《西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102239802 A (43)申请公布日 2011.11.16 CN 102239802 A *CN102239802A* (21)申请号 201010178184.2 (22)申请日 2010.05.14 A01H 4/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (71)申请人 北京市农林科学院 地址 100089 北京市海淀区西郊板井村北京 市农林科学院 (72)发明人 王建设 杨颖 裴晓利 沈文娟 宋晓华 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 西瓜单倍体的生产方法及其专用培。
2、养基 (57) 摘要 本发明公开了一种西瓜单倍体的生产方法及 其专用培养基。本发明提供的专用培养基是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基 ： 细胞分裂素、 生长素、 碳源和凝胶剂 ； 所述胚状体 诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是 0.1-2mg/ L， 所述生长素的终浓度是 0.1-1.5mg/L ； 所述 MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表1所示。 实验证 明 ： 从上述专用培养基中的 11 个子房切片中共找 到了3个体积膨大的胚状体可形成丛生芽R1、 R2和 R3。利用流式细胞仪检测分析可知所有来源于 R2 胚的再生植株的DNA相对含量在100附近， 表明来 源于 R2胚。
3、的所有再生植株的倍性为单倍体。证明 了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方 法是可行的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 CN 102239805 A1/1 页 2 1. 胚状体诱导培养基， 是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基 ： 细胞分 裂素、 生长素、 碳源和凝胶剂 ； 所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是 0.1-2mg/L， 所述生长素的终浓度是 0.1-1.5mg/L ； 所述 MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表 1 所示。 2. 如权利要求 1 所述。
4、的胚状体诱导培养基， 其特征在于 ： 所述胚状体诱导培养基中细 胞分裂素和生长素的终浓度分别是如下 1) 或 2) 或 3) ： 1) 细胞分裂素为 0.1-1.5mg/L， 生长素为 0.1-1mg/L ； 2) 细胞分裂素为 1.5-2mg/L， 生长素为 1-1.5mg/L ； 3) 细胞分裂素为 1.5mg/L， 生长素为 1mg/L。 3.如权利要求1或2所述的胚状体诱导培养基， 其特征在于 ： 所述细胞分裂素是6-BA， 所述生长素是 2， 4-D。 4. 如权利要求 1-3 中任一所述的胚状体诱导培养基， 其特征在于 ： 所述碳源是蔗糖， 所 述蔗糖在所述胚状体诱导培养基的终浓度。
5、是 30g/L ； 所述凝胶剂是琼脂， 所述琼脂在所述 胚状体诱导培养基的终浓度是 8g/L。 5. 植物单倍体的生产方法， 包括如下的步骤 ： 1) 将植物未授粉的子房置于权利要求 1-4 中任一所述的胚状体诱导培养基中培养， 得 到胚状体 ； 2) 将步骤 1) 得到的胚状体置于丛生芽伸长培养基培养， 得到丛生芽 ； 3) 将步骤 2) 得到的丛生芽置于生根培养基中培养， 得到单倍体的再生植株。 6. 如权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 所述丛生芽伸长培养基是在 MS 基本培养液 中添加如下物质得到的固体培养基 ： 6-BA、 NAA、 碳源和凝胶剂 ； 所述 MS 基本培养液的。
