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1、(10)申请公布号 CN 102550402 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102550402 A *CN102550402A* (21)申请号 201110335773.1 (22)申请日 2011.10.31 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 山东省农业科学院蔬菜研究所 地址 250100 山东省济南市工业北路 202 号 (72)发明人 董飞 陈运起 高莉敏 (54) 发明名称 大葱多倍体的诱导方法 (57) 摘要 本发明涉及大葱多倍体的诱导方法， 以大葱 种子为材料， 秋水仙素为诱导剂， 其特征在于秋水 仙素的浓度为介于 0.4 -1.0之间，。
2、 处理时间 在 24-48h 之间。采用本发明的方法， 可以显著的 提高大葱种子的变异株率， 可广泛应用于作物改 良。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种大葱多倍体诱导方法， 以大葱种子为材料， 秋水仙素为诱导剂， 其特征在于秋水 仙素的浓度为介于 0.4 -1.0之间， 处理时间在 24-48h 之间。 2. 根据权利要求 1 所述的诱导方法， 其特征在于秋水仙素浓度 0.8处理 48h。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的诱导方法， 其特征。
3、在于处理后的大葱种子置于超净工作 台上用消毒酒精漂洗 0.5 1min， 转入有效浓度 1-3 (v/v) 次氯酸钠消毒， 用无菌水冲 洗， 将灭过菌的种子接种到培养基上， 在光照强 10-40umol.m-2.s-1， 光照周期为 10-20h.d-1， 室温下培养。 4. 权利要求 1-3 任意一项所述的诱导方法在提高大葱种子的变异株率中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102550402 A 2 1/3 页 3 大葱多倍体的诱导方法 技术领域 0001 本发明涉及大葱四倍体的诱导方法， 属于植株组织培养领域。 背景技术 0002 大葱 (Allium fistulosum L.) 为百。
4、合科葱属二年生草本植物， 富含钙、 磷、 维生 素， 不仅味道鲜美， 而且具有医疗保健功效。 据FAO统计， 2009年我国栽培大葱面积达26560 公顷， 居世界第一位。 近年来， 大葱病害频发， 严重影响其品质， 因此利用细胞工程技术改良 大葱显得尤为重要。自 1937 年 Blakeslee 和 Avery 发现秋水仙素具有诱导细胞染色体加 倍效果以来， 多倍体育种作为一种改良作物的有效方法得到广泛应用。 0003 多倍体植株通常具有根茎粗壮、 叶片肥厚、 色绿、 叶柄变宽、 花器、 果实、 种子变大 的形态特点 ； 其生理活跃、 新陈代谢旺盛、 适应性强等特点， 为植株自身的生长发育提。
5、供了 更多的物质基础。 目前， 关于大葱不同组织器官的离体再生方面已有报道， 但对于大葱多倍 体诱导方面的报道较少。谢芝馨 (2004) 用秋水仙素处理大葱愈伤组织的过程中发现， 多数 愈伤由于秋水仙素的毒害作用慢慢褐化死亡， 最终得到的变异材料外形畸形， 很难生根 ； 宗 红 (2007) 在用秋水仙素诱导大葱愈伤组织时发现同样的问题， 由于秋水仙素的毒害作用， 愈伤组织褐化现象极其严重、 不定芽分化受阻。 发明内容 0004 针对上述现有技术的不足， 本发明提供了一种诱导四倍体大葱的方法。 0005 本发明一方面涉及一种大葱多倍体诱导方法， 以大葱种子为材料， 秋水仙素为诱 导剂， 其特征。
6、在于秋水仙素的浓度为介于 0.4 -1.0之间， 处理时间在 24-48h 之间。 0006 在本发明的一个优选实施方式中， 大葱种子使用秋水仙素浓度 0.8处理 48h。 0007 在本发明的另一个优选实施方式中， 采用上述方法处理后的大葱种子置于超净工 作台上用消毒酒精漂洗 0.5 1min， 转入有效浓度 1-3 (v/v) 次氯酸钠消毒， 用无菌水冲 洗， 将灭过菌的种子接种到培养基上， 在光照强 10-40umol.m-2.s-1， 光照周期为 10-20h.d-1， 室温下培养。 0008 本发明还涉及上述诱导方法在提高大葱种子的变异株率中的应用。 0009 为减轻秋水仙素的毒害作。
7、用， 以大葱种子为材料， 研究了秋水仙素处理浓度和时 间对大葱体细胞染色体加倍的效果， 并利用细胞染色体计数及流式细胞仪等方法进行倍性 鉴定。 结果表明， 秋水仙素浓度0.8处理48h的诱变效果最佳， 染色体压片表明， 四倍体染 色体数为 2n 4X 32， 二倍体植株为 2n 2X 16， 并且用流式细胞仪对倍性进行进一 步的分析验证。 采用本发明的方法， 可以显著的提高大葱种子的变异株率， 可广泛应用于作 物改良。 0010 在本发明中， 无如其它说明， 所述的浓度均指重量百分比浓度。 具体实施方式 说 明 书 CN 102550402 A 3 2/3 页 4 0011 1. 以章丘大葱种。
8、子为材料， 秋水仙素为诱导剂， 研究大葱染色体加倍的最佳处理 时间和处理浓度的组合。 0012 2. 秋水仙素处理浓度分别为 ： 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0， 处理时间分 别为 24h 和 48h， 共 12 个处理组合， 每个处理 100 粒种子。 0013 3.将大葱种子在秋水仙素中浸泡处理后， 置于超净工作台上用75(v/v)酒精漂 洗 0.5 1min， 转入有效浓度 2 (v/v) 次氯酸钠消毒 40min， 最后用无菌水冲洗 3-5 遍。 将灭过菌的种子接种到 MS 培养基上， 在光照强 30umol.m-2.s-1， 光照周期为 16h.d-1， 温度为。
9、 (251)的条件下培养。 0014 4. 培养 30 天后， 统计发芽数、 发芽率、 变异株数、 变异株率、 四倍体植株率 ( 表 1)。 0015 以植株粗壮、 叶色浓绿、 生长缓慢为形态变异标准， 统计变异株数及变异株率 ； 以 染色体计数及流式细胞仪的鉴定结果来统计四倍体植株率。 0016 表 1 秋水仙素不同浓度和处理时间的诱导效果 0017 说 明 书 CN 102550402 A 4 3/3 页 5 0018 注 ： 不同处理间差异显著性检验采用邓肯氏新复极差法。小写字母表示 0.05 水 平， 大写字母表示 0.01 水平。 0019 由表 1 可以看出， 随着秋水仙素浓度的升。
10、高和处理时间的延长， 植株的发芽率呈 现下降趋势。从多倍体诱变效果看， 0.4 -1.0的秋水仙素对大葱种子的诱导均有效 ； 相 同浓度下处理时间越长诱导率越高 ； 处理 24h 时， 随着秋水仙素浓度的升高诱导率也呈现 上升趋势 ； 处理 48h 时， 秋水仙素浓度在 0.2 -0.8时随浓度升高诱导率上升， 当浓度达 到1.0时， 由于浓度过高、 处理时间过长， 诱导率反而下降。 在12个处理组合中， 以秋水仙 素浓度 0.8处理 48h 的变异株率 (22 ) 最高， 为最佳组合。 0020 当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102550402 A 5 。