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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711200147.5 (22)申请日 2017.11.27 (71)申请人 中国热带农业科学院热带生物技术 研究所 地址 570000 海南省海口市龙华区学院路4 号 申请人 儋州牧春绿色生态农业开发有限公 司 (72)发明人 李瑞梅 林才伟 姚远 郭建春 刘姣 符少萍 段瑞军 (74)专利代理机构 北京卓特专利代理事务所 (普通合伙) 11572 代理人 段宇 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种巨菌草人工种子制作方法 (。
2、57)摘要 本发明公开了一种巨菌草人工种子制作方 法， 包括以下步骤： S1， 外植体取材： 用小刀将巨 菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； S2， 外植 体消毒： 将腋芽消毒后， 清洗后晾干备用； S3， 种 芽修整： 用小刀修切去上端及不规则部分， 用于 人工种子制备； S4， 人工胚乳成分制备： 取海藻酸 钠、 MS培养基、 萘乙酸、 吲哚丁酸、 蔗糖和活性炭 混合， 灭菌后备用； S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚 乳凝胶溶液注入离心管内， 注入CaCl2溶液， 固化 后形成巨菌草种芽胶囊； S6， 人工种皮成分及制 备： 取海藻酸钠、 普鲁兰多糖和羧甲基纤维素钠 混合， 灭菌后备用。
3、； S7， 人工种皮包备： 将人工种 子放入胶囊壳后盖上盖子。 本发明适用于草种机 械化播种生产， 缩短了种子的培养周期， 降低了 成本， 提高了生产效率。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 107896991 A 2018.04.13 CN 107896991 A 1.一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 22-33环境促进种间处腋芽 萌发， 待腋芽萌发约2-5cm高时， 用小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒30-40s， 然后。
4、放入10次氯 酸钠溶液中消毒9-12min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗3-5次， 之后取出晾干水分， 备用； S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分， 留下基部1.4- 1.6cm的短缩节部分用于人工种子制备； S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为2.5-3.5海藻酸钠、 MS培养基、 1-3mg/L萘乙 酸、 0.2-0.5mg/L吲哚丁酸、 2-3蔗糖和0.5-1g/L活性炭， pH为5.8-6.2； 110-130高温高 压灭菌20min； 冷却备用； S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液2-4mL注入10-20mL离心管内。
5、； 用注射器吸取 3mL 1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min后， 形成巨菌草种 芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为5-7海藻酸钠、 0.8-1.2普鲁兰多糖和 0.3-0.6羧甲基纤维素钠； 110-130高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后放入 2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表面水分； 取合适大 小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 。
6、既得成品巨菌 草人工种子。 2.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S2中将经过 酒精消毒的外植体转移低速搅拌机内以30-60转/分搅拌， 使得外植体消毒充分。 3.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S4中人工胚 乳成分为3海藻酸钠、 MS培养基、 2.5mg/L萘乙酸、 0.5mg/L吲哚丁酸、 3蔗糖和0.9g/L活 性炭。 4.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S5中胚乳凝 胶溶液的取用量及离心管的规格根据种芽的实际大小决定， 且以种芽放入胚乳凝胶溶液中 被完全淹没为准。 5.根据权利要求。
7、1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S6中所制得 的人工种皮成分为6海藻酸钠、 1普鲁兰多糖和0.5羧甲基纤维素钠。 6.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S6中高温高 压灭菌后冷却至室温， 然后向混合溶液中加入多菌灵至浓度为0.25-0.4。 7.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S7中所使用 的胶囊壳用市售药用胶囊壳， 且可根据人工种子大小定做合适的尺寸。 8.根据权利要求1所述的一种巨菌草人工种子制作方法， 其特征在于， 所述S7中向胶囊 壳内放入人工种子， 用高吸水性树脂填充胶囊壳内部剩余空间， 以。
