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1、(10)授权公告号 CN 102613086 B (45)授权公告日 2013.12.11 CN 102613086 B *CN102613086B* (21)申请号 201210102034.2 (22)申请日 2012.03.31 A01H 4/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 杨岚 向增旭 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 (54) 发明名称 一种铁皮石斛无激素组织培养的方法 (57) 摘要 本发明公开一种铁皮石斛无激素。
2、组织培养的 方法， 该方法包括铁皮石斛种子萌发为圆球茎， 圆 球茎的生长， 增殖分化， 茎段的生根、 壮苗四个组 织培养阶段， 这四个阶段所用的培养基依次为 ： 无激素的MS培养基、 无激素的MS基本培养基+土 豆泥1520g/l培养基、 无激素的MS基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l+ 土豆泥 15 20g/l 培养基 和无激素的1/2MS基本培养基+香蕉泥1520g/ l+ 土豆泥 15 20g/l 培养基。本发明无激素培 养和有激素培养得到的铁皮石斛培养物多糖和总 生物碱含量增加， 铁皮石斛的生长状况正常， 保护 了植物品种的遗传多样性， 本发明使得铁皮石斛 的组织培养更加方便、 。
3、绿色环保， 节约资源。 (51)Int.Cl. 审查员 陈仕高 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 (10)授权公告号 CN 102613086 B CN 102613086 B *CN102613086B* 1/1 页 2 1. 一种铁皮石斛无激素组织培养的方法， 其特征在于 ： 该方法包括铁皮石斛种子萌发为圆球茎， 圆球茎的生长， 增殖分化， 茎段的生根、 壮苗 四个组织培养阶段， 这四个阶段所用的培养基依次为 ： 无激素的 MS 培养基、 无激素的 MS 基 本培养基 + 土豆泥 15 20g/l 培养基。
4、、 无激素的 MS 基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l 土豆泥 15 20g/l 培养基和无激素的 1/2 MS 基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l + 土豆泥 15 20g/l 培养基 ； 所述的无激素的 MS 基本培养基以及无激素的 1/2 MS 基本培养基用水 均为普通自来水 ； 并且该组织培养方法具体包括以下步骤 ： a)将成熟铁皮石斛种子经过消毒处理， 播入无激素的MS基本培养基中培养2530天种 胚膨大、 萌发形成绿色的圆球茎 ； 培养条件 ： 培养温度 2327， 光照度 15002000 lx， 光照 时间 12h/d ； b) 将圆球茎转入无激素的 MS 培养基 。
5、+ 土豆泥 15 20g/l 培养基中， 培养 25 30 天， 圆球茎重叠堆积在无激素培养基中， 并有叶原基和分化苗出现 ； 培养条件 ： 培养温度 2327， 光照度 15002000 lx， 光照时间 12h/d ； c) 将圆球茎分化苗转入无激素的 MS 基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l 土豆泥 15 20g/l 培养基中， 诱导 2030 天后有叶原基和高度达到 12 cm 小苗出现， 继代培养 30 天成 为中苗 ； 培养条件 ： 培养温度 2327 ， 光照度 15002000 lx， 光照时间 12h/d ； d) 将中苗转入 1/2 MS 基本培养基 + 香蕉泥 15。
6、 20g/l + 土豆泥 15 20g/l 的无激 素培养基中， 25 30 天培育出 5cm 高以上的大苗并炼苗移栽， 炼苗时保证 75% 80% 的含 水量 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 15002000 lx， 光照时间 12 h/d ； 以上四种培养基pH 5.65.8， 均含30g/l蔗糖， 6g/l琼脂 ； 土豆泥和香蕉泥均为新鲜土 豆和新鲜香蕉的捣碎获得。 权 利 要 求 书 CN 102613086 B 2 1/7 页 3 一种铁皮石斛无激素组织培养的方法 技术领域 0001 本发明属于农业技术领域， 具体涉及一种铁皮石斛无激素组织培养的方法。 背景技术 0。
