一种白血病治疗用的细胞冻存液.pdf

摘要
申请专利号：	CN201810543073.3	申请日：	20160104
公开号：	CN108651443A	公开日：	20181016
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A01N1/02,C07K7/08	主分类号：	A01N1/02,C07K7/08
申请人：	潘时辉
发明人：	潘时辉
地址：	710069 陕西省西安市太白北路229号西北大学
优先权：	CN201810543073A,CN201610003802A
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内容摘要

本发明提供了一种细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。本发明提供的细胞冻存液用于冻存培养细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。具有较好的应用前景。

权利要求书

1.一种细胞冻存液，其特征在于，由如下各组分组成：二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF1％w/v，维生素E1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。 2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：所述多肽序列为SEQIDNO:3-16所示。 3.权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的组分，得到所述的冻存液。 4.权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液在提高冻存细胞复苏后存活率中的应用。 5.一种多肽，其特征在于：序列如SEQIDNO:3-16所示。

说明书

技术领域

本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。虽然该细胞利用广泛，但要广泛地应用于临床治疗领域，其来源和数量仍远远不能满足需求。因此神经干细胞的体外大规模扩增，以及将扩增后的细胞进行冷冻保存，是本领域技术人员迫切的需求。

白血病是危害人类的重要的肿瘤之一，在白血病治疗和研究中，对于白血病干细胞的瞬时需求量很大，而传统的分离方法不可能马上获得，因此，批量贮存，一起取出应用是必要的，但是常规的贮存方法效果不好，而冷冻的方法却有很大的局限性。这是因为细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。影响冻存效率的因素主要有：细胞浓度、冷冻速率以及冻存液。目前，干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的干细胞，开展有效的干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存干细胞的方法对于促进神经干细胞的研宄和应用具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有:二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-16任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为LD-1、LD-3、LD-4、LD-5、LD-8、LD-9、LD-10、LD-13、LD-15、LD-16、LD-21、LD-23、LD-25、LD-27、LD-28、LD-30，其依次对应于SEQ ID NO：1-16。

在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素E和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。

本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。

本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括以下步骤:

A.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；

B.细胞悬液制备:培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；

C.冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；

D.细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍DMEM液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细胞/ml-1010细胞/ml。

本发明的有益效果:

本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达99％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。

本发明的干细胞冻存液可以长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。

本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。

具体实施方式

实施例1细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例3细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例4细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。

实施例5细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例6细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例7细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：7所示。

实施例8细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：8所示。

实施例9细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：9所示。

实施例10细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：10所示。

实施例11细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：11所示。

实施例12细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：12所示。

实施例13细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：13所示。

实施例14细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：14所示。

实施例15细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：15所示。

实施例16细胞冻存液的制备

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO：16所示。

比较例1

分别量取70ml的MEM细胞培养液、20ml的小牛血清、I0ml的二甲基亚砜，混合制得常规细胞冻存液。

比较例2

将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

实施例17冻存液的效果验证

以上实施例1-16及比较例II所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。

细胞冻存过程:

培养生长成单层的人白血病干细胞，其细胞密度约6*109个/ml，加入pH7.0的PBS洗细胞表面一次。

将细胞用0.20％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入实施例1-3和比较例1所制备的冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；

冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；分别冻存1周，4个月，8个月。每组3个重复。

细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍DMEM液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次，计算细胞存活率。结果如下：

取8个月的冻存细胞，进行细胞分化培养，其中所述的细胞能够正常进行分化，分化效率达到91.5％，而比较例1取出的细胞其分化率只能达到59.4％,说明细胞活性收到很大的影响。

序列表

<110> 潘时辉

<120> 一种白血病治疗用的细胞冻存液

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Ser Pro Arg Lys Gly Thr His His Thr Pro Lys Arg Pro His Lys Met

1 5 10 15

Ser Phe His

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Thr Gly Asn Met His His Leu Cys Val Asp Leu Val Arg Trp Glu Met