8、供种子播种后的吸水和 保水。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107896991 A 2 一种巨菌草人工种子制作方法 技术领域 0001 本发明涉及巨菌草育种技术领域， 尤其涉及一种巨菌草人工种子制作方法。 背景技术 0002 巨菌草(Pennisetum giganteum z.x.lin)是禾本科狼尾草属多年生直立丛生型 植物， 具有较强的分蘖能力， 株高一般3-4.5m。 原产于北非。 上个世纪80 年代引入我国福建 试种成功， 经20多年的不断改良培育试验， 目前巨菌草已经培育除了适合我国气候土壤环 境的草种。 0003 传统培养食用菌基质通常采用的木屑等基质， 需要大量的木。
9、材。 而巨菌草可以替 代树木用于培养食药用菌的培养基， 从而大量减少对树木的砍伐， 保护山林， 减少水土流 失。 巨菌草还能改良土壤， 调节土壤PH值。 巨菌草含有丰富的蛋白含量， 其中粗蛋白含量高 达10， 粗纤维含量为28.5、 粗脂肪含量为3.8， 是优质的动物饲料， 我国牧区对巨菌草 的需求量非常大。 由于国家政策支持， 种植巨菌草还可获国家专项资金资助和电价补贴等， 因此推广巨菌草产业技术对提高农民收入具有重要意义。 0004 巨菌草种植简单， 既可进行有性繁殖， 也可无性繁殖。 有性繁殖种子发芽率极低， 生产上常用带腋芽茎段采用短茎扦插法进行无性繁殖。 受季节条件和长途运输条件的影。
10、 响， 北方种植种茎一般从南方繁育后运至北方， 发芽率极低， 繁殖成本高； 此外， 采用扦插法 繁殖需要消耗大量的母本植株， 且扦插所使用的短茎的截取过程需要耗费大量人力物力， 进一步增加了巨菌草繁殖的成本。 相比之下， 人工种子利用体细胞胚发生的特征， 把它包埋 在胶囊中， 形成具有种子的性能并直接在田间播种。 主要的优势是生产不受季节限制； 可能 更快地培养出新品种来还可以在凝胶包裹物里加入天然种子可能没有的有利成分； 使人工 种子具有更加好的营养供应和抵抗疾病的能力， 从而获得更加茁壮生长的可能性， 便于运 输及广泛推广。 因此， 巨菌草人工种子的制备， 为巨菌草规模化种植和良种繁殖方式。
11、的推广 应用提供技术支撑。 发明内容 0005 基于背景技术存在的技术问题， 本发明提出了一种巨菌草人工种子制作方法。 0006 本发明提出的一种巨菌草人工种子制作方法， 包括以下步骤： 0007 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 22-33环境促进种间处 腋芽萌发， 待腋芽萌发约2-5cm高时， 用小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0008 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒30-40s， 然后放入10 次氯酸钠溶液中消毒9-12min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗3-5 次， 之后取出晾干水分， 备用；。
12、 0009 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分， 留下基部 1.4-1.6cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0010 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为2.5-3.5海藻酸钠、 MS培养基、 1-3mg/L 说 明 书 1/5 页 3 CN 107896991 A 3 萘乙酸、 0.2-0.5mg/L吲哚丁酸、 2-3蔗糖和0.5-1g/L活性炭， pH为 5.8-6.2； 110-130高 温高压灭菌20min； 冷却备用； 0011 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液2-4ml注入10-20ml离心管内； 用注射器吸 取3ml1.5CaCl。
13、2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化 10min后， 形成巨菌草 种芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； 0012 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为5-7海藻酸钠、 0.8-1.2普鲁兰多糖 和0.3-0.6羧甲基纤维素钠； 110-130高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0013 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表面水分； 取合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 巨菌草人。
14、工种子。 0014 优选地， 所述S2中将经过酒精消毒的外植体转移低速搅拌机内以30-60转/ 分搅 拌， 使得外植体消毒充分。 0015 优选地， 所述S4中人工胚乳成分为3海藻酸钠、 MS培养基、 2.5mg/L萘乙酸、 0.5mg/L吲哚丁酸、 3蔗糖和0.9g/L活性炭。 0016 优选地， 所述S5中胚乳凝胶溶液的取用量及离心管的规格根据种芽的实际大小决 定， 且以种芽放入胚乳凝胶溶液中被完全淹没为准。 0017 优选地， 所述S6中所制得的人工种皮成分为6海藻酸钠、 1普鲁兰多糖和0.5 羧甲基纤维素钠。 0018 优选地， 所述S6中高温高压灭菌后冷却至室温， 然后向混合溶液中加。
15、入多菌灵至 浓度为0.25-0.4。 0019 优选地， 所述S7中所使用的胶囊壳用市售药用胶囊壳， 且可根据人工种子大小定 做合适的尺寸。 0020 优选地， 所述S7中向胶囊壳内放入人工种子， 用高吸水性树脂填充胶囊壳内部剩 余空间， 以供种子播种后的吸水和保水。 0021 本发明的有益效果如下： 通过繁育的人工种子用于巨菌草大规模化种植用的种苗 需求， 该方法制备的人工种子， 可以使繁殖后的苗株遗传性好、 不发生突变， 提供发芽率， 从 而保护了菌草的优秀品质。 本发明将巨菌草种间萌芽的腋芽作为人工种子的外植体， 可以 使繁殖后的巨菌草种苗生长性较为一致、 不发生突变， 进一步改善了种苗。
