一种刺榆组培苗继代培养方法.pdf

本发明公开了一种刺榆组培苗继代培养方法，它按照以下步骤顺序进行：(1)刺榆外植体处理：将外植体枝条修剪、清洗，放到清水中催芽；(2)无菌苗的获得：将外植体枝条上萌发的腋芽通过消毒处理，接种到启动培养基中，获得无菌苗；(3)无菌苗的继代：将无菌苗转到继代培养基中进行继代培养，多次进行。本发明首次提供了刺榆组培快繁方法，通过添加椰子汁调节培养基中的营养成分，解决了刺榆组培苗多次继代后的黄化现象；显著提高继代培养的增殖系数；增加继代培养的继代次数，如果采用5代扩繁，1代生根交替进行的方法，理论上刺榆继代可以无限进行。降低了生产成本，为刺榆的规模化、工厂化生产提供可能。

1.一种刺榆组培苗继代培养方法，其特征在于：包括刺榆外植体处理、无菌苗的获得和无菌苗的继代，具体操作步骤如下:(1)外植体处理：将采集来的外植体进行预处理，去掉枯叶、烂叶，剪掉破损、坏死的枝条，放到1‰的洗衣粉溶液中浸泡10min，在流水下用细软的毛刷刷掉枝条表面灰尘，放到清水中进行催芽培养，每天更换一次清水，5天，枝条开始萌动，抽出新枝；(2)无菌苗的获得：当新枝长度大于3cm时，距离基部叶片0.2cm处将其剪下，贴叶柄修剪掉多余叶片，放到1％洗衣粉中浸泡5min，流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.02-0.1％升汞消毒6-16min，无菌水冲洗5-6次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到启动培养基中，7-12d后腋芽开始萌动，形成小芽，将大于2cm的芽转接到培养基中继续培养；所述启动培养基成分为：DKW+6-BA0.05-2.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0；(3)无菌苗的继代：将诱导获得的无菌苗在启动培养基上培养2-3代，增加无菌苗数量，挑选生长状态正常的刺榆种苗，接种到增殖培养基进行继代扩繁；利用顶芽、茎段进行繁殖，继代周期为26～30d，增殖系数可以达到7-8；所述增殖培养基成分为：改良DKW+6-BA0.01-1.0mg/L+KT0.01-1.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖25-30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0；所述步骤(3)中改良DKW培养基含有成分为：CaCl·2HO134-164mg/L；MgSO·7HO666-814mg/L；KNO1629-1991mg/L；(NH)SO1050-1284mg/L；KHPO239-292mg/L；Na·EDTA40.9-49.9mg/L；FeSO·7HO30.4-37.2mg/L；Ca(NO)·4HO1771-2165mg/L；HBO4.3-5.3mg/L；MnSO·4HO30.2-36.9mg/L；Zn(NO)·6HO15.3-18.7mg/L；NaMo·4HO0.35-0.43mg/L；CuSO·5HO0.23-0.28mg/L；肌醇90-110mg/L；烟酸0.9-1.1mg/L；盐酸硫胺素1.8-2.2mg/L；甘氨酸1.8-2.2mg/L。 2.根据权利要求1所述的一种刺榆组培苗继代培养方法，其特征在于：所述培养均在植物组培室，采用日光灯照射，白天和黑夜交替培养，光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。 3.根据权利要求1所述的一种刺榆组培苗继代培养方法，其特征在于：所述培养用的培养基均通过高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。

技术领域

本发明属于植物培植领域，涉及一种植物组织培养的方法，具体涉及一种刺榆组培苗继代培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

刺榆为榆科刺榆属落叶小乔木，高可达10～15米，或呈灌木状；喜光，耐寒，耐干旱瘠薄，各种土质易于生长，可作固沙树种。适应性强，萌蘖能力强，生长速度较慢。木材淡褐色，坚硬而细致，可供制农具及器具用；树皮纤维可作人造棉、绳索、麻袋的原料；嫩叶可作饮料；因树枝有棘刺，生长颇速，常成灌木状，故也是作绿篱用的树种。种子可榨油。

