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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410413163.2 (22)申请日 2014.08.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104286370 A (43)申请公布日 2015.01.21 (73)专利权人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 王金梅 陈燕琼 卢薇 杨晓泉 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 蔡茂略 罗观祥 (51)Int.Cl. A23J 1/14(2006.01) (56)对比文。
2、件 US 2001/0010930 A1,2002.08.02, CN 1135223 A,1996.11.06, CN 1733926 A,2006.02.15, CN 102994583 A,2013.03.27, CN 102115774 A,2011.07.06, CN 103262941 A,2013.08.28, 刘淑兰等.亚临界水法提取大豆酱渣饼中总 异黄酮的研究. 中国油脂 .2010,第35卷(第11 期), 审查员 任霞 (54)发明名称 一种酶辅助亚临界水法制备功能性大豆蛋 白的方法 (57)摘要 本发明公开了一种酶辅助亚临界水法制备 功能性大豆蛋白的方法。 该方法包括以。
3、下步骤： (1)向高温脱脂豆粕中加入去离子水， 调节pH， 并 加入 葡萄糖苷酶或蛋白酶M搅拌酶解； (2)调 节上述酶解豆粕浆液pH后进行亚临界水处理； (3)将上述所得料液冷却离心后收集上清， 调节 pH至酸性， 静置； (4)将步骤(3)所得蛋白浆液离 心， 沉淀复溶于去离子水中， 调节pH至中性， 冷冻 干燥， 即得富含苷元型异黄酮的功能性大豆蛋 白。 本发明方法蛋白得率较高， 适合于工业化生 产， 且达到了富集苷元型异黄酮的效果， 产品具 有良好的抗氧化性， 可作为专用蛋白配料应用于 更年期妇女乳制品和植物蛋白饮料中。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 104286370 。
4、B 2017.08.25 CN 104286370 B 1.一种酶辅助亚临界水法制备功能性大豆蛋白的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)分别以g和mL作为质量和体积单位， 将高温脱脂豆粕粉按1:61:15质量体积比分 散于去离子水中， 用1.53.0mol/L盐酸调节混合料液的pH至3.06.0， 并加入 葡萄糖苷 酶或蛋白酶M， 2560下搅拌酶解后， 冷却至室温； 以每克低温脱脂豆粕粉计， 所述 葡萄 糖苷酶和蛋白酶M的添加量分别为15mg和1020mg， 葡萄糖苷酶和蛋白酶M的酶活分别 为2000U/g和51.5AU/g； (2)将所得酶解豆粕浆液用氢氧化钠溶液调pH至6.09.。
5、0， 搅拌10120min， 置于水热 反应釜中进行亚临界水处理； 所述亚临界水处理的压强为0.10.15MPa， 温度为100140 ， 时间为520min； (3)将所得料液冰浴冷却后75008500rpm离心2030min， 收集上清液， 用1.5 3.0mol/L盐酸调其pH至4.05.0， 46下静置2030min； (4)将步骤(3)所得蛋白浆液离心分离， 所得沉淀用湿重1015倍去离子水重新分散， 调节其pH至中性后， 冷冻干燥， 得富含高苷元型异黄酮的功能性大豆蛋白。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述搅拌酶解时间为10 120min。 3.根据权。
