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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610189192.4 (22)申请日 2016.03.28 (71)申请人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市金州新区学府 大街10号 (72)发明人 刘庆平 路遥 林家彬 王仁军 (74)专利代理机构 大连八方知识产权代理有限 公司 21226 代理人 任洪成 (51)Int.Cl. A01K 67/02(2006.01) A23K 50/50(2016.01) A23K 20/158(2016.01) (54)发明名称 一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂。
2、肪肝 模型的方法 (57)摘要 本发明涉及非酒精性脂肪肝病动物模型的 建立， 具体为伴有严重血脂异常的一类高脂诱导 的非酒精性脂肪肝动物模型的建立。 选用SPF级 雄性AopE-/-小鼠和C57BL/6小鼠， 按照鼠种随机 分模型组和对照组， 共4组， 每组8只， 所有小鼠用 普通维持饲料适应性喂养1周后， 模型组给予高 脂饲料， 对照组给予对照饲料， 10周后取血处死， 检测常规血脂四项及肝功能； 取鲜活肝组织匀 浆， 测定组织内胆固醇与甘油三酯含量； 另取肝 组织做石蜡、 冰冻切片， 分别进行H.E.和油红O染 色， 判定NAFLD模型效果与质量。 本发明使用单纯 性高脂高热量饮食造模， 。
3、在很短的周期10周内造 出重度NAFLD模型， 模型血脂、 肝脏脂肪等指标稳 定性极好， 可重复性高， 为NAFLD高质量模型的建 立提供了一种可靠的方法。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105850868 A 2016.08.17 CN 105850868 A 1.一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法， 期特征在于， 建立模型的步 骤为： 1)、 选取鼠种： 分别选取SPF级雄性AopE-/-小鼠， 68周龄， 体重222g， SPF级雄性 C57BL/6小鼠， 68周龄， 体重222g， 饲养于本部屏障环境内， 温度2225， 湿度50， 12 小时昼夜交替。
4、， 适应性喂养1周； 2)、 分组与造模： 经适应性喂养1周后， 随机分四组， 其中AopE-/-小鼠两组， 命名为对照 组B和高脂组D， C57BL/6小鼠两组， 命名为对照组A和高脂组C， 每组8只； 造模10周， 期间对照 组喂食对照饲料， 高脂组喂食高脂饲料， 早晚各一次定量定投饲料， 保证40g/笼， 每笼4只小 鼠， 自由引水， 水源为SPF级的灭菌水， 每两周称量体重一次； 3)、 采血与检测： 造模10周后， 各组小鼠同一时间全部处死， 处死前禁食12小时， 4水 合氯醛腹腔注射麻醉， 摘眼球取血后， 全血37静置1小时， 4放置血块析出， 3000rmp离心 10min取上层。
5、血清， 全自动生化分析仪检测血清中的TC、 TG、 LDL-c、 HDL-c、 AST和ALT指标； 4)、 肝脏脂质的检测： 各组以一只小鼠为例， 分别各取100mg新鲜肝组织根据试剂盒自 带裂解液各加1ml进行匀浆， 各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯TG和总胆固醇TC的含量， 另一部分分别测定其蛋白含量， 最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯TG和总胆固醇 TC； 5)、 肝脏组织病理学的检测： 各组以一只小鼠为例， 取肝脏同一部位， 分两份， 一部分用 Bouin s固定液固定， 用作石蜡切片进行H.E.染色， 另一部分用4多聚甲醛固定液固定， 用 作冰冻切片进行油红O染色； 6)、 。
6、对步骤3)步骤5)进行分析， 确定利用ApoE-/-小鼠经高脂诱导成功建立了伴有严 重血脂异常的非酒精性脂肪肝NAFLD动物模型。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105850868 A 2 一种利用ApoE-/-小鼠建立非酒精性脂肪肝模型的方法 技术领域 0001 本发明涉及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型的建立， 具体为伴有严重血脂异 常的一类高脂诱导的非酒精性脂肪肝动物模型的建立。 背景技术 0002 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素以外， 导致肝细 胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。 NAFLD由一系列连续发展的疾病组成， 早 期。