16、的品质。 同时采用 巨菌草制备的人工种子， 可以适用于机械化生产， 缩短了组织培养周期， 降低了成本， 提高 了生产效率， 同时方便运输和储藏， 本发明通过生物技术手段在短时间内， 满足了商业化生 产的需求， 为企业规模化、 产业化培养高品质巨菌草提供了技术支持。 附图说明 0022 图1为本发明的制作流程图。 具体实施方式 0023 下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。 0024 实施例1 说 明 书 2/5 页 4 CN 107896991 A 4 0025 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 22环境促进种间处腋 芽萌发， 待腋芽萌发约2cm高时， 用小刀将。
17、巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0026 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒30s， 然后放入 10次 氯酸钠溶液中消毒9min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗3次， 之后 取出晾干水分， 备用； 0027 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分， 留下基部 1.4cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0028 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为2.5海藻酸钠、 MS培养基、 1.0mg/L 萘乙 酸、 0.2mg/L吲哚丁酸、 2蔗糖和0.5g/L活性炭， pH为5.8； 110高温高压灭菌20min； 。
18、冷却 备用； 0029 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液2ml注入10mL离心管内； 用注射器吸取3mL 1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min 后， 形成巨菌草种芽胶 囊， 用无菌水漂洗3次； 0030 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为5海藻酸钠、 0.8普鲁兰多糖和 0.3羧甲基纤维素钠； 110高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0031 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表面水分； 取。
19、合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 巨菌草人工种子。 0032 实施例2 0033 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 25环境促进种间处腋 芽萌发， 待腋芽萌发约3cm高时， 用小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0034 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒35s， 然后放入 10次 氯酸钠溶液中消毒10min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗4次， 之 后取出晾干水分， 备用； 0035 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分。
20、， 留下基部 1.5cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0036 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为3.0海藻酸钠、 MS培养基、 1.5mg/L 萘乙 酸、 0.3mg/L吲哚丁酸、 23蔗糖和0.7g/L活性炭， pH为6.0； 115高温高压灭菌20min； 冷却 备用； 0037 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液3mL注入15ml离心管内； 用注射器吸取 3mL1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min 后， 形成巨菌草种 芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； 0038 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为6海藻酸钠、 1.0普鲁。
21、兰多糖和 0.4羧甲基纤维素钠； 115高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0039 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表面水分； 取合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 巨菌草人工种子。 说 明 书 3/5 页 5 CN 107896991 A 5 0040 实施例3 0041 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 28环境促进种间处腋 芽萌发， 待腋芽萌发约3cm高时， 用。
22、小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0042 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒35s， 然后放入 10次 氯酸钠溶液中消毒10min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗4次， 之 后取出晾干水分， 备用； 0043 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分， 留下基部 1.5cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0044 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为3.0海藻酸钠、 MS培养基、 2.0mg/L 萘乙 酸、 0.4mg/L吲哚丁酸、 2.0蔗糖和0.8g/L活性炭， pH为6.0； 120高温高压灭菌2。