6、利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述盐酸的浓度为1.53.0mol/L。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5 3.0mol/L。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 应用该制备方法， 大豆蛋白得率 49.08， 异黄酮含量6.98 mol/g， DPPH自由基清除率25.81， ABTS自由基清除率 83.89， ABTS自由基清除率83.89。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104286370 B 2 一种酶辅助亚临界水法制备功能性大豆蛋白的方法 技术领域 0001 本产品涉及一种功能性大豆蛋白， 特别是涉及一种。
7、酶辅助亚临界水法制备功能性 大豆蛋白的方法， 属于食品加工技术领域， 该功能性大豆蛋白为高苷元型大豆异黄酮的功 能性抗氧化大豆蛋白。 背景技术 0002 目前， 大豆蛋白作为食品配料已广泛用于各类体系中， 除作为蛋白质营养强化用 于一般食品外， 还将被用于特殊人群的保健食品， 如用于老年人特别是更年期妇女以预防 骨质疏松症， 减轻更年期综合症状等。 由此， 大豆蛋白作为健康食品配料在国内外具有巨大 的市场需求。 获得价格低廉、 功能性良好的大豆蛋白配料用于特殊人群专用保健食品具有 非常重要的现实意义。 强化大豆蛋白中的生物活性成分、 开发低成本蛋白资源是行之有效 的方法。 0003 大豆异黄酮。
8、是一种广泛存在于豆科植物中的植物性雌激素， 具有良好的抗氧化能 力， 在抗肿瘤、 改善心血管功能、 预防绝经期妇女骨质疏松症等方面有明显活性。 目前得到 确证的大豆异黄酮共有12种， 分为游离型的苷元、 结合型的糖苷以及它们的乙酰化和丙二 酰化形式， 其中苷元型异黄酮的抗氧化性和生物利用率最高。 食品中的异黄酮主要以糖苷 的形式存在， 只有在进入人体后需在结肠细菌作用下水解 葡萄糖苷键， 脱去糖基转变成 游离的苷元才可被胃肠粘膜吸收,生物利用率较低。 同时， 已有多项研究表明， 单纯的异黄 酮生理活性如降血脂作用不明显， 需要与大豆蛋白复合才能获得良好的协同作用。 目前， 常 规方法制备大豆蛋。
9、白中的异黄酮主要以糖苷型存在， 抗氧化能力较差且生物利用率低。 葡萄糖苷酶是由青霉菌属发酵生产的， 可一步将异黄酮糖苷转化为苷元。 蛋白酶M是从米曲 霉中分离得到的蛋白酶， 由于提取过程中污染了 葡萄糖苷酶， 故也可转化糖苷型异黄酮 为苷元型。 且蛋白酶M对乙酰基大豆苷、 乙酰基大豆黄苷和丙二酰大豆黄苷的水解效率高于 葡萄糖苷酶。 由此， 葡萄糖苷酶和蛋白酶M可用于高苷元型异黄酮大豆蛋白的制备。 0004 目前， 国内外生产大豆蛋白的原料主要为价格较高的低温脱脂豆粕。 高温脱脂豆 粕是大豆加工的副产物， 产量丰富， 价格低廉， 其蛋白变性程度高， 用常规的碱溶酸沉法难 以提取， 故其在食品中的。
10、应用较为局限， 目前主要用于饲料行业。 近年来， 亚临界提取方法 备受关注， 水作为蛋白提取介质时， 在100至临界温度374.2的范围内， 通过施加低于临 界压力22.1MPa的压力， 使水保持液体状态即亚临界水。 亚临界水介电常数显著降低， 对于 疏水物质具有良好的溶解能力， 且对极性较强和相对分子质量大的物质仍具有足够的溶解 性。 由此， 亚临界水高温高压环境可能显著提高蛋白的溶解性， 同时加速非极性物质如大豆 异黄酮的溶解， 有利于异黄酮提取及与蛋白的牢固结合和富集， 提高异黄酮的热稳定性。 0005 中国发明专利申请CN2012105449624公开了以大豆蛋白为原料， 利用了单一的。
11、亚 临界水法结合超滤制备具有一定抗氧化性的蛋白的方法， 该方法配制0.5 6大豆蛋白原 料溶液， 进行亚临界水处理， 通过控制处理时间(2 80min)以及温度(120 220)， 超滤膜， 柱层析分离技术， 经过浓缩、 喷雾干燥， 得到蛋白产品。 该发明仅从蛋白质角度考虑其抗氧 说 明 书 1/8 页 3 CN 104286370 B 3 化性的提高， 但未公开具体抗氧化提高数值， 且未考虑亚临界水处理过程中异黄酮与蛋白 质的结合及其存在形式对蛋白质抗氧化性质的影响， 也未能从蛋白样品组成成分上分析抗 氧化性提高的原因， 如美拉德反应产物这一抗氧化物质的产生情况。 发明内容 0006 为了解。