刺榆繁殖以种子繁殖为主，也可扦插和分株繁育。但是种子繁殖易发生性状变异，不利于保留母本优良性状；传统的无性繁殖方法又因繁殖系数低，成苗缓慢，不能提供大量苗木，限制了刺榆的推广。组织培养技术，选用优良单株作为外植体，保证了遗传性状的稳定，缩短其良种推广的周期,提升种苗质量,为市场上快速、大量提供刺榆优良苗木提供可能。

中国发明专利申请CN105660292A公开了“一种刺榆之嫁接方法”；专利申请CN101940604A公开了“刺榆不同提取物的降血脂和抗氧化活性及在医药中的应用”；专利申请CN105724158A公开了“一种刺榆苗之种植方法”。

综上所述，可见关于刺榆的研究较少，仅在提取物、种植方法和嫁接方法几个方面有少量研究，关于刺榆组培方面的研究几乎没有看到报道。因此，建立一种刺榆组培快繁方法，是目前对于刺榆研究急需解决的技术难题。本发明通过多次试验，摸索出了一种刺榆的继代培养方法，为市场上提供大量优质的刺榆苗木提供可能，也为刺榆组培的进一步研究提供理论借鉴。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种刺榆组培苗继代培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明解决刺榆组培方面研究的空白，该培养方法所得组培苗，增殖系数高且稳定，可多次继代，周期短，操作过程简单，能有效降低人工成本，利于大规模的工厂化生产。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种刺榆组培苗继代培养方法，其特征在于：包括刺榆外植体处理、无菌苗的获得和无菌苗的继代，具体操作步骤如下:

(1)外植体处理：将采集来的外植体进行预处理，去掉枯叶、烂叶，剪掉破损、坏死的枝条，放到1‰的洗衣粉溶液中浸泡10min，在流水下用细软的毛刷刷掉枝条表面灰尘，放到清水中进行催芽培养，每天更换一次清水，5d左右，枝条开始萌动，抽出新枝；

(2)无菌苗的获得：当新枝长度大于3cm时，距离新枝基部叶片0.2cm处将其剪下，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，放到1％洗衣粉中浸泡5min，流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.02-0.1％升汞消毒6-16min，无菌水冲洗5-6次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到启动培养基中，每瓶接种2株，7-12d后腋芽开始萌动，形成小芽，将大于2cm的芽转接到培养基中继续培养；所述启动培养基成分为：DKW+6-BA0.05-2.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0；

(3)无菌苗的继代：将诱导获得的无菌苗在启动培养基上培养2-3代，增加无菌苗数量，挑选生长健壮、叶片浓绿的无菌苗，接种到增殖培养基进行继代扩繁；利用顶芽、茎段进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1.0cm，至少含一个腋芽，继代周期为26～30d，增殖系数可以达到7-8；所述增殖培养基成分为：改良DKW+6-BA0.01-1.0mg/L+KT0.01-1.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖25-30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0。

作为本发明的一种限定，所述步骤(2)中以DKW为基础培养基，含有下列浓度的物质：0.05-2.0mg/L 6-BA、10-200mL/L椰汁、30g/L白砂糖、5.8-6.0g/L琼脂，pH:5.9-6.0。

作为本发明的一种限定，所述步骤(3)中改良DKW培养基含有成分为：

CaCl2·2H2O 134-164mg/L；MgSO4·7H2O 666-814mg/L；KNO3 1629-1991mg/L；(NH4)2SO41050-1284mg/L；KH2PO4239-292mg/L；Na2·EDTA 40.9-49.9mg/L；FeSO4·7H2O 30.4-37.2mg/L；Ca(NO3)2·4H2O1771-2165mg/L；H3BO3 4.3-5.3mg/L；MnSO4·4H2O 30.2-36.9mg/L；Zn(NO3)2·6H2O 15.3-18.7mg/L；Na2Mo·4H2O 0.35-0.43mg/L；CuSO4·5H2O 0.23-0.28mg/L；肌醇90-110mg/L；烟酸0.9-1.1mg/L；盐酸硫胺素1.8-2.2mg/L；甘氨酸1.8-2.2mg/L。

