技术领域
本发明属于一般植物种植技术领域，尤其涉及一种可克服蚕豆连作障碍的种植方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：蚕豆是世界上重要的豆科作物，因具粮食、蔬菜、饲料和绿肥兼用等特点，且适应性广而具有较高的固氮量，在世界范围内种植的国家超过70个，种植面积高达260万公顷。中国的蚕豆种植面积和产量居世界首位，蚕豆种植面积达105万公顷，占世界种植面积的59％，总产占世界蚕豆总产的61％。云南是中国最大的蚕豆主产区，云南蚕豆种植面积近年平均稳定在30万公顷以上，占全国蚕豆播种面积的1/3左右，在全省l16个县皆有种植。露天条件下，云南正反两季均可种植，鲜蚕豆上市时间可达5-6个月，目前已经成为国内最大的菜用蚕豆商品基地。蚕豆是典型的忌连作作物，近年来随着蚕豆生产的不断发展，加之种植习惯和环境条件等原因，主产区的连作障碍现象非常普遍且日益严重。而土传病害是导致连作障碍的重要因子之一，蚕豆连作种植中枯萎病的发生是威胁蚕豆生产最严重的病害之一，该病在德国、日本、英国等均有报道，在我国蚕豆主产区发病非常普遍，云南是枯萎病发生最重的省份。蚕豆枯萎病在整个生育期都有发生，造成根系腐烂、茎基部坏死直至植株萎蔫死亡，由于该病发生因素多，流行时间长，侵染过程复杂，发病后很难控制。蚕豆连作导致土传枯萎病普遍发生，严重制约了我国的蚕豆生产，目前生产中尚无有效的化学防治措施。合理间作不仅能显著增加作物产量，而且是持续控制病害的有效措施。长期以来，有关间作控制土传病害，缓解连作障碍的现象已经在大量研究中被观察到，而间套作缓解连作障碍的机理研究越来越受到人们的关注。然而现有的间作技术并不成熟，间作种植依旧停留在传统的种植模式并依靠个人经验种植的层面，蚕豆枯萎病连作障碍仍旧成为制约蚕豆产量的重要因素。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有的间作技术依靠个人经验种植的层面，蚕豆在连作过程中其根际土产生酚酸对蚕豆产生自感毒化效应造成蚕豆植株发生枯萎病，导致蚕豆产量低，降低蚕豆品质。
(2)现有的化学药剂只能对蚕豆的病虫害具有抑制效果而难以对自感毒化效应具有良好的预防和抑制作用，蚕豆因枯萎病而导致蚕豆产量降低。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可克服蚕豆连作障碍的种植方法。
本发明是这样实现的，一种混合液，所述混合液为小麦茎叶离心的上清液；每10g的小麦茎叶中加入100ml的去离子水得到浓度为0.1g/ml的混合液。
本发明的另一目的在于提供一种所述混合液的准备方法，所述混合液的准备方法包括：小麦成熟期采集小麦的茎叶，将小麦茎叶放置于烤箱中105℃杀青30min后65℃烘干至恒重、剪成1cm长的小段；将剪切好的小麦茎叶加入去离子水并恒温振荡2h，于室温浸提48h后三层纱布过滤，4000r/min离心10min，取上清液作为混合液母液，-20℃冰箱冷冻保存备用。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述混合液的可克服蚕豆连作障碍的种植方法，所述可克服蚕豆连作障碍的种植方法包括：选种、混合液制备、浸种、精细整地、播种、田间管理和收获。
进一步，所述浸种：将选好的蚕豆粒倒入盛放有制备的混合液的容器中浸泡，浸泡温度保持在25℃并浸泡1～2d。
进一步，所述精细整地：播种前将土块耙碎，地面耙平，开深沟高畦，畦宽1～2m，高25cm，沟宽35cm，整地亩撒施生石灰30kg，亩施基肥腐熟牛猪粪1000kg、过磷酸钙15kg、草木灰30kg。
进一步，所述播种：10月下旬～11月上旬进行播种，播种时将小麦粒条播，行距0.2m，蚕豆粒点播，行距0.3m，株距0.18m，小麦与蚕豆间作并按6行小麦2行蚕豆的方式种植。
进一步，所述田间管理：播种后1～2d浇一次跑马水使土壤湿润，种子出芽后以腐熟人粪尿兑中制备的混合液10倍浇施，3d一次；当幼苗长出5～6片真叶、高约6～9cm时，以腐熟人粪尿兑混合液10倍加复合肥每亩10kg浇施；蚕豆现蕾期、结荚期以施腐熟人粪尿兑混合液10倍加复合肥每亩10kg再次浇施；蚕豆盛花初荚期，亩施钙镁磷肥20-30kg、湿润的火土灰500kg。