6、溶剂 是水、 溶质如表 1 所示 ； 所述丛生芽伸长培养基中 6-BA 和 NAA 的终浓度是如下 1) 或 2) ： 1)6-BA 的终浓度是 0.1-0.3mg/L， 所述 NAA 的终浓度是 0.01-0.1mg/L ； 2)6-BA 的终浓度是 0.2mg/L， 所述 NAA 的终浓度是 0.05mg/L。 7. 如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述碳源是蔗糖， 所述蔗糖在所述丛生芽伸 长培养基的终浓度是 30g/L ； 所述凝胶剂是琼脂， 所述琼脂在所述丛生芽伸长培养基的终 浓度是 8g/L。 8. 如权利要求 5-7 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述生根培养基。
7、是在 MS 基本培 养液中添加如下物质得到的固体培养基 ： IBA、 碳源和凝胶剂 ； 所述 MS 基本培养液的溶剂是 水、 溶质如表 1 所示 ； 所述生根培养基中 IBA 的终浓度是 0.25-1mg/L。 9. 如权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述生根培养基中 IBA 的终浓度是 0.5mg/ L ； 所述碳源是蔗糖， 所述蔗糖在所述生根培养基的终浓度是 30g/L ； 所述凝胶剂是琼脂， 所 述琼脂在所述生根培养基的终浓度是 8g/L。 10. 如权利要求 5-9 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物是双子叶植物或单子叶 植物， 优选是葫芦科作物， 更优选是西瓜。。
8、 权 利 要 求 书 CN 102239802 A CN 102239805 A1/7 页 3 西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基 技术领域 0001 本发明涉及西瓜单倍体的生产方法及其专用培养基。 背景技术 0002 单倍体是指具有配子染色体组成的孢子体。 植物单倍体对植物遗传育种有重要意 义， 其主要用途如下 ： 通过单倍体培养和染色体加倍可快速获得纯合系。在植物的育种 过程中， 传统的多代自交、 回交法一般需 5-6 年或更长的时间才能获得相对纯合的自交系， 而用单倍体技术仅需要 5-6 个月的时间就可以获得纯合的材料， 从而大大加速了选育的进 程， 缩短了育种的年限， 较快地获得优良品。
9、种。诱变单倍体可迅速发现隐性突变。单倍体 培养获得的纯合植株， 有利和不利的隐性突变基因都可以得到表达， 进行离体诱变和抗性 突变体筛选， 可使选择效率大大提高。 单倍体技术还可用于固定亲本性状， 使原来亲本更 稳定均一。理论研究。单倍体与二倍体杂交得到的非整倍体有助于解决测定连锁群、 二 倍体的染色体组成分和基因剂量的作用等一些问题。 0003 西瓜是葫芦科的重要瓜类作物之一。长期以来， 西瓜花药培养研究倍受关注。薛 光荣等 (1982) 对 “琼酥” 和 “周至红” 2 个西瓜品种进行了花药培养， 获得了单倍体植株， 但 其愈伤组织的诱导率仅为 0.5， 育种难以利用。薛光荣等 ( 薛光荣。
10、， 余文炎等 .1983. 西 瓜花药离体培养获得花粉植株 . 植物生理学通讯， NO.4.40-42) 通过花药培养获得的花粉 植株经过加倍得到了一个高产、 抗病的西瓜优良品种。袁万良等 ( 袁万良， 付润民， 雷保林， 曹小玲 .1995. 西瓜花培试验初报 . 陕西农业科学， 1 ： 29-30.) 改良培养基， 解决了愈伤组 织褐变死亡的问题， 不仅将愈伤组织诱导率从 0.5提高到 94.4， 并且快速诱导出了绿色 组织。魏瑛等 ( 魏瑛， 张俊莲， 陈年来等 . 西瓜花药愈伤组织的诱导， 甘肃农业大学学报， 1998) 在 “西农 8 号” 和 “京欣 1 号” 2 个西瓜品种上， 。
11、花药愈伤诱导率达到 57.7-62.9。 缑艳霞 ( 缑艳霞 2006 西瓜花药离体培养技术研究， 硕士论文 . 杭州 ： 浙江大学 ) 以 3 个 品种 “拿比特” 、“春光” 和 “喜都” 为材料， 发现诱导培养基蔗糖 60g/L、 4下处理 72h 低温 预处理或 30高温预培养 72h 后置于 25常温黑暗培养有助于提高西瓜花药愈伤组织的 诱导率， 诱导愈伤组织质地良好， 但最终还是没有获得再生植株。 研究还发现活性炭对西瓜 花药愈伤组织的形成有抑制作用。李娟 ( 李娟， 张丽， 李焕秀， 宫国义， 张海英， 郭绍贵， 许 勇 .2008. 西瓜花药培养技术研究中国瓜菜， 4 ： 8-。
12、10) 在西瓜品种 261 上， 先高温 (35 ) 后 常温 (26-30 ) 的变温培养， 在诱导培养基 MS+KT1.5mg/L+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L 上愈 伤诱导率最高达 58.63， 将愈伤转移愈伤增殖培养基 MS+ 三十烷醇 2.0mg/L+6-BA0.5mg/ L 上， 培养 5 天出现深绿色点状组织， 培养 10 天， 愈伤生长迅速， 分生旺盛， 产生大量绿色组 织， 出现丛生芽。当丛生芽长至 2cm 左右时转至 Ms+0.5mg/L IBA 上生根。当成功诱导出 根的时将其转入 1/2MS+0.2mg/LIBA+1.0mg/LIAA 上， 获得了植株，。
