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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201710144250.6 (22)申请日 2017.03.10 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106718946 A (43)申请公布日 2017.05.31 (73)专利权人 福建省亚热带植物研究所 地址 361000 福建省厦门市嘉禾路780-800 号 (72)发明人 刘福平 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 张松亭 游学明 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 CN。
2、 102217543 A,2011.10.19,全文. WO 2005/084212 A2,2005.09.15,全文. 崔刚等.植物开放式组织培养研究初探. 山 东农业大学学报 （自然科学版） .2004,第35卷 (第4期),第529-533页. Andrea Kodym & Francisco Javier Zapata-Arias.Low-cost alternatives for the micropropagation of banana. Plant cell,Tissue and organ culture .2001,第67- 71页. 审查员 陈佩 (54)发明名称 一种植。
3、物开放式组织培养的培养基制作方 法 (57)摘要 本发明公开了一种植物开放式组织培养的 培养基制作方法， 配制含抗菌剂的开放组培培养 基， 分装到培养瓶(杯)平放冷凝后， 在培养基表 面灌注一薄凝胶保护层， 覆盖培养基表面， 保护 层附加成分有抗菌剂、 营养成分和活性炭。 所述 凝胶原料为琼脂、 卡拉胶、 结冷胶、 果胶、 魔芋胶 等热可逆凝胶， 与附加成分和水加热成的水溶 胶， 冷凝前灌注到抗菌组培固体培养基表面成 0.1-1cm厚溶胶层， 冷却形成一薄凝胶层， 然后按 开放组培方式接种。 应用本发明方法制作的开放 组培培养基， 培养基所添加的抗菌剂主要用于抑 制培养基内部夹杂微生物， 有效。
4、降低抗菌剂使用 浓度， 解决开放组培这一技术的共性问题， 该方 法成本低廉、 操作简易， 具推广普及可行性。 权利要求书1页 说明书3页 CN 106718946 B 2019.02.05 CN 106718946 B 1.一种植物开放式组培的培养基制作方法， 包括如下步骤： 配制含抗菌剂的开放组培 培养基， 分装到培养瓶平放冷凝后， 在培养基表面灌注一凝胶保护层， 覆盖培养基表面； 所 述凝胶保护层的厚度为0.1-1cm， 凝胶为热可逆凝胶， 在凝胶保护层中的用量为0.04- 1.5； 凝胶保护层中包括抗菌剂、 营养成分、 激素和活性炭； 其中， 培养基中的抗菌剂浓度 比凝胶保护层中的抗菌剂。
5、浓度低； 所述抗菌剂包括抗生素、 防腐剂、 杀菌剂的至少一种， 其含量为0.02-0.5； 营养成分、 激素与培养基所添加营养成分、 激素相同； 活性炭添加量为0.05-0.5。 2.如权利要求1所述的一种植物开放式组培的培养基制作方法， 其特征在于： 用于灌注 的溶胶因自然冷却凝滞时， 可加热溶化， 继续灌注培养基。 3.如权利要求1所述的一种植物开放式组培的培养基制作方法， 其特征在于： 所述凝胶 原料包括琼脂、 卡拉胶、 结冷胶、 果胶、 魔芋胶中的至少一种。 4.如权利要求3所述的一种植物开放式组培的培养基制作方法， 其特征在于： 所述热可 逆凝胶， 为下列成分的一种或几种复配； 琼脂。
6、用量0.2-1.5， 卡拉胶用量0.2-0.7， 结 冷胶用量0.04-0.4， 魔芋胶用量0.1-0.7， LM型果胶用量0.1-1.0， 黄原胶用量0.2- 0.7。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106718946 B 2 一种植物开放式组织培养的培养基制作方法 技术领域 0001 本发明涉及一种农林领域的植物组织培养育苗技术。 背景技术 0002 植物组织培养技术种苗生产、 脱除病毒、 种质改良等具有广阔的市场前景。 但由于 技术环节还存在不少问题， 组培成本太高， 是影响组培苗市场竞争力的主要因素之一。 植物 组培培养基添加丰富的有机无机营养物质， 为保证免受微生物污染，。