进一步，还需对蚕豆进行：
打顶：第一次打顶应在冬至进行，摘除蚕豆植株主茎生长点；第二次打顶应在30％～40％的蚕豆植株开始形成第一豆荚时，摘除主茎嫩枝2-3cm；
病虫害控制：翌年3月下旬至4月上旬，每亩用生石灰和硫酸铜各0.5kg兑100kg制备的混合液制成波尔多液，晴天喷雾且每8-10天喷波尔多液1次，连续喷2～3次。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：利用小麦茎叶制备的混合液对蚕豆种植前浸种和种植中喷洒从而对蚕豆的枯萎病进行全过程的预防，消除蚕豆的连续障碍，同时该种植方法可得有效控制种植过程中病虫害对蚕豆生长的影响，利用小麦与蚕豆间作种植法进一步预防蚕豆连作时发生枯萎病的问题，提高蚕豆连作时的产量，使用本混合液以及间作方式可使蚕豆亩产增收20％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的可克服蚕豆连作障碍的种植方法流程图。
图2是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆枯萎病发病率的影响示意图；
图中：MF:蚕豆单作；IF:小麦蚕豆间作；i:发病初期；ii：发病盛期；iii：发病末期。
图3是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆枯萎病的病情指数的影响示意图；
图中：MF:蚕豆单作；IF:小麦蚕豆间作；i:发病初期；ii：发病盛期；iii：发病末期。
图4是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆根际微生物平均颜色变化率(AWCD)的影响示意图。
图5是本发明实施例提供的蚕豆单作条件下蚕豆根际微生物群落结构的主成分分析示意图。
图6是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆根际镰刀菌数量的影响示意图。
图7是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆枯萎病发病初期根际酚酸含量的影响示意图；
图中：1)对羟基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid；2)香草酸vanillic acid；3)丁香酸syringic acid；4)阿魏酸ferulic acid；5)苯甲酸benzoic acid；6)水杨酸salicylic acid；7)肉桂酸cinnamic acid ST:标准品Standards。
图8是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆枯萎病盛发期根际酚酸含量的影响示意图；
图中：1)对羟基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid；2)香草酸vanillic acid；3)丁香酸syringic acid；4)阿魏酸ferulic acid；5)苯甲酸benzoic acid；6)水杨酸salicylic acid；7)肉桂酸cinnamic acid ST:标准品Standards。
图9是本发明实施例提供的小麦与蚕豆间作对蚕豆枯萎病发病末期根际酚酸含量的影响示意图；
图中：1)对羟基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid；2)香草酸vanillic acid；3)丁香酸syringic acid；4)阿魏酸ferulic acid；5)苯甲酸benzoic acid；6)水杨酸salicylic acid；7)肉桂酸cinnamic acid ST:标准品Standards。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明突破了传统的经验种植法的制约，有效地消除了枯萎病对蚕豆连作障碍的影响，为蚕豆连作提供了一套切实有效的种植方法。