7、仅发生单纯性脂肪肝(SFL)与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 随着病变的发展， 最终引发肝 组织的纤维化， 并导致肝硬化的形成。 同时NAFLD所引起的肥胖和血脂异常也是导致其他代 谢障碍性疾病的罪归祸首， 如动脉粥样硬化(AS)、 高血压和二型糖尿病等。 随着社会的进 步， 人们饮食结构发生了改变， 大批高脂肪， 高胆固醇， 高热量的食物进入了人们的餐桌， 伴 随而来的是我国脂肪肝发病率的不断提升， 已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病。 0003 人们常用各种手段来研究各种疾病， 其中最重要的方法之一就是构建动物模型。 为了更全面了解脂肪肝的发生过程， 已进行了许多临床研究。 然而， 。
8、NAFLD病情演变与发展 时间很长， 这很大程度上限制我们得到具有合理解释性的数据。 于是， 研究者将注意力转至 发展合适的动物模型方向来探明脂肪肝形成过程。 建立一个稳定可靠、 病理演变过程符合 的NAFLD动物模型， 对研究NAFLD的发病机制及治疗方法具有重要意义。 0004 现有的非酒精性脂肪肝动物模型类别繁杂， 动物选择上也各有长短， 啮齿类动物 多为SD大鼠、 wistar大鼠、 C57BL/6小鼠、 荷兰兔等， 非啮齿类动物包括猪、 犬等。 这些动物模 型虽能在一定程度上反应非酒精性脂肪肝发病进程， 但大都存在稳定性差， 成模周期长的 特点。 本文特别采用以C57BL/6为背景的。
9、ApoE-/-基因敲除鼠代替野生型C57BL/6作为研究 对象， ApoE-/-小鼠因为载脂蛋白E的缺乏， 导致先天性脂类代谢障碍， 小鼠每日摄入充足的 高脂食物不能及时代谢出体外， 造成脂质在肝脏的积累。 更重要的是， ApoE-/-小鼠模型出 现严重的血脂异常， 这是脂肪肝发展进程中的一个重要指标， 为进一步探讨NAFLD和心血管 疾病互为作用的发病机制， 提供了一种可靠的方法。 发明内容 0005 本发明提供一种利用ApoE-/-小鼠建立经高脂诱导的伴有严重血脂异常的单纯性 脂肪肝病变动物模型。 0006 本发明选用SPF级雄性AopE-/-小鼠和C57BL/6小鼠， 按照鼠种随机分模型。
10、组和对 照组， 共4组， 每组8只。 所有小鼠用普通维持饲料适应性喂养1周后， 模型组给予高脂饲料， 对照组给予对照饲料， 早晚各一次定量定投饲料， 保证40g/笼， 每笼4只小鼠。 10周后取血处 死， 检测常规血脂四项(TC、 TG、 LDL-c、 HDL-c)及肝功能(ALT和AST)； 取鲜活肝组织匀浆， 测 定组织内胆固醇与甘油三酯含量； 另取肝组织做石蜡、 冰冻切片， 分别进行H.E.和油红O染 色， 判定NAFLD模型效果与质量。 0007 本发明特点采用以C57BL/6为背景的ApoE-/-基因敲除鼠， 经高脂饮食诱导发展形 说 明 书 1/4 页 3 CN 105850868。
11、 A 3 成非酒精性脂肪肝模型。 ApoE-/-小鼠因为载脂蛋白E的缺乏， 导致先天性脂类代谢障碍， 使 得每日摄食的脂质不能在体内正常运输， 造成其在肝脏中的积累， 同时伴有严重的血脂异 常， 与NAFLD临床病理相似度极高。 C57BL/6小鼠在本发明中作为对照使用。 本发明方法中的 动物饲料为对照饲料(ND)和高脂饲料(HFD)均购自江苏美迪森生物医药有限公司。 本发明 方法中的SPF级雄性AopE-/-小鼠购自江苏省常州市卡文斯实验动物有限公司； SPF级雄性 C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 0008 本发明使用单纯性高脂高热量饮食造模， 亦可以在很短的周期1。
12、0周内， 造出重度 NAFLD模型。 更重要的是， 模型血脂、 肝脏脂肪等指标稳定性极好， 可重复性高。 为NAFLD高质 量模型的建立， 提供了一种可靠的方法。 附图说明 0009 图1是对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图(H.E.染色X400)； 0010 图2是对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图(H.E.染色X400)； 0011 图3是高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图(H.E.染色X400)； 0012 图4是高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图(H.E.染色X400)； 0013 图5是对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图(油。
13、红O染色X400)； 0014 图6是对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图(油红O染色X400)； 0015 图7是高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠肝脏病理切片图(油红O染色X400)； 0016 图8是高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠肝脏病理切片图(油红O染色X400)。 具体实施方式 0017 实施例1本发明动物模型的制备 0018 1、 实验动物： SPF级雄性AopE-/-小鼠， 68周龄， 体重(222)g， 购自江苏省常州 市卡文斯实验动物有限公司 【SCXK(苏)2011-003】 。 SPF级雄性C57BL/6小鼠， 68周龄， 体重 (222)g， 购自北京维通利华。