12、决上述现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种从高温脱脂豆粕 这一加工副产物中获得富含苷元型异黄酮大豆分离蛋白的酶辅助亚临界水制备方法。 0007 鉴于酶处理可以富集和转化异黄酮、 释放还原糖、 促进糖基化产物的形成的特点， 本发明采用酶辅助亚临界水法提取高温粕蛋白， 能显著提高蛋白得率、 异黄酮转化率， 利用 蛋白质与异黄酮结合的增强获得富集苷元型异黄酮的效果， 显著提高大豆蛋白的抗氧化 性， 旨在开发富含苷元型异黄酮的功能性大豆蛋白。 0008 本发明目的通过如下技术方案实现： 0009 一种酶辅助亚临界水法制备功能性大豆蛋白的方法， 包括以下步骤： 0010 (1)分别以g和mL作。
13、为质量和体积单位， 将高温脱脂豆粕粉按1:61:15质量体积 比分散于去离子水中， 用1.53.0mol/L盐酸调节混合料液的pH至3.06.0， 并加入 葡萄 糖苷酶或蛋白酶M， 2560下搅拌酶解后， 冷却至室温； 以每克低温脱脂豆粕粉计， 所述 葡萄糖苷酶和蛋白酶M的添加量分别为15mg和1020mg， 葡萄糖苷酶和蛋白酶M的酶活 分别为2000U/g和51.5AU/g； 0011 (2)将所得酶解豆粕浆液用氢氧化钠溶液调pH至6.09.0， 搅拌10120min， 置于 水热反应釜中进行亚临界水处理； 所述亚临界水处理的压强为(0.10.15)MPa， 温度为 (100140)， 时间。
14、为(520)min； 0012 (3)将所得料液冰浴冷却后75008500rpm/min离心2030min， 收集上清液， 用 1.53.0mol/L盐酸调其pH至4.05.0， 46下静置2030min； 0013 (4)将步骤(3)所得蛋白浆液离心分离， 所得沉淀用湿重1015倍去离子水重新分 散， 调节其pH至中性后， 冷冻干燥， 得富含高苷元型异黄酮的功能性大豆蛋白。 0014 优选地， 步骤(1)所述搅拌酶解时间为(10120)min。 0015 所述盐酸的浓度为(1.53.0)mol/L。 0016 所述氢氧化钠溶液的浓度为(1.53.0)mol/L。 0017 所述搅拌的时间为1。
15、0min120min。 0018 所述离心的转速为(75008500)rpm/min； 离心的时间为20min30min。 0019 应用本发明方法， 大豆蛋白得率49.08， 异黄酮含量6.98 mol/g， DPPH自由 基清除率25.81， ABTS自由基清除率83.89， ABTS自由基清除率83.89。 0020 本发明采用具有 葡萄糖苷酶活性的两种酶( 葡萄糖苷酶或蛋白酶M)对高温豆 粕进行酶解处理， 实现糖苷型异黄酮向苷元型异黄酮的转化， 再对豆粕进行高温水热处理， 获得基本只含苷元型异黄酮的高抗氧化性大豆蛋白。 在本发明工艺条件下， 苷元型异黄酮 会更多的富集于大豆蛋白中， 主。
16、要原因可能是： 蛋白分子具有疏水配基的亲和能力， 其更易 与疏水性较强的苷元型异黄酮结合， 且在高温条件下， 蛋白质发生结构展开， 疏水基团暴 露， 容易发生疏水聚集， 导致更多的苷元型异黄酮结合于蛋白质聚集体内部或表面， 获得蛋 白中异黄酮的富集效果。 说 明 书 2/8 页 4 CN 104286370 B 4 0021 相对于现有技术， 本发明具有如下优点和有益效果： 0022 本发明不仅克服了现有高温脱脂豆粕中蛋白难以提取的现状， 而且克服了现有制 备方法所得大豆蛋白中异黄酮含量低且异黄酮主要以生物利用度低的糖苷形式存在的缺 陷， 实现了异黄酮与蛋白质的牢固结合和富集效果， 增强了异黄。
17、酮活性和稳定性， 且获得蛋 白产品中含有一定的接枝产物， 蛋白具有良好的抗氧化性， 应用前景广阔。 附图说明 0023 图1为六种大豆异黄酮混标的HPLC图谱。 0024 图2为对比实施例和实施例1的HPLC图谱。 0025 图3为对比实施例和实施例3的HPLC图谱。 具体实施方式 0026 为更好地理解本发明， 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的发明， 但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。 0027 对比实施例1： 0028 低温脱脂大豆粕粉碎后过60目筛， 将一定量的低温脱脂豆粕粉按1:10(w/v)的料 液比分散于去离子水中， 用2 .0mol/L氢氧化钠料液的pH值至8 .0，。
