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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410569020.0 (22)申请日 2014.10.23 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 绍兴文理学院 地址 312000 浙江省绍兴市环城西路 508 号 (72)发明人 汤访评 张建行 (74)专利代理机构 杭州裕阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33221 代理人 应圣义 CN 102422816 A,2012.04.25, 全文 . JP 特开平 5-168358 A,1993.07.02, 全文 . RU 2302106 C1,2007.07.10, 全文 . CN 101049090 A,20。
2、07.10.10, 全文 . RU 2012117407 A,2013.11.10, 全文 . CN 102369880 A,2012.03.14, 全文 . 任中翔 . 草莓胚状体形态发生的影响因 素 .吉林蔬菜 .2009,( 第 2 期 ), 第 74-75 页 . (54) 发明名称 一种获得草莓脱毒苗的方法 (57) 摘要 本发明提供一种草莓脱毒苗快速繁殖的方 法， 具体步骤如下 ：（1）取材灭菌 ；（2）花蕾培 养 ： 灭菌后的花蕾除去萼片接种到配置好的 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 的培养基中培 养， 生长出丛芽 ；（3） 扩繁培养 ： 将长。
3、成的丛芽转 接到 MS + 6-BA 0.1 mg/L 的培养基上扩繁培养 ； （4）诱导生根 ： 从丛芽上切取草莓大苗， 转接到 1/2 MS + NAA 0.1 mg/L的培养基上诱导其生根， 剩余愈伤组织在转接至MS + 6-BA 0.1 mg/L的培 养基上培养 ；（5） 炼苗 ： 将长根的草莓苗从培养瓶 移栽至培养盘中， 在温室中进行壮苗生长。 利用本 发明获得脱毒苗方法简便， 获得到的种苗生长健 壮， 匍匐茎繁殖速度快， 品质良好。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姜岚 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 CN 10。
4、4429940 B 2016.06.29 CN 104429940 B 1.一种获得草莓脱毒苗的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1） 取材灭菌： 利用草莓未开放的花蕾， 灭菌处理； 2） 花蕾培养： 将灭菌后的花蕾除去萼片， 接种到配置好的培养基中培养， 所述培养基为 MS培养基， 加入浓度为0.4-2.5mg/L 的6-BA ， 浓度为0.02-0.2 mg/L的 NAA进行培养， 生长 出丛芽； 3） 扩繁培养： 将长成的丛芽直接或者切分转接到加入浓度0.05-2.0mg/L的 6-BA的MS 培养基进行扩繁培养； 4） 诱导生根： 经过扩繁培养后， 从丛芽上切取草莓大苗， 转接到加。
5、入浓度为0.1 mg/L NAA的1/2 MS培养基上诱导其生根， 剩余愈伤组织在转接至MS + 6-BA 0.1 mg/L的培养基 上培养； 5） 壮苗炼苗： 在移栽前， 将苗转接到不加任何激素的MS培养基上； 将壮苗处理后的草莓 苗从培养瓶移栽至培养盘中， 在温室中进行壮苗生长， 作为下一步匍匐茎繁殖的种苗。 2.根据权利要求1所述的获得草莓脱毒苗的方法， 其特征在于， 所述步骤2） 中6-BA的浓 度为1.0-1.5mg/L 。 3.根据权利要求1所述的获得草莓脱毒苗的方法， 其特征在于， 所述步骤2） 中NAA的浓 度为0.05-0.15 mg/L。 4.根据权利要求1所述的获得草莓脱。
6、毒苗的方法， 其特征在于， 所述步骤3） 中6-BA的浓 度为0.1 mg/L。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104429940 B 2 一种获得草莓脱毒苗的方法 技术领域 0001 本专利是一种利用草莓花蕾进行草莓脱毒苗工厂化生产的方法， 涉及草莓组织培 养、 脱毒苗工厂化生产等方法， 属于现代农业育苗技术领域。 背景技术 0002 离体快繁 （in vitro propagation） 和植物脱毒 （virus-free） 是目前植物组织培 养应用最多、 最有效的方面。 生产上许多无性繁殖作物均受到病毒的侵染， 从而导致品种的 严重退化、 减产和降低品质。 利用植物分生组织进。
