pH4.0， 50mM) 中加入 100g 葡萄。 0084 组 3 ： 准备 200ml 0.2%(w/w) 的低 PG 浓度的柠檬酸盐缓冲液的储液 (pH4.0， 50mM)。向该溶液中加入 100g 葡萄。 0085 组 4 ： 准备 200ml 0.4%(w/w) 的高 PG 浓度的柠檬酸盐缓冲液的储液 (pH4.0， 50mM)。向该溶液中加入 100g 葡萄。 0086 将 2、 3 和 4 组中的葡萄在 50 C 下浸泡 30 分钟。按照工业葡萄干生产工艺， 将组 1 的葡萄在室温下浸泡 30 秒。然后从烧杯中取出所有葡萄， 在烘箱中以 45 C 干燥， 并以 几。