如图1所示，本发明实施例提供的可克服蚕豆枯萎病连作障碍的种植方法包括以下步骤：
S101：选种：选择产量高、品质优、抗病能力强、籽粒饱满、种皮壳亮且大小均匀一致的蚕豆粒和小麦粒；
S102：混合液制备：于小麦成熟期采集小麦的茎叶，将小麦茎叶放置于烤箱中105℃杀青30min后65℃烘干至恒重、剪成1cm长的小段；将剪切好的小麦茎叶加入去离子水并恒温振荡2h，于室温浸提48h后三层纱布过滤，4000r/min离心10min，取上清液作为混合液母液，-20℃冰箱冷冻保存备用；
S103：浸种：将选好的蚕豆粒倒入盛放有制备的混合液的容器中浸泡，浸泡温度保持在25℃并浸泡1～2d；
S104：精细整地：播种前将土块耙碎，地面耙平，开深沟高畦，畦宽1～2m，高25cm，沟宽35cm，整地亩撒施生石灰30kg，亩施基肥腐熟牛猪粪1000kg、过磷酸钙15kg、草木灰30kg；
S105：播种：10月下旬～11月上旬进行播种，播种时将小麦粒条播，行距0.2m，蚕豆粒点播，行距0.3m，株距0.18m，小麦与蚕豆间作并按6行小麦2行蚕豆的方式种植；
S106：田间管理：播种后1～2d浇一次跑马水使土壤湿润，种子出芽后以腐熟人粪尿兑制备的混合液10倍浇施，3d一次；当幼苗长出5～6片真叶、高约6～9cm时，以腐熟人粪尿兑混合液10倍加复合肥每亩10kg浇施；蚕豆现蕾期、结荚期以施腐熟人粪尿兑混合液10倍加复合肥每亩10kg再次浇施；蚕豆盛花初荚期，亩施钙镁磷肥20-30kg、湿润的火土灰500kg。
S107：收获。
步骤S102中，每10g的小麦茎叶中加入100ml的去离子水以得到浓度为0.1g/ml的混合液。
步骤S106中，还需对蚕豆进行
打顶：第一次打顶应在冬至进行，摘除蚕豆植株主茎生长点；第二次打顶应在30％～40％的蚕豆植株开始形成第一豆荚时，摘除主茎嫩枝2-3cm；
病虫害控制：翌年3月下旬至4月上旬，每亩用生石灰和硫酸铜各0.5kg兑100kg步骤S102中制备的混合液制成波尔多液，晴天喷雾且每8-10天喷波尔多液1次，连续喷2～3次。
下面结合具体实施例对本发明的应用效果做详细的描述。
一、混合液对蚕豆枯萎病的抑制
(1)混合液对蚕豆种子萌发的影响：挑选大小相当的蚕豆种子10粒放于铺有滤纸的培养皿(15cm)中，分别加入20mL C1(0.01g/ml)、C2(0.05g/ml)和C3(0.1g/ml)的混合液，以添加无菌水为对照CK，每处理重复3次；置于恒温光照培养箱中25℃培养7d，定期补充水浸液及无菌水，每天观察发芽情况，记录种子发芽数，当胚根突破种皮，长度为蚕豆种长度一半时计为发芽种子，5d后测定发芽势、一周后测定发芽率、胚根长，计算发芽指数，其计算公式如下：
1)发芽率G(Germinationpercentage)
G＝7天内供试种子的发芽数/供试种子数×100％；
2)发芽势GE(Germination energy)
GE＝5天内供试种子的发芽数/供试种子数×100％；
3)发芽指数GI(Index ofgermination)
GI＝∑(Gt/Dt)。式中Gt为在t日的种子发芽数，Dt为发芽天数。
(2)混合液对蚕豆幼苗生长的影响：挑选大小相当的蚕豆种子消毒催芽后，进行砂培至幼苗3叶期时移栽于Hoagland营养液中，4d后分别加入等量C1(0.01g/ml)、C2(0.05g/ml)和C3(0.1g/ml)的混合液培养，以添加无菌水为对照，每处理3次重复，每重复种植3株蚕豆；蚕豆移栽后30d后测定蚕豆叶片数、株高、最大叶长、单株鲜重和主根长。
二、小麦与蚕豆间作对蚕豆连作枯萎病的抑制作用
本实验设蚕豆单作(MF)和蚕豆与小麦间作(IF)2种种植模式，每个处理重复3次，随机区组排列，共6个小区，小区面积5.4m×6m＝32.4m2，小麦条播，行距0.2m，蚕豆点播，行距0.3m，株距0.15m。间作小区按6行小麦2行蚕豆的方式种植，间作小区内有3个小麦种植带和4个蚕豆种植带(每个间作小区的第1和第4个蚕豆带的最外1行不采样)；在整个试验田的四周均种植1m宽的蚕豆带作为保护行。