7、 培养基必须高压灭菌， 高压灭菌具有资金投入大、 能耗高等缺点。 近年引起兴趣的植物开放式组织培养， 是在培养 基添加抗菌剂， 不需高压灭菌， 在开放环境(不需超净台)接种， 开放组培在提高操作效率、 降 低组培成本意义重大 ， 相关专利申请日益增多 ， 如申请号200810047258 .1、 200910060484.8、 200910088122.X、 201010257107.6、 201110195928.6、 201110410305.6、 201110134608.X、 201110210244.9、 201110311185.4、 201110134616.4、 2013102。
8、38845.X、 201310204499.3、 201410097129.9、 201510151118.9、 201510024637.9等。 0003 开放式组培中， 虽然培养基中抗菌剂能抑制微生物污染， 但同时可能对所培养植 物生长发育有毒副作用， 这对矛盾是开放式组培的技术难点(关键)。 开放式组培培养基微 生物污染来自培养基自身所夹杂的微生物和瓶内空间的微生物。 从已经公开的资料来看， 抗菌组培培养基的抗菌剂只对固体培养基部分抗菌， 并不针对瓶内空间的微生物， 以致培 养基所附加抗菌剂必须保持在较高的浓度， 难免对所培养植物材料产生毒副作用， 该缺点 限制了开放式组培在植物育苗上的。
9、广泛应用。 发明内容 0004 本发明的主要目的在于提供一种开放式组培的培养基制作方法， 以解决背景技术 中的问题。 0005 本发明的技术方案如下： 0006 一种开放式组培的培养基制作方法， 包括如下步骤： 配制含抗菌剂的开放组培培 养基， 分装到培养瓶平放冷凝后， 在培养基表面灌注一凝胶保护层， 覆盖培养基表面； 所述 凝胶保护层的厚度为0.1-1cm， 凝胶为热可逆凝胶， 凝胶在凝胶保护层中的用量为0.04- 1.5； 凝胶保护层中包括抗菌剂、 营养成分、 激素和活性炭。 0007 所述抗菌剂包括抗生素、 防腐剂、 杀菌剂中的至少一种， 其总含量为0.02-0.5； 营养成分(氮、 磷。
10、、 钾、 钙、 镁、 硫、 铁、 维生素、 糖等)、 激素与培养基所添加营养成分、 激素相 同； 活性炭添加量为0.05-0.5。 0008 在本发明中， 抗生素种类包括多抗霉素、 武夷霉素、 链霉素、 青霉素、 氯霉素中的至 少一种， 用量分别为0.02-0.05。 0009 防腐剂包括山梨酸钾0.1-0.5、 对羟基苯甲酸丙酯钠0.03-0.3、 邻苯酚钠 0.03-0.3。 0010 杀菌剂包括次氯酸钠0.1-0.5、 六亚甲基四胺(乌洛托品)0.1-0.5， 十二烷基 说 明 书 1/3 页 3 CN 106718946 B 3 二甲基苄基溴化铵(新洁尔灭)0.02-0.2、 多菌灵0。
11、.03-0.3、 百菌清0.04-0.4、 甲基托 布津0.03-0.3、 代森锰锌0.08-0.5、 苦参碱0.05-0.3、 盐酸小檗碱0.1-0.5、 乙蒜素 0.05-0.3中的至少一种。 0011 在本发明中， 如用于灌注的溶胶因自然冷却凝滞时， 可加热溶化， 继续灌注培养 基。 0012 在本发明中， 所述凝胶原料包括琼脂、 卡拉胶、 结冷胶、 果胶、 魔芋胶中的至少一 种。 0013 在本发明中， 所述热可逆凝胶， 可一种或几种复配； 琼脂用量0.2-1.5， 卡拉胶 用量0.2-0.7， 结冷胶用量0.04-0.4， 魔芋胶用量0.1-0.7， LM型果胶用量0.1- 1.0，。
12、 黄原胶用量0.2-0.7。 0014 本发明提供了一种开放式组培的培养基制作方法， 采用天然热可逆水凝胶， 附加 抗菌剂、 营养成分和活性炭,与水混合加热融化， 灌注到凝固的开放组培培养基表面， 冷却 形成一薄凝胶层， 保护层透气良好， 对植物生长发育没有明显副作用。 其原理为： 由于开放 式组培的培养基污染微生物相当部分来自瓶内空间， 这些微生物沉降到含抗菌剂的保护层 表面， 繁殖受到抑制， 避免或减轻培养基遭受这些微生物侵染。 0015 本发明的有益效果为： 0016 (1)凝胶层所含抗菌剂浓度与一般开放组培所添加抗菌剂浓度相同， 但可使培养 基所添加的抗菌剂浓度(只抑制培养基自身所夹杂。