7、002 铁皮石斛 (Dendrobium officinale) 为多年生草本， 属附生兰类， 俗名铁皮枫斗， 因其老茎外呈黑色， 又名为黑节草， 石斛是常用的名贵中药， 应用历史悠久， 在 神农本草 经 中被列为上品， 现已证实它具有滋阴清热、 生津益胃、 止咳润肺、 润喉明目、 提高人体免 疫功能、 防治肿瘤和心血管疾病以及改善睡眠、 防治白内障、 延年益寿等功效。但由于生长 环境特殊和分布局限， 以及长期采挖， 自然资源日趋枯竭， 已被国家列为重点保护的野生药 材并鼓励人工大面积栽培铁皮石斛， 变野生为家种， 以保障铁皮石斛资源的可持续性发展 和利用。 0003 铁皮石斛主要分布在亚热带。
8、地区， 我国分布在西南和南方沿海各省， 铁皮石斛种 子极小， 无胚乳， 自然条件下需与某些真菌共生才能萌发， 很难用实生苗栽培， 而传统的分 株、 扦插等方式的繁殖率极低， 加上人为地过度采挖， 已濒临灭绝， 为了保持品种的优良性 状， 又能快速大量繁殖， 通过铁皮石斛蒴果或者茎尖组织培养技术产生原球茎， 在原球茎阶 段进行增殖培养， 再使原球茎分化苗繁育成小植株， 1 年内可以从原球茎繁育出百万株试管 苗。 铁皮石斛组织培养技术的研究， 能有效地挽救这一濒临灭绝的珍稀物种， 而且可以使重 要的种质资源得以保存。 0004 由于铁皮石斛具有巨大的药用价值， 导致了长期无节制的采摘， 致使资源濒。
9、临枯 竭。1987 年国家已将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种， 国家第一批 中国珍稀濒 危保护植物名录 也将其列入其中。为了更好地保护铁皮石斛野生资源， 变野生为家种， 应大力发展规模化人工栽培， 切实保障铁皮石斛资源的可持续利用。从 20 世纪 70 年代 起， 国内外有关机构便开始了铁皮石斛的研发工作， 尤其在铁皮石斛的组织培养技术领域， 但是一般组织培养过程中培养基的配制需要大量激素， 比如 “一种铁皮石斛快繁的组培方 法” ( 申请号 ： 2008101108704.5)、“一种铁皮石斛茎尖组培快速繁殖的育种方法” ( 申请号 ： 200710066480.1)、“通过植物组织培。
10、养对铁皮石斛进行优良植物体的诱导和继代增殖培养 的方法” ( 申请号 ： 201110035697.2) 等， 不但消耗了大量的资源， 破坏了植物的遗传多样 性， 扰乱了自然生长的规律性， 增加了组培生产成本。 发明内容 0005 本发明针对目前铁皮石斛组培过程中使用各种激素的问题提供一种更加环保、 绿 色、 低成本、 便捷的铁皮石斛无激素组织培养的方法， 该方法减少在培养基配制过程中的资 源浪费和时间消耗， 为大规模的组培生产提供有利条件。 0006 本发明的目的是通过以下方式实现的 ： 0007 一种铁皮石斛无激素组织培养的方法， 该方法包括铁皮石斛种子萌发为圆球茎， 圆球茎生长， 增殖分。
11、化， 茎段的生根、 壮苗四个组织培养阶段， 这四个阶段所用的培养基依 说 明 书 CN 102613086 B 3 2/7 页 4 次为 ： 无激素的 MS 培养基、 无激素的 MS 基本培养基 + 土豆泥 15 20g/l 培养基、 无激素的 MS 基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l+ 土豆泥 15 20g/l 培养基和无激素的 1/2MS 基本培 养基 + 香蕉泥 15 20g/l+ 土豆泥 15 20g/l 培养基。 0008 所述四个阶段采用的培养条件 ： 培养温度2327， 光照度15002000lx， 光照 时间 12h/d。 0009 上述组织培养方法具体包括以下步骤 ： 。
12、0010 a) 将成熟铁皮石斛蒴果或铁皮石斛种子经过消毒处理， 播入无激素的 MS 基本培 养基中培养 25 30 天种胚膨大、 萌发形成绿色的圆球茎 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0011 b) 将圆球茎转入无激素的 MS 培养基 + 土豆泥 15 20g/l 培养基中， 培养 25 30 天， 圆球茎重叠堆积在无激素培养基中， 并有叶原基和分化苗出现 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0012 c) 将圆球茎分化苗转入无激素的 MS 基本培养基 + 香。