1)蚕豆枯萎病调查：于蚕豆枯萎病发病初期(蚕豆分枝期)、发病盛期(蚕豆开花期)和发病末期(蚕豆鼓荚期)进行调查，调查时单作小区按对角线法选5点，每点调查3株，每个小区共调查15株；间作小区在两个蚕豆带上选取5点(第一个带选2点，第二个带选3点)，每点调查3株，每个小区共调查15株；蚕豆枯萎病调查按5级分类标准进行。
2)土壤与植株取样：于病害调查的同时进行采样，即病害调查完的蚕豆植株即作为采样植株，蚕豆单间作处理的每个重复均采15株蚕豆，将15株蚕豆的根际土壤混合为1个样品。在田间取得的根际土样立即放入冰盒中保存，用于土壤微生物代谢功能多样性、镰刀菌数量和酚酸含量测定。
3)土壤微生物代谢功能多样性分析：土壤微生物代谢功能多样性采用Biolog ECO板(ECO MicroPlate)进行测定。称取相当于5g烘干土的新鲜土样加入45mL无菌的0.85％NaC1溶液中，在摇床上振荡30min，将土壤样品稀释至10-3，吸取150μL稀释液至ECO板的微孔中。将接种好的测试板加盖置于25℃下培养，每隔24h在自动读盘机上用Biolog Reader4.2软件(Biolog，Hayward，CA，USA)读取590nm波长的光密度值，培养时间为192h。采用培养144h的数据计算单孔平均颜色变化率(average well color development，AWCD)、Shannon多样性指数(H)和丰富度指数(S)。
AWCD＝Σ(Ci-R)/31，式中：Ci为各反应孔在590nm下的光密度值；R为ECO板对照孔的光密度值；Ci–R小于0的孔在计算中均记为零，即Ci–R的值均大于等于0；
Shannon多样性指数(H)：H＝-ΣPilnPi，式中，Pi＝(Ci–R)/Σ(Ci–R)；
群落丰富度指数(S)用碳源代谢孔的数目表示。
镰刀菌数量测定：计数参照Booth的方法选择PCNB培养基进行培养。称取待测根际土10g，放入装有90mL无菌水的三角瓶中，振荡30min，将样品稀释至10-3，吸取100uL菌悬液加入到冷却的PCNB培养基中，刮匀，置于28℃黑暗条件下培养3d后计数，计算镰刀菌数量。
根际土中酚酸组分与含量测定：将田间取得的根际土30g放入盛有200ml提取液(pH5.6，包括200μmol/ml的MgCl2、100μmol/ml的KCl、600μmol/ml的CaCl2和5μmol/ml的H3BO3)的容器中浸提1h，其间多次振摇；静置后取上清液液约20ml放入50ml离心管中，立即加入2～3滴微生物抑制剂(浓度为98％的浓磷酸，可抑制微生物活性，消除微生物分解溶液中的有机组分)，用冷冻干燥仪浓缩至干粉状；测定前加水稀释至1ml，过0.45μm膜，用高效液相色谱(Agilent1260Infinity)分析测定酚酸的含量；以香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、水杨酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸(色谱纯)为标准品。高效液相色谱检测条件为色谱柱：Kinetex柱，2.6μm，4.6×100mm，柱温30℃；进样量10μL，280nm DAD检测器，流速0.5ml/min，流动相：A＝甲醇(色谱级)，B＝0.1％磷酸-水，分离条件：流动相B80％(0min)→5％(15.0min)→5％(18.0min)→80％(18.5min)→0％(20.0min)→停止(25.0min)进行梯度洗脱；根据保留时间来确定酚酸类物质种类，通过外标法计算出各酚酸的含量。
三、数据分析
(1)小麦混合液对蚕豆枯萎病的抑制作用
表1小麦植株混合液对蚕豆种子萌发的影响
表2小麦植株混合液对蚕豆幼苗生长的影响
由表1可以看出小麦的茎叶混合液对蚕豆种子萌发具有显著的化感促进作用，且随浓度增加，化感促进作用增加，尤其在C3(0.1g/ml)浓度下，小麦植株混合液的化感促进效应最强；