1 5 10 15

Arg Lys

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Pro Arg Gln Ser Tyr Gln Arg Glu Glu Ala Glu Ser Thr Cys Met Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Gln Gly Ser Phe Leu Arg Pro Val Pro Ala Arg Val Leu Gln Asp Trp

1 5 10 15

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Ser Trp Leu Arg His Ala Asp Lys Arg Phe Arg Lys Arg Arg Ser Pro

1 5 10 15

Thr Val Ile

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Gln Lys His Ile Asp Pro Arg Asn Met His Pro Ile Met Leu Ala Ser

1 5 10 15

Met Lys

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

Ser Ser His Arg Tyr Lys Ser Tyr Gln Gly Phe Leu Val Asp Trp Thr

1 5 10 15

Trp

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

Thr Trp Gln His Gln Arg Glu Arg Gln Ser Trp Ile Pro Pro Val Trp

1 5 10 15

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

Ala Pro Pro Met Ala Val Leu Phe Lys Leu Cys Arg Gln Gly Trp Gly

1 5 10 15

Thr Gln Met

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

Ser Tyr Pro His Trp His Arg Thr Leu Glu Phe Pro Ile His Cys Asp

1 5 10 15

Ala Thr

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

Phe Cys Val Leu Tyr Gly Thr Ser His Val Pro Ile Gly Trp Glu Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

Trp Ser Tyr Gln His Pro Tyr Arg Cys Arg Lys Glu Arg Asp Ser Trp

1 5 10 15

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

Asp Ser Gly Glu Asp Ser Thr Pro Ile Glu His Gln Ser Gly Tyr Lys

1 5 10 15

Cys Pro Tyr

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

His Tyr Tyr Arg Gln Lys Met Pro His Cys Phe Pro Met Arg Lys Leu

1 5 10 15

Glu Trp

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

Asp Leu Asn Thr Arg Ser Ser Ile Gly Asp Lys Thr Thr Ala Met Met

1 5 10 15

Ser

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 16

Trp Glu Gln Ser Ile Arg Pro Ser Cys Gly Ala Thr Ser Gln Phe Asp

1 5 10 15

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810543073.3 (22)申请日 2016.01.04 (62)分案原申请数据 201610003802.7 2016.01.04 (71)申请人潘时辉地址 710069 陕西省西安市太白北路229号西北大学 (72)发明人潘时辉 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) C07K 7/08(2006.01) (54)发明名称一种白血病治疗用的细胞冻存液 (57)摘要本发明提供了一种细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括二甲基亚砜。

2、5w/v， 0.5 w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF1w/v，维生素E1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。本发明提供的细胞冻存液用于冻存培养细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。具有较好的应用前景。权利要求书1页说明书5页序列表4页 CN 108651443 A 2018.10.16 CN 108651443 A 1.一种细胞冻存液，其特征在于，由如下各组分组成：二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， b。

3、FGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。 2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于：所述多肽序列为SEQ ID NO:3-16所示。 3.权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括混合所述配方比例的组分，得到所述的冻存液。 4.权利要求1-2任一项所述的细胞冻存液在提高冻存细胞复苏后存活率中的应用。 5.一种多肽，其特征在于：序列如SEQ ID NO:3-16所示。权利要求书 1/1 页 2 CN 108651443 A 2 一种白血病治疗用的细胞冻存液技术领域 0001 。

4、本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。背景技术 0002 干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为 “万用细胞” 。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。虽然该细胞利用广泛，但要广泛地应。

5、用于临床治疗领域，其来源和数量仍远远不能满足需求。因此神经干细胞的体外大规模扩增，以及将扩增后的细胞进行冷冻保存，是本领域技术人员迫切的需求。 0003 白血病是危害人类的重要的肿瘤之一，在白血病治疗和研究中，对于白血病干细胞的瞬时需求量很大，而传统的分离方法不可能马上获得，因此，批量贮存，一起取出应用是必要的，但是常规的贮存方法效果不好，而冷冻的方法却有很大的局限性。这是因为细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。影响冻存效率的因素主要有：细胞浓度、冷冻速率以及冻存液。目前，干细胞冻存使用的冻存液有。