13、蕉泥 15 20g/l+ 土豆泥 15 20g/l 培养基中， 诱导 20 30 天后有叶原基和高度达到 1 2cm 小苗出现， 继代培养 30 天成为中苗 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0013 d) 将中苗转入 1/2MS 基本培养基 + 香蕉泥 15 20g/l+ 土豆泥 15 20g/l 的无 激素培养基中， 2530天培育出5cm高以上的大苗并练苗移栽， 练苗时保证7580的 含水量 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0014 以上四种培养基 p。
14、H 5.6 5.8， 均含 30g/l 蔗糖， 6g/l 琼脂。土豆泥和香蕉泥均 为新鲜土豆和新鲜香蕉的捣碎获得。 0015 本发明所述的无激素的 MS 基本培养基 ( 又称 MS 培养基 ) 以及无激素的 1/2MS 基 本培养基 ( 又称 1/2MS 培养基 ) 用水均为普通自来水。 0016 由于目前铁皮石斛组培过程中使用各种激素产生了多种问题， 本发明在组培培养 基配置过程中不添加任何激素， 并且根据不同时期的不同需求， 用天然的土豆泥和香蕉泥 作为营养成分代替激素， 不但大大的降低了生产成本， 而且更加环保， 符合目前绿色农业的 发展需求， 培养出的铁皮石斛苗比有激素组织培养培养出的。
15、苗在指标成分高， 减少在培养 基配制过程中的资源浪费和时间消耗， 为大规模的组培生产提供有利条件。 0017 与现有技术比较本发明的有益效果 ： 铁皮石斛组织培养过程中培养基的配制非常 重要， 培养基不但要求在无菌条件下， 最重要的是要给铁皮石斛的生长提供所需的及适宜 的生长环境。传统 MS 培养基的配制需要大量元素、 微量元素、 有机物、 铁盐、 蔗糖、 激素、 琼 脂和蒸馏水， 而激素价格昂贵， 植株生长容易产生依赖性。 本发明铁皮石斛无激素组织培养 的方法中培养基的配制不添加任何激素， 根据不同时期的不同需求， 用土豆泥或香蕉泥代 替激素提供营养成分。本发明采用无激素的改良 MS 培养基。
16、进行组培， 不但对铁皮石斛组织 培养四个不同阶段的正常生长没有任何影响， 而且大大的降低生产成本， 另外， 本发明采用 自来水代替蒸馏水， 也节约了更多的能源物质、 减少不必要的浪费， 达到了中药材生产过程 中高效、 安全、 绿色、 可控、 低成本的要求。 具体实施方式 0018 以下结合实施例对本发明做进一步说明。以下实施例对铁皮石斛原球茎培养， 圆 说 明 书 CN 102613086 B 4 3/7 页 5 球茎的生长， 圆球茎的增殖分化， 茎段的壮苗、 生根四个阶段进行组织培养。 0019 实施例 1 0020 铁皮石斛无激素组织培养方法 ： 0021 a) 将从野外收集到的成熟铁皮石。
17、斛蒴果或铁皮石斛种子经过消毒处理， 播入无激 素的 MS 培养基中培养 25 天种胚膨大、 萌发形成绿色的圆球茎 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0022 b) 将圆球茎转入无激素的基本 MS 基本培养基 + 土豆泥 20g/l 培养基中， 培养 25 天， 圆球茎重叠堆积在无激素培养基中， 并有叶原基和分化苗出现 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0023 c)将圆球茎分化苗转入无激素的MS基本培养基+香蕉泥15g/l+土豆泥15g/l培 养基中， 诱导 。
18、20 30 天后有叶原基和高度达到 1 2cm 小苗出现， 继代培养后 30 天成为 中苗 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0024 d) 将中苗转入 1/2MS 基本培养基 + 香蕉泥 15g/l+ 土豆泥 15g/l 的无激素培养基 中， 25 30 天培育出 5cm 高以上的大苗并练苗移栽， 练苗时要保证在 75 80的含水 量， 保持空气湿润 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/ d ； 0025 以上四种培养基 PH 均为 5.8， 均含 30g/l 蔗糖，。