23、0min； 冷 却备用； 0045 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液3ml注入15ml离心管内； 用注射器吸取 3ml1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min 后， 形成巨菌草种 芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； 0046 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为6海藻酸钠、 1.0普鲁兰多糖和 0.5羧甲基纤维素钠； 120高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0047 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表。
24、面水分； 取合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 巨菌草人工种子。 0048 实施例4 0049 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 30环境促进种间处腋 芽萌发， 待腋芽萌发约3cm高时， 用小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0050 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒35s， 然后放入 10次 氯酸钠溶液中消毒10min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗4次， 之 后取出晾干水分， 备用； 0051 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端。
25、及不规则部分， 留下基部 1.5cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0052 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为3.0海藻酸钠、 MS培养基、 2.5mg/L 萘乙 酸、 0.5mg/L吲哚丁酸、 3.0蔗糖和0.9g/L活性炭， pH为6.2； 125高温高压灭菌20min； 冷 却备用； 0053 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液3ml注入15ml离心管内； 用注射器吸取 3ml1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min 后， 形成巨菌草种 芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； 0054 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为6海藻酸钠。
26、、 1.0普鲁兰多糖和 0.5羧甲基纤维素钠； 125高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0055 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次， 晾干表面水分； 取合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 说 明 书 4/5 页 6 CN 107896991 A 6 巨菌草人工种子。 0056 实施例5 0057 S1， 外植体取材： 取成熟的巨菌草茎秆， 斜向扦插在土中， 33环境促进种间处腋 芽萌发， 待腋芽萌发约5。
27、cm高时， 用小刀将巨菌草茎秆基部的腋芽切下， 用作外植体； 0058 S2， 外植体消毒： 将收集的腋芽材料放入75的酒精中消毒40s， 然后放入 10次 氯酸钠溶液中消毒12min； 在无菌操作间内将消毒后的腋芽放入灭菌自来水中清洗5次， 之 后取出晾干水分， 备用； 0059 S3， 种芽修整： 将消毒后的腋芽用无菌小刀修切去上端及不规则部分， 留下基部 1.6cm的短缩节部分用于人工种子制备； 0060 S4， 人工胚乳成分制备： 人工胚乳成分为3.5海藻酸钠、 MS培养基、 3mg/L 萘乙 酸、 0.5mg/L吲哚丁酸、 3.0蔗糖和1.0g/L活性炭， pH为6.2； 130高温。
28、高压灭菌20min； 冷 却备用； 0061 S5， 人工种芽胶囊制备： 将胚乳凝胶溶液4mL注入20ml离心管内； 用注射器吸取 3ml1.5CaCl2溶液， 针头插入离心管底部并注入CaCl2溶液， 固化10min 后， 形成巨菌草种 芽胶囊， 用无菌水漂洗3次； 0062 S6， 人工种皮成分及制备： 人工种皮成分为7海藻酸钠、 1.2普鲁兰多糖和 0.6羧甲基纤维素钠； 130高温高压灭菌20min后冷却至室温， 备用； 0063 S7， 人工种皮包备： 将人工巨菌草种芽胶囊浸入人工种皮溶液中， 再用镊子夹出后 放入2CaCl2中固化20min， 形成巨菌草人工种皮， 用无菌水漂洗3次。
29、， 晾干表面水分； 取合 适大小的胶囊壳， 用紫外线照射消毒； 将人工种子放入后， 最后盖上胶囊壳盖子， 既得成品 巨菌草人工种子。 0064 0065 上表为实施例1-5对比实验表。 由上表可知， 采用实施例4处理后的种子发芽率最 高， 这里不做详细阐述。 0066 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107896991 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 107896991 A 8 。