13、 但未鉴定倍性， 结果不明 确。 0004 在 西 瓜 上， Sari et al(Sari.N， Abak.K， Pitrat.M， et al.1994.Induction ofparthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A2/7 页 4 watermelon.HortScience， 29 ： 1189-1190.) 研究了 4 个品种辐射花粉诱导单倍体技术 ( 射线， 辐射剂量200或300Gy， 剂量率0.85Gy。
14、/min)， 接种了26个果实、 13844粒种子， 诱导了 761 个胚。在诱导的胚中， 球形胚占 72.8、 心形胚占 0.7， 其它 26.5为坏死 (17.1 ) 或软化 (9.2 ) 的心形胚。在品种间百粒种子胚诱导率、 百胚植株诱导率和千粒种子植株 诱导率存在显著地差异。百粒种子胚诱导率的变异幅度为 4.0 -14.2， 平均为 5.5 ； 百胚植株诱导率的变异幅度为 1.4 -3.5， 平均为 2.2； 千粒种子植株诱导率的变异幅 度为 0.6 -3.1， 平均为 1.2。果实发育期对百粒种子胚诱导率、 百胚植株诱导率和千 粒种子植株诱导率也有显著地影响。 尽管5个星期百粒种子胚。
15、诱导率最高(8.3)， 2-4个 星的期变异幅度为 3.7 -7.1， 但 5 个星期的百胚植株诱导率却最低 (0.5 )， 2-4 个星 的期变异幅度为 2.4 -3.4 ； 5 个星期的千粒种子植株诱导率也最低 (0.4 )， 2-4 个星 的期变异幅度为 1.1 -1.8。 0005 辐射花粉诱导单倍体方法操做烦琐， 费时费力， 效率较低， 且再生频率较低。为了 解决瓜类花药培养以及辐射花粉授粉获得单倍体诱导率低的问题， 研究者尝试展开瓜类未 受精子房离体培养研究， 以建立高效的单倍体技术。 在西葫芦(陈学军， 邢国明， 陈竹军.西 葫芦未授粉胚珠离体培养与植株再生 . 浙江农业学报， 。
16、2000， 12(3) ： 165-167)、 甜瓜 ( 韩丽 华 .2004. 厚皮甜瓜未受精胚珠离体培养技术 硕士论文 . 石家庄 ： 河北农业大学 ) 和黄 瓜 ( 杜胜利 .2001. 利用生物技术创造黄瓜育种新材料方法研究 . 天津科技， 2 ： 627) 均已 获得了单倍体， 其中在黄瓜上已达到育种应用水平。 但迄今为止， 西瓜离体雌核发育诱导单 倍体研究未见公开报道。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种胚状体诱导培养基， 可应用于西瓜未授粉的子房培养 形成胚状体。 0007 本发明提供的胚状体诱导培养基， 是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固 体培养基 ： 细胞。
17、分裂素、 生长素、 碳源和凝胶剂 ； 0008 所述胚状体诱导培养基中细胞分裂素的终浓度是 0.1-2mg/L， 所述生长素的终浓 度是 0.1-1.5mg/L ； 0009 所述 MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表 1 所示。 0010 表 1.MS 基本培养液的溶质 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A3/7 页 5 0011 0012 进一步， 上述胚状体诱导培养基中细胞分裂素和生长素的终浓度分别是如下 1) 或 2) 或 3) ： 0013 1) 细胞分裂素为 0.1-1.5mg/L， 生长素为 0.1-1mg/L ； 0014 2) 细胞分裂素为。
18、 1.5-2mg/L， 生长素为 1-1.5mg/L ； 0015 3) 细胞分裂素为 1.5mg/L， 生长素为 1mg/L。 0016 上述细胞分裂素具体可以是 6-BA， 上述生长素具体可以是 2， 4-D。 0017 上述碳源优选是蔗糖， 所述蔗糖在所述胚状体诱导培养基的终浓度是 30g/L ； 所 述凝胶剂优选是琼脂， 所述琼脂在所述胚状体诱导培养基的终浓度是 8g/L。 0018 本发明的另一目的在于提供植物单倍体的生产方法。 0019 本发明提供的植物单倍体的生产方法， 包括如下的步骤 ： 0020 1) 将植物未授粉的子房置于任一上述的胚状体诱导培养基中培养， 得到胚状体 ； 。
