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1、10申请公布号CN104194930A43申请公布日20141210CN104194930A21申请号201410498030X22申请日20140926C11B3/00200601A23D9/0420060171申请人东北农业大学地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号72发明人于殿宇屈岩峰邹小雨王立琦江连洲54发明名称一种用磁性固定化磷脂酶A2脱胶的方法57摘要本发明提供一种用磁性固定化磷脂酶A2脱胶的方法。即将磁性固定化后的PLA2添加到大豆毛油中进行脱胶，反应完成后用磁场将磁性固定化酶回收重复利用的方法。对脱胶后磷含量、油脂得率及固定化PLA2的重复使用次数的确定，得到脱胶后。
2、磷含量最低为20PPM，且油脂得率提高12，磁性固定PLA2连续使用8个批次后固定化酶相对活力仍保持在80左右。采用磁性固定PLA2后，可增加脱胶油中磷脂的形成；提高油相和胶相的分离；在脱胶油中可控制游离脂肪酸的形成；甾醇也可以与游离脂肪酸再酯化形成甾醇酯，从而成为食用油的一部分。因此，不仅实现物理精炼，还可提高脱胶油的得率。既可生产低含磷量的优质脱胶油，同时使脱胶油中含有较高含量的功能性的植物甾醇酯。51INTCL权利要求书1页说明书2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页10申请公布号CN104194930ACN104194930A1/1页21一种用磁性。
3、固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法通过以下步骤实现一、PLA2的固定化首先将L0G的磁性微球PVPDB171（聚乙烯吡咯烷酮乙烯基三甲氧基硅烷）/SIO2/FE3O4置于在50ML的磷酸缓冲液01M，PH70中浸泡24小时，然后磁分离，接着将上述浸泡后的载体加入到一定量的含02的磷脂酶的磷酸缓冲液01M，PH70中，同时在45下用磁力搅拌器缓慢地搅拌反应一段时间，最后磁分离并用磷酸缓冲液01M，PH70洗涤所得的固定化酶，滤液和洗涤液合并，用来测定酶蛋白含量，将所得的固定化酶放置在冰箱内4下保存；二、磁性固定化PLA2用于脱胶取大豆毛油200G，将其预热至55，将固定化磷脂酶与一定量的去离子水。
4、混合均匀后，与预热后的大豆毛油混合均匀，在转速为70R/MIN的条件下机械搅拌，同时在温度55下水浴反应一段时间，取样测定脱胶油磷含量；得到脱胶后的大豆毛油磷含量为20MG/KG，PLA2脱胶后的油脂得率增长12，并确定了固定化PLA2连续用于对大豆毛油的脱胶，使用8个批次后，测定固定化酶相对活力，结果酶活力仍保持在80左右。2根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中将油相中起始PH值为40110的条件下进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。3根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中油相中起始PH值为40110，反应时。
5、间20120MIN的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。4根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。5根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070，固定化酶添加量001200的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。6根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中固定化酶脱胶条件进行进一步确。
6、定，结果为油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070，固定化酶添加量001200，用优化结果进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶，在最优状态下磷含量最低20MG/KG。7根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中将固定化酶脱胶后的油脂得率与常规酶法脱胶后油脂得率进行比较，得到固定化PLA2脱胶后的油脂得率增长12倍。8根据权利要求1所述的用磁性固定化PLA2对大豆毛油脱胶的方法，其特征在于步骤二中将固定化PLA2连续用于对大豆毛油的脱胶，使用8个批次后，测定固定化酶相对活力，结果酶活力仍保持在80左右。权利要求书CN104194。
7、930A1/2页3一种用磁性固定化磷脂酶A2脱胶的方法技术领域0001本发明涉及一种磁性固定化磷脂酶A2脱胶的方法。背景技术0002磁性功能材料是20世纪70年代发展起来的一种新型复合材料，是现代科学技术领域的重要基础材料之一。磁性高分子微球的主要特点有小粒径性、磁响应性和功能基团特性。小粒径性体现在体积小，因此比表面积、官能团密度及选择吸附能力大；磁响应性表现为在外加磁场的作用下，可以分离和磁性导向；功能基团特性表现为包覆的高分子材料具有多种反应活性的功能基团，可与活性物质连接。磁性功能材料的发展趋势是与其他学科的交叉，从而获得一些具有特殊功能的新磁性材料。这些复合磁性功能材料的出现，有望解。