18、 室温搅拌60min后 8000rpm/min离心20min后收集上清液。 将上清液用2.0mol/L盐酸调pH至4.5， 静置30min后， 以6000rpm/min离心15min， 所得沉淀用湿重10倍去离子水重新分散， 调节其pH至中性后， 得 大豆蛋白， 冷冻干燥备用。 0029 对比实施例2： 0030 高温脱脂大豆粕粉碎后过60目筛， 将一定量的高温脱脂豆粕粉按1:10(w/v)的料 液比分散于去离子水中， 用2.0mol/L氢氧化钠料液的pH值至9.0， 室温搅拌60min置于水热 反应釜中进行亚临界水处理(压强为0.1MPa， 120， 15min)， 所得料液迅速冰浴冷却， 。
19、8000rpm/min离心20min后收集上清液。 将上清液用2.0mol/L盐酸调pH至4.5， 静置30min后， 以6000rpm/min离心15min， 所得沉淀用湿重10倍去离子水重新分散， 调节其pH至中性后， 冷 冻干燥备用。 0031 实施例1： 0032 一种酶辅助亚临界水法制备功能性大豆蛋白的方法， 包括如下步骤： 0033 (1)高温脱脂大豆粕粉过60目筛， 按料液比1:10分散于去离子水中， 用2.0mol/L盐 酸调节pH值至4.5， 加入0.1(w/w)的 葡萄糖苷酶， 60下分别搅拌酶解10、 60、 120min； 0034 (2)将上述所得酶解豆粕浆液调节pH。
20、至9.0， 搅拌60min， 置于水热反应釜中进行亚 临界水处理(压强为0.1MPa， 120， 15min)； 0035 (3)将上述所得料液迅速冰浴冷却后8000rpm/min离心20min， 收集上清液， 用 2.0mol/L盐酸调其pH至4.5， 4下静置30min； 0036 (4)将步骤(3)所得蛋白浆液6000rpm/min离心15min， 所得沉淀用湿重10倍去离子 水重新分散， 调节其pH至中性后， 冷冻干燥即得功能性大豆蛋白。 0037 本发明获得样品中蛋白质含量的测定采用GB/T5009.5 03微量凯氏定氮法， 蛋白 质得率(所得样品质量其蛋白含量)/(原脱脂豆粉质量豆。
21、粉中蛋白含量)100。 说 明 书 3/8 页 5 CN 104286370 B 5 0038 本发明获得蛋白样品中还原糖含量的测定采用3,5 二硝基水杨酸比色法。 0039 本发明获得蛋白样品的抗氧化能力的测定采用DPPH自由基和ABTS自由基清除实 验。 0040 本发明获得蛋白样品中异黄酮含量采用液相色谱法测定， 按照下式计算： 0041 0042 表1实施例1中的苷元含量变化 0043 0044 注： 液相色谱测定条件参考国标GB/T 23788 2009 0045 其中Xi为异黄酮中某一组分的含量， 单位为mg/kg； 0046 Ci为根据标准曲线得出的各单体的浓度， 单位为mg/L。
22、； 0047 M为固体、 半固体质量的数值， 单位为g； 根据以上公式， 其中稀释总体积为3.4mL， 蛋白样品取样0.1g， 计算得 0048 XDaidzein21.13mg/L3.4mL/(254g/mol0.1g)0.283mmol/100g， 即Daidzein 含量是2.83 mo/g。 0049 XGlycitein9.50mg/L3.4mL/(270g/mol0.1g)0.120mg/100g， 即Glycitein含 量是1.20 mo/g。 0050 XGenistein24.72mg/L3.4mL/(284g/mol0.1g)0.296mg/100g， 即Genistei。
23、n 含量是2.96 mo/g。 0051 表2对比实施例及实施例1的参数变化 说 明 书 4/8 页 6 CN 104286370 B 6 0052 0053 经计算， 与对比实施例1相比， 对比实施例2中对于高温粕蛋白的提取率达到了低 温脱脂豆粕的蛋白提取率， 说明亚临界水处理确实可以显著提高高温粕中的变性蛋白。 值 得注意的是， 由附图2图谱可知， 对比实施例2中图谱峰面积较对比实施例1明显变大， 说明 异黄酮在此蛋白中实现了富集， 经计算， 对比实施例中的糖苷型异黄酮较对比实施例1有了 明显的富集效果(表2)。 这不仅是由于高温环境可能促进了丙二酰基异黄酮向 葡萄糖苷 酶异黄酮的转化， 。