7、行培养可以使新长成的植株脱去病毒， 并 对脱病毒苗进行扩繁。 利用这种方法生产无病毒的农作物有马铃薯、 甘薯、 大蒜、 草莓、 苹 果、 香蕉等， 并已经大规模应用于生产。 0003 草莓作为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物， 目前市场上需求 量日益增多。 按照这种传统的匍匐茎繁殖和分枝繁殖繁殖方式， 经多年栽培后， 很容易感染 多种病毒， 致使种性严重退化、 产量降低、 品质变劣和抗性降低等。 因此， 如何改善草莓品质 和提高其抗病性己越来越受到人们的关注。 草莓品种改良多采用常规杂交育种技术， 但育 种周期长， 选择效率低。 近年来发展的现代生物技术为草莓。
8、育种提供了新途径， 它可以获得 常规育种难以或无法得到的新类型， 从而创造出新的种质。 现代生物技术在植物中的应用 是随着植物组织培养技术的发展而兴起的。 草莓的组织培养开展得较早， 80年代以来， 草莓 的各种器官、 组织和细胞的培养迅速发展起来， 开展了花药培养、 叶片培养、 茎尖培养、 原生 质体培养和细胞悬浮培养等方面的研究， 并取得了一定的进展。 0004 自1963年Miller首次报道了利用草毒茎尖进行离体培养获得再生植株以来， 国内 外相继有不少学者进行了这方面的研究。 主要是利用茎尖培养达到快速繁殖和脱除草毒病 毒的目的。 覃兰英等建立了草毒茎尖离体大量繁殖体系， 14 d可。
9、以从一株苗得到10株苗， 而 且生根率及移栽成活率均很高。 李青等认为， 生根培养基可用1/2 MS大量元素的培养基， 糖 的用量可减少到15 g/L， 可用砂糖代替蔗糖， 亦可省去琼脂进行液体培养， 均不影响幼苗生 长， 从而可降低育苗成本。 0005 郭春沅等提出草莓花药组织培养快速繁殖技术， 培养条件为22 - 25 OC， 每天光 照18小时3000 LX， 大约15 - 25天即可形成大量的愈伤组织。 愈伤组织诱导培养基组成为： MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。 刘亚东,吴涛,朱玉灵等进行了新品种 “鬼怒甘” 的 引进和组培脱毒技术研究。 茎尖组培。
10、脱毒试验结果表明:该品种的最佳诱芽培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L,最佳生根培养基为MS + NAA 0.05 mg/L； 并研究了无毒 苗的炼苗及移栽技术。 0006 众多的实验研究发现， 在组织培养过程中激素的种类和配比是重要的外部调节手 段。 在草毒的花药培养过程中， 存在的主要问题是出愈率低和形成不定芽困难， 关于激素条 件对草毒花药培养的影响， 国内外均有报道。 马洪民等用不同培养基培养花药， 发现仅附加 NAA 花药不发育成愈伤组织: 若以 F + IAA 0.2 mg/L + BA 2.0 mg/L培养， 则花药可形 成胚性愈伤组织再生成。
11、植株或花蕾， 也可直接形成植株； 杭玲等以MS为基本培养基， 加入BA 说 明 书 1/5 页 3 CN 104429940 B 3 O.5 mg/L + 2,4-D O.25 mg/L， 花药愈伤组织诱导率达97.7%； 吴伟民等发现， 当分化培养 基使用的外源激素BA, ZT, CPPU, KT浓度均为2 mg/L时， BA优于ZT, CPPU和KT， 而以1 mg/ LCPPU作为继代培养的外源激素有利于保持愈伤组织的胚性； 侯喜林等报道， MS十NAA O.l mg/L + BA 5.O mg/L最有利于不定芽成； Faedi等发现在MS培养基上附加0.Ol mg/L的KT可 诱导胚性。
12、愈伤高频率发生。 一些研究者发现， 除激素外， 在诱导分化时分化培养基中添加5 - 15 mg/L AgNO3均可提高不定芽的分化率， 以8 mg/L AgNO3效果最佳； 韩雪梅提出培养基 总15 mol/L(其中硝态氮1O mol/L,按态氮5 mol/L)， 其他成分同MS的花药培养植株分化率 比MS有明显提高。 另有研究者报道花药4 低温预处理48 h对于提高花药产生愈伤组织的 能力有明显效应。 但是目前的草莓种苗培养仍存在种苗质量差、 脱毒培养周期长两个问题。 发明内容 0007 本发明是针对目前存在的问题， 提供一套新的草莓脱毒苗快速繁殖的方法， 以达 到高效工厂化生产的目的， 形。