19、0021 2) 将步骤 1) 得到的胚状体置于丛生芽伸长培养基培养， 得到丛生芽 ； 0022 3) 将步骤 2) 得到的丛生芽置于生根培养基中培养， 得到单倍体的再生植株。 0023 上述丛生芽伸长培养基是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基 ： 6-BA、 NAA、 碳源和凝胶剂 ； 所述 MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表 1 所示 ； 所述丛生芽伸 长培养基中 6-BA 和 NAA 的终浓度是如下 1) 或 2) ： 0024 1)6-BA 的终浓度是 0.1-0.3mg/L， 所述 NAA 的终浓度是 0.01-0.1mg/L ； 0025 2)6-BA 的终浓度是。
20、 0.2mg/L， 所述 NAA 的终浓度是 0.05mg/L。 0026 上述碳源优选是蔗糖， 所述蔗糖在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是 30g/L ； 上 述凝胶剂优选是琼脂， 所述琼脂在所述丛生芽伸长培养基的终浓度是 8g/L。 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A4/7 页 6 0027 上述生根培养基是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基 ： IBA、 碳 源和凝胶剂 ； 所述MS基本培养液的溶剂是水、 溶质如表1所示 ； 所述生根培养基中IBA的终 浓度是 0.25-1mg/L。 0028 进一步， 上述生根培养基中 IBA 的终浓度。
21、是 0.5mg/L ； 所述碳源优选是蔗糖， 所述 蔗糖在所述生根培养基的终浓度是 30g/L ； 所述凝胶剂优选是琼脂， 所述琼脂在所述生根 培养基的终浓度是 8g/L。 0029 上述植物可以是双子叶植物或单子叶植物， 优选是葫芦科作物， 更优选是西瓜 ( 如京欣 1 号 )。 0030 实验证明 ： 从上述胚状体诱导培养基中的 11 个子房切片中共找到了 4 个撑破珠 被、 体积膨大的胚状体。其中 1 个难以再生， 最终没有得到再生植株 ； 其它 3 个形成丛生芽 R1、 R2和 R3。采用本发明提供的植物单倍体的生产方法， 利用流式细胞仪检测分析可知所有 来源于 R2胚的再生植株的 D。
22、NA 相对含量在 100 附近， 表明来源于 R2胚的所有再生植株的倍 性为单倍体。证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法是可行的， 在西瓜花 药与小孢子离体培养没有取得重大突破情况下， 这无疑为西瓜单倍体育种开辟了一条新途 径。 附图说明 0031 图 1 为胚状体诱导形成照片。 0032 图 2 为胚状体萌发形成丛生芽的照片。 0033 图 3 为丛生芽伸长的照片。 0034 图 4 为伸长的丛生芽生根的照片。 0035 图 5 为流式细胞仪鉴定再生植株倍性图。 0036 图 6 为 SSR 引物对亲本、 F1 及再生植株的扩增结果。 0037 图 7 为获得单倍体植株的流程图。。
23、 具体实施方式 0038 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实施例。 0039 下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0040 实施例 1、 单倍体植株的生产及其鉴定 0041 一、 单倍体植株的生产 0042 操作过程如图 7 的流程图所示。 0043 1. 取样 ： 取西瓜 ( 京欣 1 号， 北京京研益农科技发展中心 ) 的开花前一天的未授 粉子房。 0044 2. 表面消毒 ( 在无菌操做台内 ) ： 0045 (1) 用 70的酒精擦拭子房表面 ； 0046 (2) 用 10的 NaClO 溶液灭菌 10 分钟 ； 0047 (3) 无菌水冲洗 。
24、3-4 次 ； 0048 (4) 用无菌的镊子固定子房， 用无菌的手术刀将子房横切成片， 厚度 0.5-1.0mm， 准备接种。 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A5/7 页 7 0049 3. 胚状体诱导与萌发 ： 0050 将步骤 2 得到的子房切片接种于胚状体诱导培养基， 在 25暗培养 4 天， 然后在 25下光照培养， 培养条件 ： 温度 25 ； 光强， 光暗交替培养时间 16h/8h) 0051 其中， 胚状体诱导培养基， 是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的固体培养 基 ： 细胞分裂素 (6-BA)、 生长素 (2， 4-D)、 蔗糖和。