24、也是由于亚临界水可能促进异黄酮的溶出， 减少其在碱溶过程中的沉淀 以降低损失。 高温粕蛋白的ABTS自由基清除率较低温粕蛋白有所提高， 但DPPH自由基清除 率较差。 0054 由表2可知， 与对比实施例2相比， 实施例1的蛋白纯度、 得率并无明显变化， 说明此 工艺过程中对高温粕蛋白的得率、 纯度的主要影响因素是亚临界水的作用。 由图2和表2可 知， 实施例1的糖苷型异黄酮峰面积随着酶解时间的延长逐渐减小， 说明基本转化成苷元型 异黄酮， 抗氧化能力更强的苷元型异黄酮含量由3.37 mol/g提高至10.59 mol/g。 值得注意 的是， 随着 葡萄糖苷酶酶解时间的增长， 蛋白中还原糖含量。
25、和褐变程度逐渐提高， 这是由 于在亚临界水的高温高湿环境下， 酶解释放的还原糖与大豆蛋白发生糖基化反应， 这将有 利于蛋白抗氧化性的提高。 结合 葡萄糖苷酶酶解和亚临界水处理， 实施例1的DPPH自由基 清除率提高从对比实施例2的11.44提高至23.87， ABTS自由基的清除率从对比实施例2 的73.87提高至83.97， 抗氧化能力较低温粕大豆分离蛋白(对比实施例1)提高的更为 明显。 0055 实施例2： 0056 一种酶辅助亚临界水法制备功能性抗氧化大豆蛋白的制备方法， 包括如下步骤： 0057 (1)高温脱脂大豆粕粉碎后过60目筛， 将按1:10(w/v)的料液比分散于去离子水 中。
26、， 用2.0mol/L盐酸调节混合料液的pH至4.5， 并分别加入0.01、 0.05、 0.10(w/w)的 葡萄糖苷酶， 60下搅拌酶解30min后， 冷却至室温； 0058 (2)将上述所得酶解豆粕浆液调节pH至9.0， 搅拌60min， 置于水热反应釜中进行亚 说 明 书 5/8 页 7 CN 104286370 B 7 临界水处理(压强为0.1MPa， 120， 15min)； 0059 (3)将上述所得料液迅速冰浴冷却后8000rpm/min离心20min， 收集上清液， 用 2.0mol/L盐酸调其pH至4.5， 4下静置30min； 0060 (4)将步骤(3)所得蛋白浆液60。
27、00rpm/min离心15min， 所得沉淀用湿重10倍去离子 水重新分散， 调节其pH至中性后， 冷冻干燥即得功能性大豆蛋白。 0061 表3对比实施例及实施例2的参数变化 0062 0063 由表3可知， 实施例2中糖苷型异黄酮基本转化成苷元型异黄酮， 与对比实施例2相 比， 蛋白纯度、 得率和异黄酮总量并无明显变化， 说明此不同酶添加量对高温粕蛋白的得率 和纯度无显著影响， 而且酶添加量越大， 苷元型异黄酮含量越多。 随着 葡萄糖苷酶添加量 的增大， 蛋白中还原糖含量和褐变程度逐渐提高， 这是由于在亚临界水的高温高湿环境下， 酶解释放的还原糖与大豆蛋白发生糖基化反应。 由于 葡萄糖苷酶的。
28、酶解作用， 实施例2中 抗氧化能力更强的苷元型异黄酮含量由3.37 mol/g提高至10.59 mol/g， DPPH自由基清除 率提高从对比实施例2的11.44提高至23.61， ABTS自由基的清除率从对比实施例2的 73.87提高至84.67。 0064 实施例3： 0065 一种酶辅助亚临界水法制备功能性抗氧化大豆蛋白的制备方法， 包括如下步骤： 0066 (1)高温脱脂大豆粕粉碎后过60目筛， 将按1:15(w/v)的料液比分散于去离子水 中， 用2.0mol/L盐酸调节混合料液的pH至4.5， 并加入2(w/w)的蛋白酶M， 50下搅拌酶解 10、 60、 120min后， 冷却至。
29、室温； 0067 (2)将上述所得酶解豆粕浆液调节pH至9.0， 搅拌60min， 置于水热反应釜中进行亚 临界水处理(压强为0.15MPa,140,15min)； 说 明 书 6/8 页 8 CN 104286370 B 8 0068 (3)将上述所得料液迅速冰浴冷却后8000rpm/min离心20min， 收集上清液， 用 2.0mol/L盐酸调其pH至4.5， 4下静置30min； 0069 (4)将步骤(3)所得蛋白浆液6000rpm/min离心15min， 所得沉淀用湿重10倍去离子 水重新分散， 调节其pH至中性后， 冷冻干燥即得功能性大豆蛋白。 0070 表4对比实施例及实施例3。