由表2可以看出小麦的茎叶混合液对蚕豆幼苗生长具有显著的化感促进作用，且随处理浓度增加，化感促进作用呈先增强后减弱的趋势。
(2)小麦与蚕豆间作对蚕豆连作枯萎病的抑制作用
表3小麦与蚕豆间作对蚕豆根际微生物多样性指数和丰富度指数的影响
从表3中可看出，间作显著提高了蚕豆根际微生物的Shannon多样性指数(p<0.05)和丰富度指数(p<0.01)；发病初期、发病盛期和发病末期，间作使蚕豆根际微生物的H分别比单作显著提高5.3％、4.4％和5.3％。发病盛期和发病末期间作使蚕豆根际微生物的S分别比单作显著提高19.4％和37.1％，而发病初期间作蚕豆根际微生物的S比单作显著降低10.7％。
从图2和图3中可以看出，3个发病期，间作蚕豆枯萎病发病率均低于单作，但单间作间差异不显著。间作对蚕豆枯萎病病情指数具有显著影响，表现为不同发病时期影响不同；发病初期，间作降低了蚕豆枯萎病的病情指数，但单间作处理间差异不显著；发病盛期和发病末期，与单作相比，间作使蚕豆枯萎病的病情指数显著降低15.8％和22.8％。
从图4中可看出，3个发病时期，以发病盛期的微生物活性最高，其次为发病末期，而发病初期的微生物活性最低；发病初期，间作蚕豆根际微生物活性低于单作，而发病盛期和发病末期间作蚕豆根际微生物的活性均高于单作，并以发病末期单间作处理间蚕豆根际微生物活性差异最大，但3个发病时期单间作间差异未达到显著水平。
从图5中可以看出，3个发病时期，小麦与蚕豆间作对蚕豆根际微生物群落结构均有明显影响。发病初期，单作蚕豆和间作蚕豆主要在PC2上有较好的分离，而发病盛期和发病末期，单间作蚕豆根际微生物群落均是在PC1上有较好的分离。表明间作明显改变了蚕豆根际微生物的群落结构，但由于PC1的方差贡献率大于PC2，表明间作对蚕豆根际微生物群落结构的影响以发病盛期和发病末期的影响大于发病初期。
从图6中可以看出，发病初期，间作对蚕豆根际镰刀菌数量有降低的趋势，但差异未达到显著水平。发病盛期和发病末期，间作使蚕豆根际镰刀菌数量比单作显著降低53.8％和33.1％。
表4小麦与蚕豆间作对蚕豆根际酚酸含量的影响(μg/g)
结合图7、图8、图9和表4可以看出，从蚕豆根际土壤中检测出7种酚酸，分别是对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、水杨酸和肉桂酸(图7、图8和图9)。从3个发病时期根际土壤中酚酸含量来看，随发病时期的推进，蚕豆根际土壤中酚酸含量逐渐增加，在发病末期达到较高的含量。从土壤中不同种类酚酸含量来看，总体上以肉桂酸、对羟基苯甲酸、水杨酸和阿魏酸含量较高，而香草酸、丁香酸和苯甲酸含量较低(表4)。
发病初期，与单作相比，间作除显著降低了丁香酸含量外，其他酚酸含量在单间作处理间均无显著差异。发病盛期，与单作相比，小麦与蚕豆间作分别使蚕豆根际对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸含量显著降低43.9％、70.3％、56.7％、46.8％和21.1％，而丁香酸含量在单间作处理间无显著差异，间作蚕豆根际土壤中水杨酸含量比单作增加77.40％。
发病末期，与单作相比，小麦与蚕豆间作使蚕豆根际对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸含量分别显著降低32.9％、55.9％、70.6％、79.7％、55.7％和46.6％，而水杨酸含量在单间作处理间无显著差异。
小麦茎叶混合液对蚕豆自毒效应具有缓解效果，蚕豆种植前浸种可对蚕豆种子萌发以及幼苗生长过程中对蚕豆枯萎病的发生具有预防作用，同时混合液的浓度在0.1g/ml时对蚕豆种子的萌发以及幼苗的发育促进作用最大；
小麦与蚕豆间作显著提高了蚕豆根际微生物的活性和多样性，降低了蚕豆根际土壤中酚酸含量，减少土壤镰刀菌的数量，降低了枯萎病的危害程度，可减少蚕豆连作时枯萎病对其产量的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。