作为本发明的一种限定，所述步骤(3)中以改良DKW为基础培养基，含有下列浓度的物质：0.01-1.0mg/L 6-BA、0.01-1.0mg/L KT、10-200mL/L椰汁、25-30g/L白砂糖、5.8-6.0g/L琼脂，pH:5.9-6.0。

作为本发明的一种限定，所述培养均在植物组培室，采用日光灯照射，白天和黑夜交替培养，光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。

作为本发明的一种限定，所述培养用的培养基均通过高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。

本发明的有益效果：

由于采用了上述的技术方案，本发明所取得的技术进步在于：

1.采用绿枝催芽的方法获得新生枝条，降低了启动培养的污染率，成活率可以达到75％以上。接种到含有椰汁的DKW培养基上，7-12d腋芽开始萌动，萌动率达到85％以上，提高了获取有效无菌苗的数量。

2.采用本发明所提供的刺榆继代培养方法，控制继代周期26-30d，缩短了培养周期；增值系数可以达到7-8，并可以多代进行，降低了生产成本；通过改良DKW基本培养基，添加椰汁调节培养基营养成分，解决了刺榆组培过程中多次继代组培苗的黄化现象，为持续提供优质优良的刺榆种苗提供可能。

3.本发明适用于刺榆组培苗的继代培养。

附图说明

图1为添加椰汁培养基中植株生长状态图。

图2为不同浓度椰汁培养基中植株生长状态图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

图1为添加椰汁培养基中植株生长状态图。

图2为不同浓度椰汁培养基中植株生长状态图。

实施例1

一种刺榆继代培养方法，它按照以下步骤顺序进行：

(1)外植体处理：将采集来的外植体进行预处理，去掉枯叶、烂叶，剪掉破损、坏死的枝条，放到1‰的洗衣粉溶液中浸泡10min，在流水下用细软的毛刷刷掉枝条表面灰尘，放到清水中进行催芽培养，每天更换一次清水，5d左右，枝条开始萌动，抽出新枝。

(2)无菌苗的获得：当新枝长度大于3cm时，距离新枝基部叶片0.2cm处将其剪下，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，放到1％洗衣粉中浸泡5min，流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.02-0.1％升汞消毒6-16min，无菌水冲洗5-6次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到启动培养基中，每瓶接种2株，7-12d后腋芽开始萌动，形成小芽，将大于2cm的芽转接到培养基中继续培养。所述启动培养基成分为：DKW+6-BA0.05-2.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0。启动培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。启动培养20d，成活率75％，萌发率85％。

(3)无菌苗的继代：将诱导获得的无菌苗在启动培养基上培养2-3代，增加无菌苗数量，挑选生长健壮、叶片浓绿的无菌苗，接种到增殖培养基进行继代扩繁。利用顶芽、茎段进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1.0cm，至少含一个腋芽，继代周期为26～30d，增殖系数可以达到7-8。所述增殖培养基成分为：改良DKW+6-BA0.01-1.0mg/L+KT0.01-1.0mg/L+椰汁10-200mL/L+白砂糖25-30g/L+琼脂5.8-6.0g/L，pH:5.9-6.0。培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。