30、的参数变化 0071 0072 由表4可知， 与对比实施例1和2相比， 实施例3中随着蛋白酶M酶解时间的增长， 大 豆蛋白的得率和纯度大体上均呈现逐渐下降的趋势， 酶解120min后得率为49.19， 纯度为 75.23， 这可能是由于蛋白酶酶解可部分水解蛋白质形成多肽， 使部分蛋白在酸沉时无法 全部回收。 所得蛋白纯度下降是由于蛋白质接枝程度的提高， 其还原糖等明显提高， 但其蛋 白得率和纯度仍处于工业生产可接受的范围内。 0073 随着蛋白酶M酶解时间的增长， 蛋白中还原糖含量和褐变程度逐渐提高， 这是由于 在亚临界水的高温高湿环境下， 酶解释放的还原糖与大豆蛋白发生糖基化反应。 结合附图。
31、3 可知， 蛋白酶M酶解后， 蛋白中的糖苷型异黄酮不断转化为苷元型异黄酮， 且随着酶解时间 的增长， 苷元型异黄酮含量逐渐提高。 值得注意的是， 酶解120min时苷元型含量从酶解前 3.37 mol/g提高至15.14 mol/g。 可能的原因是， 亚临界水的介电常数较低， 可以更好的提 高异黄酮在水中的溶解度， 有利于其与大豆蛋白的结合， 达到了富集苷元型异黄酮的效果。 另外， 可能是由于蛋白酶部分水解蛋白过程中可以更大量的释放结合在无法溶出蛋白质上 的异黄酮， 使得所得产品具有更高的异黄酮含量。 由于异黄酮的富集和糖基化产物的生成， 实施例3中DPPH自由基清除率提高从对比实施例2的11。
32、.44提高至32.83， ABTS自由基的 清除率从对比实施例2的73.87提高至92.34。 0074 如何从异黄酮和美拉德反应产物角度解决抗氧化性是本发明的关键。 目前， 有研 说 明 书 7/8 页 9 CN 104286370 B 9 究采用酶解技术转化糖苷型异黄酮从而提高其生物利用度， 但未见将酶解豆粕和亚临界水 结合的相关报道。 关键的原因可能在于， 本领域技术人员一般认为， 异黄酮等生物活性物质 在高温下会发生降解破坏， 其稳定性下降(张永军,黄惠华.食品胶对豆浆中活性成分异黄 酮苷元热稳定性的影响.食品工业科技,2009,30(12):311 315)。 本发明发现， 采用酶解。
33、和 亚临界处理结合的方式从高温粕获得了高异黄酮苷元的大豆蛋白， 蛋白中的异黄酮并未发 生降解而减少， 相对于单一亚临界处理(对比实施例2)， 其含量反而得到富集， 特别对于蛋 白酶M而言， 其富集效果更明显， 总黄酮由10.19可提高达16.57 mol/g(见实施例3)， DPPH自 由基和ABTS自由基清除能力分别提高2.9倍和1.25倍， 可作为专用蛋白配料应用于更年期 妇女乳制品和植物蛋白饮料中。 发明人研究发现， 相对于糖苷型异黄酮， 苷元型异黄酮与蛋 白拥有更强的结合能力， 在亚临界水的高温高压环境下， 蛋白结构展开， 其内部的疏水基团 暴露， 通过分子间相互作用(如疏水相互作用)。
34、连接发生聚集行为， 在聚集过程中， 异黄酮可 能内卷于蛋白聚集颗粒内部， 进而异黄酮稳定性得以提高， 未发生明显含量减少。 除以上机 理外， 本发明还发现， 相对于单一亚临界处理， 酶解结合亚临界水处理获得蛋白质含有一定 量的糖接枝产物， 这一类物质可以进一步强化蛋白的抗氧化效果。 一般认为， 葡萄糖苷酶 不仅可以转化糖苷型异黄酮， 也可酶解纤维素释放糖类， 还原糖含量不断提高(见实施例)。 在亚临界水环境下， 酶解释放的还原糖与蛋白发生糖基化反应， 产物蛋白产生明显的焙烤 香味。 由以上分析， 本发明采用酶辅助亚临界水法提取高温粕蛋白， 克服了现有技术偏见， 显著提高了蛋白得率、 异黄酮转化率， 利用蛋白质与异黄酮结合的增强获得富集苷元型异 黄酮的效果， 显著提高了大豆蛋白的抗氧化性。 说 明 书 8/8 页 10 CN 104286370 B 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 104286370 B 11 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 104286370 B 12 。