技术领域
本发明涉及生物组培育苗技术领域，具体涉及一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法。
背景技术
草莓是蔷薇科草莓属宿根性多年生常绿草本植物，属于多倍体，是一种靠匍匐茎进行无性繁殖的作物，传统种苗培育的方法是采用匍匐茎繁殖的无性繁殖方式，效率较低，不利于优良品种的推广，而且极易感染病毒。我国已鉴定明确的草莓病毒有四种，即草莓斑驳病毒(SMOV)、草莓轻型黄边病毒(SMYEV)、草莓皱缩病毒(SCRV)和草莓镶脉病毒(SVBV)。种苗普遍感染病毒是草莓生产中的瓶颈问题，感染病毒的草莓比未感染病毒的草莓长势弱、抗性差、产量明显下降，果品品质与商品性状变劣。对于病毒病，目前还没有药剂可以治理，因此，培育无病毒母本苗，栽培无病毒苗木，是防治草莓病毒病的根本对策。目前，无病毒母本苗主要是通过草莓脱毒组培技术，即通过花药组织培养、微茎尖组织培养等技术脱去病毒病原获得无毒草莓再生植株，使草莓种苗恢复品种原种优良种性，以达到优质、高产之目的。然而草莓无病毒母本苗培育不易，组织培养的外植体选用有缺陷，培养过程中的条件控制不足等，就会造成脱毒效果差、污染、玻璃化、繁育系数低、移栽成活率不高等问题，给生产造成很大的损失。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，所用培养基配方简单，组培流程简便，脱毒率达到100％，繁育系数高，移栽成活率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，可进行产业化生产。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种利用组培技术培育草莓脱 毒苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：采集草莓植株未开放的花蕾，采用酒精和升汞灭菌处理后，剥开花蕾，取出花药，得外植体；
(2)丛生芽诱导：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养8—10天，再光照培养80—90天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充0.5—3.0mg/L TDZ、0.05—0.30mg/L IAA；
(3)丛生芽转接培养：将步骤(2)所得丛生芽转接至培养基M2中，培养15—25天，直至丛生芽长成3—5cm高的草莓幼苗，再将所述草莓幼苗转接至培养基M3中，进行生根培养，即得草莓脱毒苗；所述培养基M2为MS基本培养基，所述培养基M3为1/2MS基本培养基。
优选的，步骤(1)中，所述花蕾的灭菌条件为：先用75％酒精灭菌18—25s，再用0.1％升汞溶液灭菌12—15min。
更为优选的，步骤(1)中，所述花药的灭菌条件为：先用75％酒精灭菌20s，再用0.1％升汞溶液灭菌13min。
优选的，步骤(2)中，所述外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天。
优选的，步骤(2)中，所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.0—2.0mg/L TDZ、0.1—0.2mg/L IAA。
优选的，步骤(2)中，所述培养条件为光照强度2000—3000LX，光照时长16h/天，培养温度24—26℃。
优选的，步骤(3)中，所述丛生芽转接至培养基M2中，培养20天。
优选的，步骤(3)中，所述丛生芽在培养基M2中或所述草莓幼苗在培养基M3中的培养条件为：光照强度2000—3000LX，光照时长16h/天，培养温度24— 26℃。
优选的，步骤(1)中，所述草莓植株的品种为任意一种选自醉侠、雪妹、章姬、越丽。
本申请技术方案中，所述TDZ是一种植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等，可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，可用作植物组织培养。
所述IAA是吲哚乙酸，是一种植物生长激素，能够调节植物的生长，不仅能促进生长，而且具有抑制生长和器官建成的作用。在细胞水平上，可刺激形成层细胞分裂、刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长、促进木质部、韧皮部细胞分化、促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成，因此可用作植物组织培养。
所述MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
所述1/2MS基本培养基为MS基本培养基中，大量元素减半，其余不变形成的培养基。