实施例2

继代培养基本培养基的优化。为了解决刺榆继代培养过程中组培苗的黄化问题，对继代培养的基本培养基进行改良优化，改良DKW母液的具体成分如下：

CaCl2·2H2O 134-164mg/L；MgSO4·7H2O 666-814mg/L；KNO3 1629-1991mg/L；(NH4)2SO41050-1284mg/L；KH2PO4239-292mg/L；Na2·EDTA 40.9-49.9mg/L；FeSO4·7H2O 30.4-37.2mg/L；Ca(NO3)2·4H2O1771-2165mg/L；H3BO3 4.3-5.3mg/L；MnSO4·4H2O 30.2-36.9mg/L；Zn(NO3)2·6H2O 15.3-18.7mg/L；Na2Mo·4H2O 0.35-0.43mg/L；CuSO4·5H2O 0.23-0.28mg/L；肌醇90-110mg/L；烟酸0.9-1.1mg/L；盐酸硫胺素1.8-2.2mg/L；甘氨酸1.8-2.2mg/L。

除了继代基本培养基替换成改良DKW母液外，其他步骤方法同实施例1，使用改良DKW为基本培养基，增殖系数达到7-10，且植株生长健壮，叶色、叶形正常，多次继代后植株叶片黄叶现象明显减少。

实施例3

继代培养基的筛选。以改良DKW为基本培养基，筛选不同浓度6-BA、KT、IBA对刺榆继代培养的影响。每个处理接种14瓶，每瓶接种10株，重复3次。试验方案如表1，除了添加激素与实例1不同外，其余方法步骤均与实施例1相同。

表1不同浓度6-BA、KT、IBA对刺榆继代培养的影响

试验号 BA(mg/L) KT(mg/L) IBA(mg/L) 增殖系数 生长状态 1 0.01 0.01 4.2 植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形 2 0.1 0.01 6.8 植株分枝较多，植株生长正常 3 1.0 0.01 9.6 植株分枝多，有玻璃化和叶片畸形 4 0.1 0.5 8.6 植株分枝较多，植株生长正常 5 0.1 1.0 8.5 植株分枝较多，生长正常，部分玻璃化 6 0.1 0.01 4.8 植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形 7 0.1 0.05 5.2 植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形

由表1可知，不同浓度6-BA、KT、IBA对刺榆继代培养的影响不同，影响效果大小分别为6-BA＞KT＞IBA，刺榆的增殖系数随着BA浓度的增加而增加，但当浓度过高时，植株易出现玻璃化现象；KT不同浓度间对刺榆的继代培养影响较小，可根据实际生产需要自行调节；IBA对刺榆继代培养影响较小。

实施例4

继代培养基的优化。为了解决刺榆继代培养过程中组培苗的黄化问题，在改良继代培养基本培养基DKW的基础上，又通过添加外源物质酸水解酪蛋白、香蕉、马铃薯、椰汁、活性炭和AgNO3等对继代培养基进一步优化。每个处理接种14瓶，每瓶接种10株，重复3次。试验方案如表2，除了添加外源与实例1不同外，其余方法步骤均与实施例1相同。

表2外源添加物质对刺榆组培苗黄化的影响

试验号 外源物质 增殖系数 生长状态 1 酸水解酪蛋白 3.2 植株叶片黄绿色，少量黄化、脱落 2 香蕉 1.8 植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重 3 马铃薯 0.8 植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重 4 椰汁 8.2 植株叶片鲜绿色、无畸形，生长健壮 5 活性炭 1.2 植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重 6 AgNO3 1.5 植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重

由表2可知，添加椰汁的培养基上刺榆植株叶片鲜绿色、无畸形，生长健壮，且增殖系数高，为8.2；其次是添加酸水解酪蛋白，可以减轻刺榆植株叶片的黄化现象，但是效果没有添加椰汁好，增殖系数也不高，为3.2；而添加香蕉、马铃薯、活性炭和AgNO3并不能改善刺榆组培苗的黄化现象，叶片黄化、脱落、死亡现象严重，植株基本无分枝。所以可以通过在刺榆继代培养基中添加椰汁使刺榆植株正常生长。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。