25、琼脂 ； 所述胚状体诱导培养基中 6-BA 的终 浓度是 1.5mg/L， 所述 2， 4-D 的终浓度是 1mg/L ； 蔗糖 30g/L， 琼脂 8g/L， 所述 MS 基本培养液 的溶剂是水、 溶质如表 1 所示。 0052 培养结果的观察 ： 含胚珠的胎座组织迅速生长， 个别胚珠体积逐渐膨大， 珠被颜色 由接种时的淡黄色逐渐变为深绿色， 说明在离体条件下西瓜雌核发育已经启动。接种后 15 天左右， 胎座组织逐渐失绿、 褐化， 直至死亡 ； 个别体积明显膨大的胚珠， 其珠被组织可能经 过木栓化过程而逐渐失绿、 黄化， 其生长发育似乎处于停滞状态， 但随着培养时间的推移， 黄化的珠被组织逐。
26、渐破裂， 这是可能由于胚囊细胞不断生长发育而形成胚状体， 随着胚状 体体积的日益增大， 最终撑破已黄化的珠被。 露出珠被的胚状体的颜色由黄逐渐变绿， 最终 形成发育状态不同胚状体， 结果如图 1 所示。从 11 个子房切片中共找到了 4 个撑破珠被、 体积膨大的胚状体。其中 1 个难以再生， 最终没有得到再生植株 ； 其它 3 个形成丛生芽， 结 果如图 2 所示， 分别将它们命名为 R1、 R2和 R3。 0053 4. 丛生芽伸长 0054 为了促进丛生芽伸长， 分别将步骤 3 中的 R1、 R2和 R33 个胚状体再生的丛生芽切割 成小块， 再转入到丛生芽伸长培养基， 得到伸长的丛生芽。。
27、 15天后再生植株株高长到2cm左 右， 结果如图 3 所示。 0055 其中， 丛生芽伸长培养基是在 MS 基本培养液中添加如下物质得到的培养基 ： 6-BA、 NAA、 蔗糖和琼脂 ； 所述 MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表 1 所示 ； 所述丛生芽伸长 培养基中 6-BA 的终浓度是 0.2mg/L， NAA 的终浓度是 0.05mg/L， 蔗糖 30g/L， 琼脂 8g/L。 0056 5. 根系诱导 0057 将步骤 4 得到的伸长的丛生芽转入生根培养基促进生根， 7d 后长出主根， 最终形 成完整的再生植株， 结果如图 4 所示。 0058 其中， 生根培养基是在MS基本培养。
28、液中添加如下物质得到的培养基 ： IBA ； 所述MS 基本培养液的溶剂是水、 溶质如表 1 所示 ； 所述生根培养基中 IBA 的终浓度是 0.5mg/L， 蔗 糖 30g/L， 琼脂 8g/L。 0059 二、 再生植株的鉴定 0060 1. 再生植株的倍性鉴定 0061 由于细胞核 G1 期的 DNA 含量反应一个细胞的倍性， 因此常用 DNA 含量来估计细胞 的倍性。流式细胞术 (Flow Cytometry) 是通过测定叶片单个细胞核内 DNA 含量， 根据 DNA 含量的曲线图来推断细胞的倍性， 从而快速鉴别植株的染色体倍性水平。流式细胞测定法 特别是在离体培养过程中， 试管中的芽。
29、或小植株很小和很嫩时， 该方法仅用 1cm2的样品就 很容易鉴定其材料倍性， 而且准确率高。 其特点是制样简单， 测试速度快， 灵敏度、 分辨率及 准确性较高， 所以流式细胞测定法特别适合于样品较多的倍性检测分析。 0062 来源于 3 个胚状体 R1、 R2和 R3的再生植株随机各取 5 株， 利用美国 BD 公司生产 的 BD FACSCalibur 流式细胞仪对植株倍性进行鉴定。具体方法为 ： 取大于 1cm2的植株叶 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A6/7 页 8 片， 在 55mm 的小塑料培养皿中用锋利的剃须刀片切碎叶片， 加入 400ul 的。
30、提取液 (15mol/ lTris-HCl(pH7.5)， 80mol/lKCl， 20mol/lNaCl， 20mol/lEDTA-Na2， 15mol/l 巯基乙醇， 0.05的 Triton X-100。) 放置 1 分钟， 再用 50um 的微孔尼龙网过滤， 滤液收集在上机测 试用的标准试管中， 然后于 1000/min 离心 8 分钟， 弃去上清液， 再加入 1ml 的 PI( 碘化丙 啶 ) 染色液， 在黑暗低温处染色 20 分钟， 在整个操作过程中， 试管均应放在冰盒里 ( 离心时 除外 )， 之后就可上机检测。 0063 结果如图 5( 图中 A 是对照西瓜的 DNA 相对含量。