19、 6g/l 琼脂。 0026 其中， 无激素的MS基本培养基+香蕉泥15g/l+土豆泥15g/l培养基成分组成(定 容时采用普通自来水 ) ： 0027 组成成分 数量 (mg/l) 组成成分 数量 (mg/l) 硝酸铵 1650 钼酸钠 0.25 硝酸钾 1900 硫酸铜 0.025 氯化钙 440 氯化钴 0.025 硫酸镁 370 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 170 琼脂 6000 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 香蕉泥 15000 硫酸镁 22.3 土豆泥 15000 硫酸锌 3.6 0028 无激素的1/2MS基本培养基+香蕉泥15g/l+土豆泥15g/l培养基的。
20、成分组成(定 容时采用普通自来水 ) ： 0029 说 明 书 CN 102613086 B 5 4/7 页 6 组成成分 数量 (mg/l) 组成成分 数量 (mg/l) 硝酸铵 825 钼酸钠 0.25 硝酸钾 950 硫酸铜 0.025 氯化钙 220 氯化钴 0.025 硫酸镁 185 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 85 琼脂 6000 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 香蕉泥 15000 硫酸镁 22.3 土豆泥 15000 硫酸锌 3.6 0030 实施例 2 0031 铁皮石斛无激素组织培养方法 ： 0032 a) 将从野外收集到的成熟铁皮石斛蒴果或铁皮石斛种子经。
21、过消毒处理， 播入无激 素的 MS 培养基中培养 30 天种胚膨大、 萌发形成绿色的圆球茎 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0033 b) 将圆球茎转入无激素的基本 MS 基本培养基 + 土豆泥 15g/l 培养基中， 培养 30 天， 圆球茎重叠堆积在无激素培养基中， 并有叶原基和分化苗出现 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0034 c)将圆球茎分化苗转入无激素的MS基本培养基+香蕉泥20g/l+土豆泥20g/l培 养基中， 诱导 20 30 天后有叶原。
22、基和高度达到 1 2cm 小苗出现， 继代培养后 30 天成为 中苗 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/d ； 0035 d) 将中苗转入 1/2MS 基本培养基 + 香蕉泥 20g/l+ 土豆泥 20g/l 的无激素培养基 中， 25 30 天培育出 5cm 高以上的大苗并练苗移栽， 练苗时要保证在 75 80的含水 量， 保持空气湿润 ； 培养条件 ： 培养温度 23 27， 光照度 1500 2000lx， 光照时间 12h/ d ； 0036 以上四种培养基 PH 均为 5.6， 均含 30g/l 蔗糖， 6g/l 琼脂。 0。
23、037 其中， 无激素的MS基本培养基+香蕉泥20g/l+土豆泥20g/l培养基成分组成(定 容时采用普通自来水 ) ： 0038 组成成分 数量 (mg/l) 组成成分 数量 (mg/l) 硝酸铵 1650 钼酸钠 0.25 说 明 书 CN 102613086 B 6 5/7 页 7 硝酸钾 1900 硫酸铜 0.025 氯化钙 440 氯化钴 0.025 硫酸镁 370 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 170 琼脂 6000 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 香蕉泥 20000 硫酸镁 22.3 土豆泥 20000 硫酸锌 3.6 0039 无激素的1/2MS基本培养基+香。
24、蕉泥20g/l+土豆泥20g/l培养基的成分组成(定 容时采用普通自来水 ) ： 0040 组成成分 数量 (mg/l) 组成成分 数量 (mg/l) 硝酸铵 825 钼酸钠 0.25 硝酸钾 950 硫酸铜 0.025 氯化钙 220 氯化钴 0.025 硫酸镁 185 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 85 琼脂 6000 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 香蕉泥 20000 硫酸镁 22.3 土豆泥 20000 硫酸锌 3.6 0041 实施例 3 0042 激素培养 ： 种子萌发为圆球茎所用培养基为 MS 基本培养基 + 蔗糖 30g/l+ 琼脂 6g/l+6-BA( 苄氨。