14、实验动物技术有限公司 【SCXK(京)2011-0011】 。 0019 2、 实验动物均饲养于本部屏障环境内， 温度2225， 湿度50， 12小时昼夜交 替。 0020 3、 实验动物经适应性喂养1周后， 随机分四组， 每组8只， 详细分组情况如下表1。 造 模10周， 早晚各一次定量定投饲料， 保证40g/笼， 每笼4只小鼠， 期间自由引水， 水源为SPF级 的灭菌水， 每两周称量体重一次。 动物饲料为对照饲料(MD12031)和高脂饲料(MD12032)均 购自江苏美迪森生物医药有限公司。 0021 表1动物详细分组 0022 说 明 书 2/4 页 4 CN 105850868 A 。
15、4 0023 4、 造模10周后， 各组小鼠同一时间全部处死， 处死前禁食12小时。 4水合氯醛腹 腔注射麻醉， 摘眼球取血后， 全血37静置1小时， 4放置血块析出， 3000rmp离心10min取 上层血清。 全自动生化分析仪检测血清中的TC、 TG、 LDL-c、 HDL-c、 AST和ALT等指标， 结果如 表2所示。 0024表2各组血清生化指标变化表(n6) 0025 0026 注： TC、 TG、 LDL-C和HDL-C单位为mmol/L， AST和ALT单位为U/L。 a： 与A组比较， P 0.01； b： 与B组比较， P0.01； c:与C组比较， P0.01。 0027。
16、 高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠组相较于其他三组TC、 TG和LDL-C均有极显著上升(P 0.01)； 高脂饲料喂养的C57BL/6小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组TC、 TG和 LDL-C均有极显著降上升(P0.01)但数值相较差距不大； 有趣的是同是对照饲料喂养的 AopE-/-小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组TC、 TG和LDL-C均有极显著降上升(P 0.01)且数值差距较大。 各组间血清中AST和ALT指标没有显著性差异， 显示出高脂诱导10 周， 各组肝脏没有较大损伤， 根据NAFLD病情发展判断， 本发明中模型应为单纯性脂肪肝。 以 上数据表明Ap。
17、oE-/-小鼠在血清脂质提升上的优势比较明显。 0028 5、 肝脏脂质的检测， 具体方法以一只小鼠为例， 分别各取100mg新鲜肝组织根据试 剂盒自带裂解液各加1ml进行匀浆， 各自匀浆液一部分用来检测甘油三酯(TG)和总胆固醇 (TC)的含量， 另一部分分别测定其蛋白含量， 最后必须用每毫克蛋白浓度来校正甘油三酯 (TG)和总胆固醇。 甘油三酯(组织)酶法测定试剂盒(E1013)和总胆固醇(组织)含量测定试 剂盒(E1015)购自北京普利莱基因技术有限公司。 结果如表3所示。 0029表3各组肝脏脂质变化表(n6) 0030 0031 注： TC和TG的单位为mmol/kg。 a： 与A组。
18、比较， P0.01； b： 与B组比较， P0.01； c:与C 组比较， P0.01。 0032 与血脂对应的是ApoE-/-小鼠肝脏脂质蓄积比较严重， 其中高脂饲料喂养的 AopE-/-小鼠组相较于其他三组， 肝脏TG和TC上升明显(P0.01)， 高脂饲料喂养的C57BL/6 小鼠组相较于对照饲料喂养的C57BL/6小鼠组肝脏TG和TC上升也是比较明显(P0.01)说明 说 明 书 3/4 页 5 CN 105850868 A 5 C57BL/6小鼠高脂诱导成功， 但效果逊于ApoE-/-小鼠。 0033 6、 肝脏组织病理学的检测， 具体方法以一只小鼠为例， 取肝脏同一部位， 分两份。。
19、 0034 6a、 一部分用Bouin s固定液固定， 用作石蜡切片进行H.E.染色。 0035 6b、 另一部分用4多聚甲醛固定液固定， 用作冰冻切片进行油红O染色。 0036 由病理切片可以看出， 对照饲料喂养的C57BL/6小鼠肝组织结构紧凑， 放射性肝锁 结构清晰， 细胞核质饱满(图1和5)； 对照饲料喂养的AopE-/-小鼠肝组织结构依旧清晰， 但 细胞外周已出现轻微的脂肪侵润， 应发展至轻度脂肪肝(图2和6)； 高脂饲料喂养的C57BL/6 小鼠组肝细胞内已发生脂肪病变， 出现空泡面积已达1/2以上， 应发展为中度脂肪肝(图3和 7)； 高脂饲料喂养的AopE-/-小鼠组， 已经出。
20、现严重的肝细胞脂肪弥漫集聚， 呈大脂滴样， 已 发展为重度脂肪肝(图4和8)。 进一步说明基因敲除ApoE-/-小鼠NAFLD模型的成功。 0037 综上所述， 利用ApoE-/-小鼠经高脂诱导成功建立了伴有严重血脂异常的非酒精 性脂肪肝NAFLD动物模型。 为研究NAFLD发病机理尤其是NAFLD与心血管疾病脂质代谢异常 所形成的相互作用提供了一种新型动物模型。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105850868 A 6 图1图2 图3图4 图5图6 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 105850868 A 7 图7 图8 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 105850868 A 8 。