本申请技术方案提供了一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，包括外植体选取及灭菌、丛生芽诱导、丛生芽转接培养的步骤，采用花药作为外植体进行组织培养，将花药接种于培养基M1进行培养时，先进行暗培养，再进行光照培养，光照培养至10天左右，开始出现愈伤组织，光照培养至40天左右，愈伤组织长至1cm左右，光照培养至60天左右，愈伤组织长至直径2—3cm大小，并有小芽点萌发，光照培养至80天左右，小芽点长出叶片，芽高2cm左右，将长出的芽转接至培养基M2中，直至芽长成3—5cm高的草莓幼苗，再转接至培养基M3进行生根培养， 即得完整的草莓脱毒组培苗。
本申请所述的雪妹品种，果形好、颜色靓、甜度高，易管理，与种植传统草莓相比，疏叶量小，不用疏花、蔬果，可节约人工20％；抗病性强、畸形果率低，可增产20％。
所述的章姬品种，果实整齐呈长圆锥形，果实健壮，色泽鲜艳光亮，香气怡人；果肉淡红色、细嫩多汁、浓甜美味、回味无穷，在日本被誉为草莓中的极品；坐果强，成熟早，不抗炭疽。
所述的醉侠品种，植株生长势强，匍匐茎发生量少，果实为深红色，果形好；丰产性好，果实呈长圆锥形，果形大，无沟，无畸形果，果实鲜红，光泽好，果肉白色，甜脆爽口；高抗灰霉病、白粉病及炭疽病。
所述的越丽品种，浅休眠、早熟、株型较紧凑；早期产量高，商品性好、品质与“红颊”品种相近；感炭疽病、抗白粉病。
上述草莓品种均可采用本申请技术方案所述的方法进行草莓脱毒苗的培育。
相比于现有组培技术，本申请技术方案所用培养基配方简单，组培流程简便，脱毒率达到100％，繁育系数高，移栽成活率高，幼苗整齐，便于后期统一的移栽和种植管理，降低了人工成本，可进行产业化生产。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，包括以下步骤：
(1)外植体选取及灭菌：采集品种为雪妹的草莓植株的未开放的花蕾，花蕾的大小在0.4—0.6mm，先用75％酒精灭菌20s，再用0.1％升汞溶液灭菌13min，取出花药，得外植体；
(2)丛生芽诱导：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.2mg/L IAA；
(3)丛生芽转接培养：将步骤(2)所得丛生芽转接至培养基M2中，培养20天，直至丛生芽长成3—5cm高的草莓幼苗，再将所述草莓幼苗转接至培养基M3中，进行生根培养，即得草莓脱毒苗；所述培养基M2为MS基本培养基，培养条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天，所述培养基M3为1/2MS基本培养基，培养条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，其愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为71.1％，丛生芽分化率为52.3％，脱毒率为100％，繁殖系数为7，植株成活率为92％。
实施例2
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(2)丛生芽诱导为：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L TDZ、0.1mg/L IAA。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，外植体接种于培养基M1中进行培养时，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为71.1％，丛生芽分化率为52.3％， 脱毒率为100％，繁殖系数为7，植株成活率为92％。
实施例3
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(2)丛生芽诱导为：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.0mg/L TDZ、0.2mg/L IAA。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，外植体接种于培养基M1中进行培养时，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为79.2％，丛生芽分化率为55.6％，脱毒率为100％，繁殖系数为8，植株成活率为95.6％。
实施例4
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(2)丛生芽诱导为：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L TDZ、0.1mg/L IAA。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，外植体接种于培养基M1中进行培养时，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为79.2％，丛生芽分化率为55.6％，脱毒率为100％，繁殖系数为8，植株成活率为95.6％。
实施例5