25、基嘌呤 )0.5mg/l+NAA(- 萘乙酸 )0.2mg/l， 从圆球茎到增殖分化所用培 养基为 MS 基本培养基 + 蔗糖 30g/l+ 琼脂 6g/l+6-BA( 苄氨基嘌呤 )0.5mg/l+NAA(- 萘 乙酸 )0.2mg/l， 从分化苗到茎段所用培养基为 MS 基本培养基 + 蔗糖 30g/l+ 琼脂 6g/ l+6-BA( 苄氨基嘌呤 )0.5mg/l+NAA(- 萘乙酸 )0.5mg/l)， 生根壮苗所用培养基为 1/2MS 基本培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-BA(苄氨基嘌呤)2mg/l+NAA(-萘乙酸)0.5mg/l， 说 明 书 CN 102613086 B。
26、 7 6/7 页 8 培养方法同实施例 1， 培养时间分别为 30 35 天， 30 35 天， 60 65 天， 35 40 天。 0043 实施例 4 0044 铁皮石斛培养物多糖成分、 生长发育状况比较 ： 0045 铁皮石斛多糖的提取方法 ： 取组织培养后的铁皮石斛培养物干燥样品， 精密称定 适量， 经石油醚(6090)回流脱脂1h， 过滤， 挥去溶剂， 以80乙醇回流提取1h， 乘热过 滤， 将滤渣加水回流提取 1h， 乘热过滤， 滤液浓缩， 加入 0.1活性炭脱色， 过滤， 加入 95 乙醇使溶液含醇80， 静置过夜， 过滤， 以无水乙醇、 丙酮依次洗涤8次， 所得多糖于60烘 干。
27、备用。精密吸取 0.5ml 按标准曲线项下操作， 求出各多糖液中葡萄糖浓度， 按下式计算多 糖含量 ： 0046 多糖含量 Cs.D.f/W1000 0047 式中 Cs 为供试品溶液葡萄糖浓度 (ug/ml)， D 为供试品溶液的稀释因素， f 为换算 因素， W 为供试品重量。 0048 石斛多糖成分、 生长发育状况比较结果见表 1 0049 表 1 实施例 1-3 培养物多糖含量和生长发育状况的比较表 0050 0051 实验结果表明 ： 采用无激素培养基组织培养铁皮石斛培养物多糖含量高于采用有 激素培养基组织培养铁皮石斛培养物的多糖含量， 铁皮石斛的生长状况正常。 0052 实施例 5。
28、 0053 比较实施例 1、 2 和 3 铁皮石斛培养物中总生物碱的含量。 0054 总生物碱的提取方法 ： 将组织培养后的铁皮石斛培养物用蒸馏水洗净， 置于烘箱 中 105， 杀青 30min， 60过夜， 烘干至恒重。用研钵研磨 ( 过 60 目筛 ) 备用。称取经干 燥粉碎的样品 0.400g 于 250ml 磨口三角烧瓶中， 用适量浓氨水润湿， 密塞 30min， 加氯仿 10.0ml， 称重， 置水浴中加热回流 2h， 冷却后补充氯仿至原重。过滤， 取续滤液 2.0ml， 加氯 仿， 摇匀， 即为待测液。吸取上述待测液于分液漏斗中， 用氯仿稀释至 10.0ml， 加入 pH4.6 的。
29、缓冲液 5.0ml， 再加 1.0ml0.04的嗅甲酚绿， 剧烈振摇， 静置。过滤， 取续滤液 6.0ml， 加 0.0lmolL-1， NaoH 溶液， 摇匀。另取 10.0ml 氯仿作同上平行操作， 作为空白对照。在 630nm 波长处测吸光度。实验重复测定 3 次。 0055 样品中的生物碱含量 ： 生物碱含量 ( ) CD/W10-6100 0056 式中C为根据标准曲线计算得到的样品生物碱浓度(ug/ml) ； D为样品溶液的稀释 倍数 ； w 为样品的重量 (g)。 0057 色谱峰相对积分面积和总生物碱含量比较结果见表 2 0058 表 2 实施例 1-3 培养物色谱峰相对积分面。
30、积和总生物碱含量比较表 0059 说 明 书 CN 102613086 B 8 7/7 页 9 0060 实验结果表明 ： 无激素培养比有激素培养中的生物碱类成分含量略高。 0061 实施例 6 0062 观察并记录无激素培养铁皮石斛和有激素培养铁皮石斛在四个不同阶段所需要 的时间。 0063 四个不同阶段生长时间比较结果见表 3 0064 表 3 实施例 1-3 培养物在四个不同阶段生长所需要的时间的比较表 0065 0066 实验结果表明 ： 在同一条件下铁皮石斛四个不同阶段在无激素培养基和有激素培 养基中培养所需的时间有差别， 这是因为香蕉泥和土豆泥能够提供铁皮石斛生长所需的营 养元素， 能够大大的节省生产成本， 真正的做到绿色生产。 说 明 书 CN 102613086 B 9 。