13、成一套草莓脱毒苗快速繁殖的技术。 0008 本发明是利用植物组织培养技术， 针对草莓的花蕾作为外植体进行诱导培养， 选 择最佳激素配比， 使其发育成完整的植株为草莓的组织培养提供一个新的技术。 快速繁殖 脱病毒草莓幼苗， 建立工厂化草莓组培苗的生产体系， 为我国草莓产业提供大量高质量种 苗， 弥补草莓市场的不足。 0009 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案来实现： 0010 利用植物组织离体快繁的方法， 包括以下步骤： 0011 1） 取材灭菌： 利用草莓未开放的花蕾， 灭菌处理； 0012 2） 花蕾培养： 将灭菌后的花蕾除去萼片， 接种到配置好的培养基中培养， 所述培养 基为MS培。
14、养基， 加入浓度为0.4-2.5mg/L 的6-BA ， 浓度为0.02-0.2 mg/L的 NAA进行培养， 生长出丛芽； 0013 3） 扩繁培养： 将长成的丛芽直接或者切分转接到加入浓度0.05-2.0mg/L的 6-BA 的MS培养基进行扩繁培养； 0014 4） 诱导生根： 经过扩繁培养后， 从丛芽上切取草莓大苗， 转接到加入浓度为0.1 mg/L NAA的1/2 MS培养基上诱导其生根， 剩余愈伤组织在转接至MS + 6-BA 0.1 mg/L的培 养基上培养； 0015 5） 壮苗炼苗： 在移栽前， 将苗转接到不加任何激素的MS培养基上； 将壮苗处理后的 草莓苗从培养瓶移栽至培养。
15、盘中， 在温室中进行壮苗生长， 作为下一步匍匐茎繁殖的种苗。 0016 优选的， 所述步骤2） 中6-BA的浓度为1.0-1.5mg/L ； 更优选的， 6-BA的浓度为 1.0mg/L 。 0017 优选的， 所述步骤2） 中NAA的浓度为0.05-0.15 mg/L； 更优选的， NAA的浓度为0.1 mg/L 0018 优选的， 所述步骤3） 中6-BA的浓度为0.1 mg/L。 0019 本发明采用的植物组织离体快繁获得脱毒苗的方法， 比现有的草莓脱毒技术有以 下优点和积极效果： 0020 花蕾之所以成为优越于其他草莓组织培养的最佳外植体： 一方面， 从取材和外植 体消毒方面来看， 茎。
16、叶柄相对接近土壤， 受杂菌污染较为严重， 一旦消毒不净， 就易引起培 说 明 书 2/5 页 4 CN 104429940 B 4 养基污染， 外植体死亡。 而花蕾就不同， 其中， 由于花蕾处于要开而没有开放的状态， 花蕾由 花瓣包围， 内部几乎处于无菌的状态， 极易表面消毒； 同时， 克服了选取茎或叶作为外植体 时往往产生褐变的状况； 再次， 此时间段的花蕾也不是太幼嫩， 便于在无菌条件下剥掉花 萼， 以及避免切割时破坏外植体， 从而避免消毒难及操作困难等。 0021 另一方面， 分析诱导率、 成活率及分化的容易程度。 相对而言， 花蕾极易诱导分化 成苗， 在不同激素配比的培养基上较易诱导不。
17、定芽的产生及诱导分化生根。 而叶片、 叶柄容 易褐化、 玻璃化， 产生的愈伤组织不易诱导生根发芽， 最终死亡。 0022 除此之外， 更为重要的是， 花蕾在MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L培养基中 诱导一次性成苗， 愈伤组织形成很少， 在诱导培养基中继代培养后能分化成茎、 叶。 这为保 持原有品种的优良品性， 鉴定其遗传稳定性有重要意义。 0023 进一步的， 在移栽前， 将苗转接到不加任何激素的MS培养基上， 可以提高苗移栽的 成活率。 0024 经大田试验， 脱毒苗年发苗率超过100棵/棵,远远好于带病毒草莓苗， 实际效果很 好。 具体实施方式 0025 。
18、下面结合实施例对本发明进行详细描述。 0026 本发明所提供的利用草莓花蕾进行草莓脱毒苗快速繁殖的技术方法， 其具体实施 方式如下： 0027 1)外植体的获得与消毒 0028 取草莓花蕾， 在流动的自来水下冲洗1-2小时。 花蕾外面有花被包裹着， 使其与外 界隔离， 其内部处于无菌状态， 极易表面消毒， 经1-2小时水流后即可进行消毒操作。 0029 在超净工作台上用70%酒精表面消毒30秒， 然后用约14%的双氧水消毒15分钟， 再 用无菌水冲洗3遍， 然后将花蕾去除外层苞叶后接种于事先准备好的诱导培养基上。 0030 2)激素的选取 0031 花蕾常规的消毒处理后， 在超净工作台上花蕾去。