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(2)丛生芽诱导为：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L TDZ、0.2mg/L IAA。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，外植体接种于培养基M1中进行培养时，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为82.2％，丛生芽分化率为59.8％，脱毒率为100％，繁殖系数为7，植株成活率为96.7％。
实施例6
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(2)丛生芽诱导为：将步骤(1)所得外植体接种于培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/L TDZ、0.10mg/L IAA。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，外植体接种于培养基M1中进行培养时，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为83.6％，丛生芽分化率为60.5％，脱毒率为100％，繁殖系数为7，植株成活率为96.8％。
实施例7
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(1)外植体选取及灭菌为：采集品种为醉侠的草莓植株的未开放的花蕾，花蕾的大小在0.4—0.6mm，用75％酒精灭菌18s，再用0.1％升汞溶液灭菌12min，取出花药，得外植体。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为88.9％，丛生芽分化率为61.1％，脱毒率为100％，繁殖系数为8，植株成活率为100％。
实施例8
本实施例所述的一种利用组培技术培育草莓脱毒苗的方法，与实施例1所述方法的区别在于：
步骤(1)外植体选取及灭菌为：采集品种为越丽的草莓植株的未开放的花蕾，花蕾的大小在0.4—0.6mm，先用75％酒精灭菌25s，再用0.1％升汞溶液灭菌15min，取出花药，得外植体。
本实施例所述方法培育草莓脱毒苗，愈伤组织生成的时间为暗培养9天后再光照培养10天，光照培养60天左右出现芽点，培养80天左右芽点长至2cm左右，愈伤率为84.5％，丛生芽分化率为60.2％，脱毒率为100％，繁殖系数为7，植株成活率为97.2％。
实施例9
培养基M1中生长激素成分和浓度对培育的影响
取不同草莓品种(雪妹、越丽、醉侠、章姬)的生长情况一致的外植体若干，分别接种到培养基M1中，先暗培养9天，再光照培养80天，直至产生丛生芽，且丛生芽的芽高不小于2cm，培养的条件为培养光照2000—3000LX，培养温度24—26℃，光照时长16h/天；所述培养基M1采用的是MS基本培养基，补充一定的生长激素形成。在所述MS基本培养基相同的条件下，根据生长激素的成分和浓度进 行培养基编号，分别为A、B、C、D、E、F、G，具体编号情况见表1，观察并记录各草莓品种在各培养基中外植体的培养情况，培养结果见表2—5。
表1实施例9中各培养基的激素成分及浓度
培养基编号 TDZ(mg/L) IAA(mg/L) A -- 0.15 B 1.5 -- C 0.5 0.05 D 1.0 0.1 E 1.5 0.15 F 2.0 0.2 G 3.0 0.3
表2雪妹品种在各培养基中生长激素成分和浓度对培养的影响结果
A B C D E F G 接种数(颗) 18 18 18 18 18 18 18 愈伤数(个) 3 4 8 11 14 12 9 愈伤率(％) 16.7 22.2 44.4 61.1 77.8 66.7 50.0 丛生芽数(个) 0 0 1 5 11 4 3 分化率(％) 0.0 0.0 5.6 27.8 61.1 22.2 16.7 死亡数(颗) 15 14 10 7 4 6 9 死亡率(％) 83.3 77.8 55.6 38.9 22.2 33.3 50.0
表3越丽品种在各培养基中生长激素成分和浓度对培养的影响结果
表4醉侠品种在各培养基中生长激素成分和浓度对培养的影响结果
A B C D E F G 接种数(颗) 18 18 18 18 18 18 18 愈伤数(个) 1 2 4 10 16 11 6 愈伤率(％) 5.6 11.1 22.2 55.6 88.9 61.1 33.3 丛生芽数(个) 0 0 1 5 11 4 0 分化率(％) 0.0 0.0 5.6 27.8 61.1 22.2 0.0 死亡数(颗) 17 16 14 8 2 7 12 死亡率(％) 94.4 88.9 77.8 44.4 11.1 38.9 66.7
表5章姬品种在各培养基中生长激素成分和浓度对培养的影响结果
从以上数据可以看出，TDZ和IAA同时使用比单用其中一种更好，其愈伤率、丛生生芽分化率及植株成活率均要更高，其中TDZ在1.0—2.0mg/L，IAA在0.1—0.2mg/L时，特别是TDZ在1.5mg/L，IAA在0.15mg/L时其各项指标均较好，为本申请的优选方案。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。