8、决磁性功能材料在实际应用中存在的许多实际问题，如靶向药物、固定化酶等等。0003酶法脱胶是将难溶于水的磷脂转化为易溶于水的溶血性磷脂，进而可以通过水化的方法除去。磁性固定化磷脂酶脱胶是油脂脱胶的一种新方法，同传统的脱胶方法相比，磁性固定化酶法脱胶可大大节约化学物质（如盐酸、氢氧化钠等）的消耗量，几乎不产生废水，在环保、经济、质量等方面具有潜在的优势。而磷脂酶A2（PLA2）能特异性水解磷酸基与甘油基之间的磷氧键，生成溶血磷脂，增加脱胶油中磷脂的形成；油相黏度明显减少，从而提高油相和胶相的分离；在脱胶油中可控制游离脂肪酸的形成，甾醇也可以与游离脂肪酸再酯化形成甾醇酯，甾醇酯溶于油中成为食用油的一。
9、部分；因此，采用PLA2脱胶，不仅能实现物理精炼，还可提高脱胶油的得率，提高利润，减小投资。磁性复合载体固定化酶具有较强的磁场响应性，从而可以借助外部磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收固定化酶，随时控制酶催化反应，提高酶的使用效率。另外，从载体的设计上进一步改进酶的固定化方法，可有效地提高酶的活力回收，改善酶的稳定性。磁性固定化PLA2用于油脂脱胶中，还未发现相应报道。发明内容0004本发明是针对游离酶混溶在反应体系中不仅不易分离回收，难以反复或连续使用，且油脂中非水化磷脂很难脱除等问题，而提出的用磁性固定化PLA2来进行脱胶的方法。用磁性固定化PLA2来进行脱胶的方法通过以下步骤实现。
10、一、PLA2的固定化；二、磁性固定化PLA2脱胶。0005利用磁性固定化PLA2脱胶中，固定化酶具有重复使用的作用，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性,从而有利于酶的回收，而PLA2却能特异性水解磷酸基与甘油基之间的磷氧键，生成溶血磷脂，增加脱胶油中磷脂的形成；油相黏度明显减少，从而提高油相和胶相的分离；在脱胶油中可控制游离脂肪酸的形成，甾醇也可以与游离脂肪酸再酯化形成甾醇酯，甾醇酯溶于油中成为食用油的一部分；因此，采用PLA2脱胶，不仅能实现物理精炼，还可提高脱胶油的得率，提高利润，减小投资。本方法既可生产低含磷量的优质脱胶油，同时使脱胶油中含有较高含量的功能性的植物甾醇酯。说明书CN104。
11、194930A2/2页4具体实施方式0006具体实施方式一一种磁性固定化PLA2脱胶的方法通过以下步骤实现一、PLA2的固定化首先将L0G的磁性微球PVPDB171（聚乙烯吡咯烷酮乙烯基三甲氧基硅烷）/SIO2/FE3O4置于在50ML的磷酸缓冲液01M，PH70中浸泡24小时，然后磁分离，接着将上述浸泡后的载体加入到一定量的含02的磷脂酶的磷酸缓冲液01M，PH70中，同时在45下用磁力搅拌器缓慢地搅拌反应一段时间，最后磁分离并用磷酸缓冲液01M，PH70洗涤所得的固定化酶。滤液和洗涤液合并，用来测定酶蛋白含量，将所得的固定化酶放置在冰箱内4下保存；二、磁性固定化PLA2用于脱胶取大豆毛油2。
12、00G，将其预热至55，将固定化磷脂酶与一定量的去离子水混合均匀后，与预热后的大豆毛油混合均匀，在转速为70R/MIN的条件下机械搅拌，同时在温度55下水浴反应一段时间，取样测定脱胶油磷含量。得到脱胶后的大豆毛油磷含量为20MG/KG，磷脂酶A2脱胶后的油脂得率增长12。并确定了固定化PLA2连续用于对大豆毛油的脱胶，使用8个批次后，测定固定化酶相对活力，结果酶活力仍保持在80左右。0007具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将油相中起始PH值为40110的条件下进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶其它步骤与具体实施方式一相同。0008具体实施方式三本实施方式与具体实施方式。
13、一的不同点在于步骤二中将油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。其它步骤与具体实施方式一相同。0009具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。其它步骤与具体实施方式一相同。0010具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070，固定化酶添加量001200的条件下，进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。其它步骤与具体。
14、实施方式一相同。0011具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将由单因素确定的结果再进一步优化得到固定化条件，优化的固定化条件为油相中起始PH值为40110，反应时间20120MIN，反应温度为3070，固定化酶添加量001200，用优化结果进行固定化PLA2对大豆毛油脱胶。在最优状态下磷含量最低20MG/KG。其它步骤与具体实施方式一相同。0012具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将固定化酶脱胶后的油脂得率与常规酶法脱胶后油脂得率进行比较，得到固定化PLA2脱胶后的油脂得率增长12。其它步骤与具体实施方式一相同。0013具体实施方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤二中将固定化PLA2连续用于对大豆毛油的脱胶，使用8个批次后，测定固定化酶相对活力，结果酶活力仍保持在80左右。其它步骤与具体实施方式一相同。说明书CN104194930A。