19、除外层萼片， 将处理好的外植体 接种在NAA固定浓度为0.1 mg/L， 6-BA为0.4-3.5 mg/L的培养基上； 以及6-BA固定浓度为 1.0 mg/L， 不同NAA浓度的培养基上。 实验结果见表1 0032 花蕾在不同激素浓度培养基上的发育情况： 表1 说 明 书 3/5 页 5 CN 104429940 B 5 0033 0034 （在6-BA浓度为2.0-2.5 mg/L时， 虽诱导率较高， 但出现褐化现象） 0035 由表1可得： 对激素浓度的筛选得出， 花蕾的诱导培养以MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L组合最好。 0036 3)诱导芽的分化及。
20、扩繁 0037 花蕾在诱导培养基上培养几代后， 愈伤组织不断膨大， 并且有幼小芽体的分化， 芽 体逐渐长成小植株。 对这些丛生芽体进行切割， 再将其接种到不同激素配比的MS培养进行 诱导芽的分化。 在这一试验中我们分四个处理， 处理结果见表2。 0038 表2 0039 0040 由表2可得： 最佳的扩繁培养基为MS+6-BA0.1 mg/L 0041 4)诱导生根 0042 经过扩繁培养后， 从丛芽上切取草莓大苗， 剩余愈伤组织在转接至MS + 6-BA 0.1 mg/L的培养基上培养。 当继代苗长至45 左右, 切割下的这些小苗， 将芽体分开转入1/ 2 MS + NAA 0.1 mg/L。
21、培养基中培养生根。 大约10天左右,新生根出现,再隔5天左右,平均 每株生根23条,在不断产生。 0043 5） 壮苗炼苗 0044 在移栽前， 为了提高苗移栽的成活率， 将苗转接到不加任何激素的MS培养基上。 将 说 明 书 4/5 页 6 CN 104429940 B 6 壮苗处理后的草莓苗从培养瓶移栽至培养盘中， 在温室中进行壮苗生长， 作为下一步匍匐 茎繁殖的种苗。 0045 实施例1 0046 1)外植体的获得与消毒 0047 取草莓花蕾， 在流动的自来水下冲洗1-2小时。 在超净工作台上用70%酒精表面消 毒30秒， 然后用约14%的双氧水消毒15分钟， 再用无菌水冲洗3遍， 然后。
22、将花蕾去除外层苞叶 后接种于事先准备好的诱导培养基上。 0048 2)激素的选取 0049 花蕾常规的消毒处理后， 在超净工作台上花蕾去除外层萼片， 将处理好的外植体 接种在NAA浓度为0.1 mg/L， 6-BA为1.0 mg/L的培养基上。 0050 3)诱导芽的分化及扩繁 0051 花蕾在诱导培养基上培养几代后， 愈伤组织不断膨大， 并且有幼小芽体的分化， 芽 体逐渐长成小植株。 对这些丛生芽体进行切割， 再将其接种加入浓度为0.1 mg/L 6-BA的 MS培养进行诱导芽的分化。 在这一试验中我们分四个处理， 处理结果见表 0052 4)诱导生根 0053 经过扩繁培养后， 从丛芽上切。
23、取草莓大苗， 剩余愈伤组织在转接至MS + 6-BA 0.1 mg/L的培养基上培养。 当继代苗长至45 左右, 切割下的这些小苗， 将芽体分开转入1/ 2 MS + NAA 0.1 mg/L培养基中培养生根。 大约10天左右,新生根出现,再隔5天左右,平均 每株生根23条,在不断产生。 0054 5） 壮苗炼苗 0055 在移栽前， 将苗转接到不加任何激素的MS培养基上。 将壮苗处理后的草莓苗从培 养瓶移栽至培养盘中， 在温室中进行壮苗生长， 作为下一步匍匐茎繁殖的种苗。 0056 实施例2 0057 本实施例中其他步骤与实施例1相同， 唯一的区别是步骤2)激素的选取中， NAA浓 度为0.。
24、1 mg/L， 6-BA浓度为1.2 mg/L的培养基上。 0058 实施例3 0059 本实施例中其他步骤与实施例1相同， 唯一的区别是步骤2)激素的选取中， NAA浓 度为0.1 mg/L， 6-BA浓度为1.5 mg/L的培养基上。 0060 实施例4 0061 本实施例中其他步骤与实施例1相同， 唯一的区别是步骤2)激素的选取中， NAA浓 度为0.05mg/L， 6-BA浓度为1.0 mg/L的培养基上。 0062 实施例5 0063 本实施例中其他步骤与实施例1相同， 唯一的区别是步骤2)激素的选取中， NAA浓 度为0.15mg/L， 6-BA浓度为1.0 mg/L的培养基上。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104429940 B 7 。