6、含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是， DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的干细胞，开展有效的干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存干细胞的方法对于促进神经干细胞的研宄和应用具有重大意义。发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。 0005 本发明。

7、的技术方案如下： 0006 一种细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有: 二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至 100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO： 1-16任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为LD-1、 LD-3、 LD-4、 LD-5、 LD-8、 LD-9、 LD-10、 LD-13、 LD-15、 LD。

8、-16、 LD-21、 LD-23、 LD-25、 LD-27、 LD-28、 LD-30，其依次对应于SEQ ID NO： 1-16。说明书 1/5 页 3 CN 108651443 A 3 0007 在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素E和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。 0008 本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。 0009 本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括以下步骤: 0010 A.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分。

9、按照相应的比例混合即可获得； 0011 B.细胞悬液制备:培养生长成单层的神经细胞一瓶， 0.20胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内； 0012 C.冷冻:先将冻存管在4下冻存30min，然后放入-30冻存lh，再放入-80冻存 3h，最后移入液氮中保存； 0013 D.细胞复苏:取出冻存管快速置于37水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用 5倍DMEM液稀释， 1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度。

10、为 108细胞/ml-1010细胞/ml。 0014 本发明的有益效果: 0015 本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达99以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。 0016 本发明的干细胞冻存液可以长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。 0017 本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。具体实施方式 0018 实施例1细胞冻存液的制备 0019 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/。

11、v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 1所示。 0020 实施例2细胞冻存液的制备 0021 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 2所示。 0022 实施例3细胞冻存液的制备 0023 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFG。

12、F 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 3所示。 0024 实施例4细胞冻存液的制备 0025 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 4所示。 0026 实施例5细胞冻存液的制备说明书 2/5 页 4 CN 108651443 A 4 0027 将二甲基亚砜5w/。

13、v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 5所示。 0028 实施例6细胞冻存液的制备 0029 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 6所示。 0030 实施例7细胞冻存液的制。

14、备 0031 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 7所示。 0032 实施例8细胞冻存液的制备 0033 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 8所示。。

15、0034 实施例9细胞冻存液的制备 0035 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 9所示。 0036 实施例10细胞冻存液的制备 0037 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列。

16、如SEQ ID NO： 10所示。 0038 实施例11细胞冻存液的制备 0039 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 11所示。 0040 实施例12细胞冻存液的制备 0041 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例。

17、定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 12所示。 0042 实施例13细胞冻存液的制备 0043 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 13所示。 0044 实施例14细胞冻存液的制备 0045 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用。

18、DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 14所示。说明书 3/5 页 5 CN 108651443 A 5 0046 实施例15细胞冻存液的制备 0047 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 15所示。 0048 实施例16细胞冻存液的制备 0049 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1。

19、w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂，多肽1w/v， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO： 16所示。 0050 比较例1 0051 分别量取70ml的MEM细胞培养液、 20ml的小牛血清、 I0ml的二甲基亚砜，混合制得常规细胞冻存液。 0052 比较例2 0053 将二甲基亚砜5w/v， 0.5w/v低密度脂蛋白， 1w/v的海藻糖， 1w/v卵磷脂， bFGF 1w/v，维生素E 1w/v，最后用DMEM培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至 100ml。 0054。

20、实施例17冻存液的效果验证 0055 以上实施例1-16及比较例II所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。 0056 细胞冻存过程: 0057 培养生长成单层的人白血病干细胞，其细胞密度约6*109个/ml，加入pH7.0的PBS 洗细胞表面一次。 0058 将细胞用0.20胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入实施例1-3和比较例1所制备的冻存液 2ml，混均，置入无菌的冻存管内； 0059 冷冻:先将冻存管在4下冻存30min，然后放入-30冻存lh，再放入。