31、 ( 二倍体 ) ； B 是来自 R1胚的再生 植株的 DNA 相对含量 ； C 是来自 R2胚的再生植株的 DNA 相对含量 ； D 来自 R3胚的再生植株 的 DNA 相对含量 ) 所示。从图 5 看出， 二倍体对照的 DNA 相对含量在 200 附近， 所有来源于 R1和 R3胚的再生植株的 DNA 相对含量也在 200 附近， 表明来源于 R1和 R3胚的再生植株均 为二倍体 ； 所有来源于 R2胚的再生植株的 DNA 相对含量均如图 5C 所示在 100 附近， 表明来 源于 R2胚的再生植株的倍性为单倍体。 0064 2. 再生植株 SSR 标记的遗传分析 (P1： 父本 ； P2。
32、： 母本 ； F1： 京欣 1 号 ) 0065 在进行SSR标记分析之前， 预期结果是 ： 如果SSR引物扩增的带型与亲本之一的一 致， 再生植株应该是单倍体或双单倍体 ； 如果 SSR 引物扩增的带型与 F1的一致， 再生植株应 该是珠被组织增生形成的二倍体。 0066 利用 160 对 SSR 引物对供试杂交组合 P2/P1的两个亲本 P1与 P2进行多态性分析， 结果找到 3 对在亲本 P1与 P2间具有多态性的引物 SSR58、 SSR106和 SSR125。利用这 3 对引物 对 P1、 P2、 F1以及倍性鉴定的 15 个再生植株的 DNA 进行 PCR 扩增， 结果如图 6 和。
33、表 2 所示。 0067 表 2.SSR 引物扩增结果的标记基因型 0068 0069 注 ： 父本、 母本、 杂合体带型分别用 a， b， h 表示。 0070 从图 6 和表 2 看出， 对 R2胚的 5 个再生植株， 3 个引物扩增的带型与亲本之一的一 致， 这证实了倍性鉴定结果， 因为倍性鉴定结果证明来源于 R2胚的 5 个再生植株为单倍体。 0071 3 个 SSR 引物对 R1和 R3胚诱导的再生植株扩增的带型与我们预期的完全不同。 0072 对 R3胚的 5 个再生植株， 引物 SSR58扩增的带型与亲本之一的一致， 而引物 SSR106 和 SSR125扩增的带型与 F1的一致。
34、。尤其是对 R1胚诱导的再生植株， 3 个引物扩增的带型不 完全一致。 0073 引物 SSR58在 R11 和 R14 上扩增的带型与 P2的一致， 而在 R12、 R13 和 R15 上扩增的 带型与 F1的一致 ； 引物 SSR106和 SSR125在 R12、 R13、 R15 上扩增的带型与亲本 P1的一致， 而在 R11、 R14上扩增的带型与F1的一致。 而且对同一植株不同引物扩增的带型也不完全一致， 有 的引物扩增的带型与亲本之一的一致， 而有的引物扩增的带型与 F1的一致。 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A7/7 页 9 0074 结合 。
35、SSR 标记分析与倍性鉴定结果， 认 R1和 R3胚诱导的再生植株可能为双单倍 体。在离体培养过程， 由胚囊单倍体细胞形成的 R1和 R3胚状体可能发生自然加倍而形成双 单倍体， 因为存在SSR引物对R1和R3胚诱导的再生植株扩增的带型与亲本之一的一致的情 况。然而， 同时存在 SSR 引物对 R1和 R3胚诱导的再生植株扩增的带型却与 F1的一致的情 况， 后一种情况可能是由于在胚囊单倍体细胞形成之前发生不等交换形成 2n 配子所造成 的。但至今不清楚的是为什么源于同一个胚的再生植株 SSR 标记遗传分析结果同时存在上 述两种结果。因此， R1和 R3胚诱导的再生植株是否是双单倍体还有待于通。
36、过对其自交后代 进行 SSR 标记和形态标记性状的遗传分析来确定。 0075 尽管如此， 初步研究结果证明了利用未授粉胚珠离体培养获得西瓜单倍体的方法 是可行的， 在西瓜花药与小孢子离体培养没有取得重大突破情况下， 这无疑为西瓜单倍体 育种开辟了一条新途径。 说 明 书 CN 102239802 A CN 102239805 A1/4 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102239802 A CN 102239805 A2/4 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 102239802 A CN 102239805 A3/4 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 102239802 A CN 102239805 A4/4 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 102239802 A 。