13、的微生物)较一般开放组培所添加抗菌 剂浓度(既要抑制培养基自身所夹杂的微生物， 又要抑制瓶内空间的微生物)来得低， 使得 对插入培养基的植物组织(如根等生长组织)伤害较小。 0017 (2)凝胶层添加活性炭吸附抗菌剂， 避免或减少抗菌剂渗透到培养基对培养物造 成伤害。 0018 (3)凝胶层含营养成分， 可供植物培养物生长。 这些都为开放式组培的成功应用创 造了有利条件。 0019 本发明针对开放式组培中培养基添加抗菌剂浓度即要能有效抑制微生物污染， 同 时对所培养植物没有明显毒副作用的技术难点， 应用本发明方法制作开放组培培养基所添 加的抗菌剂只(主要)用于抑制培养基内部夹杂微生物的繁殖， 。
14、有效降低培养基抗菌剂使用 浓度， 解决开放组培这一技术的共性问题， 该方法成本低廉、 操作简易， 具推广普及可行性。 具体实施方式 0020 实施例一 0021 1、 开放式组培培养基(对照组)制备， 玻璃培养瓶(底部直径6cm的罐头瓶)洗净， MS +6-BA 1.0ml/L+蔗糖3， 琼脂0.6， 抗菌剂山梨酸钾0.3和新洁尔灭0.1(经实验， 该 抗菌剂浓度为开放组培培养基不发生微生物污染的最低浓度)， 与水混合煮沸至完全溶解， 定容， 调pH5.6， 趁热分装到培养瓶， 平放冷却凝固。 0022 2.处理组开放组培培养基制备， 玻璃培养瓶(底部直径6cm的罐头瓶)洗净， MS+6- B。
15、A1.0ml/L+蔗糖3， 琼脂0.6， 抗菌剂山梨酸钾0.3， 高压灭菌后平放自然冷却。 凝胶层 成分同对照组培养基， 即MS+6-BA 1.0ml/L+蔗糖3+琼脂0.6+山梨酸钾0.3+新洁尔灭 0.1， 另附加活性炭0.1， 煮沸至完全融化， 冷凝前灌注到处理组开放组培培养基， 完全 说 明 书 2/3 页 4 CN 106718946 B 4 覆盖培养基表面， 溶胶层厚度约2mm， 加盖， 平放冷却凝固。 0023 3.接种室喷70酒精降尘， 紫外灯照射20min， 用70的酒精将接种台面和手擦干 净， 打开瓶盖接种铁皮石斛组培芽苗， 常规培养。 0024 4.对照(培养基未灌注凝胶。
16、)、 处理组(灌注琼脂凝胶薄层)培养40天， 培养基表面、 内部均未见有微生物菌落， 铁皮石斛长势(高度、 叶数、 颜色)也没显著差异。 0025 结论： 处理组培养基山梨酸钾浓度与对照相同， 少了新洁尔灭， 所以在培养基表面 灌注凝胶薄层， 可使在培养基添加较少抗菌剂情况下进行开放组培。 0026 实施例二 0027 1、 开放式组培培养基(对照组)制备， 650ml兰花瓶(底部直径8cm)， 培养基MS+ NAA0.5ml/L+6-BA 0.1ml/L+蔗糖2+10生香蕉泥(W/V)， 琼脂0.6， 抗菌剂次氯酸钠 0.2+六亚甲基四胺(乌洛托品)0.1， 与水混合加热至完全溶解， 定容，。
17、 调pH5.6， 趁热分 装到培养瓶， 平放冷却凝固。 0028 2、 处理组开放式组培培养基(同对照组， 即培养基添加次氯酸钠0.2+六亚甲基 四胺乌洛托品0.1)， 高压灭菌后平放自然冷却。 凝胶层制备方法： 卡拉胶0.5， 附加成分 MS+NAA 0.5ml/L+6-BA 0.1ml/L+蔗糖2+10生香蕉泥(W/V)， 抗菌剂次氯酸钠0.3+六 亚甲基四胺(乌洛托品)0.2， 活性炭0.1， 与水煮沸成溶胶， 冷凝前灌注到已经冷凝的琼 脂培养基， 铺满培养基表面， 溶胶层厚度约5mm， 加盖， 平放冷却凝固成凝胶薄层。 0029 3.接种室喷70酒精降尘， 紫外灯照射20min， 用7。
18、0的酒精将接种台面和手擦干 净， 打开瓶盖接种植物材料(铁皮石斛组培芽苗)， 常规培养。 0030 4、 对照(未灌注凝胶)培养基培养8天就有微生物菌落， 培养第40天， 培养基表面平 均每瓶有微生物菌落4.4个， 培养基内部未见有微生物菌落。 说明培养基添加次氯酸钠 0.2+六亚甲基四胺0.1， 不足以抑制开放组培培养基微生物污染(要成功进行开放式组 培， 无疑需添加较高的抗菌剂浓度)。 处理组(灌注凝胶薄层)培养第40天， 琼脂培养基表面、 内部均未见有微生物菌落， 说明有了凝胶保护层， 培养基添加次氯酸钠0.2+六亚甲基四 胺0.1就适合于进行开放式组培。 0031 由于本实施例设计的开放组培对照组和处理组培养基营养成分、 抗菌剂相同， 对 照组发生微生物污染， 而培养基表面灌注凝胶薄层能抑制污染， 使在培养基添加较低浓度 抗菌剂情况下进行开放组培成为可能。 说 明 书 3/3 页 5 CN 106718946 B 5 。