21、-80冻存 3h，最后移入液氮中保存；分别冻存1周， 4个月， 8个月。每组3个重复。 0060 细胞复苏:取出冻存管快速置于37水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5 倍DMEM液稀释， 1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次，计算细胞存活率。结果如下：说明书 4/5 页 6 CN 108651443 A 6 0061 0062 取8个月的冻存细胞，进行细胞分化培养，其中所述的细胞能够正常进行分化，分化效率达到91.5，而比较例1取出的细胞其分化率只能达到59.4,说明细胞活性收到很大的影响。说明书 5/5 页 7 CN 1086。

22、51443 A 7 序列表潘时辉一种白血病治疗用的细胞冻存液 16 SIPOSequenceListing 1.0 1 19 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 1 Ser Pro Arg Lys Gly Thr His His Thr Pro Lys Arg Pro His Lys Met 1 5 10 15 Ser Phe His 2 18 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 2 Thr Gly Asn Met His His 。

23、Leu Cys Val Asp Leu Val Arg Trp Glu Met 1 5 10 15 Arg Lys 3 17 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 3 Pro Arg Gln Ser Tyr Gln Arg Glu Glu Ala Glu Ser Thr Cys Met Glu 1 5 10 15 Gly 4 16 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 4 Gln Gly Ser Phe Leu Arg Pro Val Pr。

24、o Ala Arg Val Leu Gln Asp Trp 1 5 10 15 5 19 序列表 1/4 页 8 CN 108651443 A 8 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 5 Ser Trp Leu Arg His Ala Asp Lys Arg Phe Arg Lys Arg Arg Ser Pro 1 5 10 15 Thr Val Ile 6 18 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 6 Gln Lys His I。

25、le Asp Pro Arg Asn Met His Pro Ile Met Leu Ala Ser 1 5 10 15 Met Lys 7 17 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 7 Ser Ser His Arg Tyr Lys Ser Tyr Gln Gly Phe Leu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Trp 8 16 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 8 Thr Trp Gln His Gln Arg。

26、 Glu Arg Gln Ser Trp Ile Pro Pro Val Trp 1 5 10 15 9 19 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 9 Ala Pro Pro Met Ala Val Leu Phe Lys Leu Cys Arg Gln Gly Trp Gly 1 5 10 15 Thr Gln Met 10 18 序列表 2/4 页 9 CN 108651443 A 9 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 10 。

27、Ser Tyr Pro His Trp His Arg Thr Leu Glu Phe Pro Ile His Cys Asp 1 5 10 15 Ala Thr 11 17 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 11 Phe Cys Val Leu Tyr Gly Thr Ser His Val Pro Ile Gly Trp Glu Lys 1 5 10 15 Ala 12 16 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 12 Trp Se。

28、r Tyr Gln His Pro Tyr Arg Cys Arg Lys Glu Arg Asp Ser Trp 1 5 10 15 13 19 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 13 Asp Ser Gly Glu Asp Ser Thr Pro Ile Glu His Gln Ser Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Cys Pro Tyr 14 18 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 14 His Tyr Tyr 。

29、Arg Gln Lys Met Pro His Cys Phe Pro Met Arg Lys Leu 1 5 10 15 Glu Trp 15 17 序列表 3/4 页 10 CN 108651443 A 10 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 15 Asp Leu Asn Thr Arg Ser Ser Ile Gly Asp Lys Thr Thr Ala Met Met 1 5 10 15 Ser 16 16 PRT 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum) 16 Trp Glu Gln Ser Ile Arg Pro Ser Cys Gly Ala Thr Ser Gln Phe Asp 1 5 10 15 序列表 4/4 页 11 CN 108651443 A 11 。

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