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1、(10)授权公告号 CN 102754655 B (45)授权公告日 2014.02.12 CN 102754655 B (21)申请号 201210250623.5 (22)申请日 2012.07.19 A01N 47/18(2006.01) A01N 43/90(2006.01) A01N 43/84(2006.01) A01N 33/18(2006.01) A01N 47/38(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (。
2、73)专利权人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路二号 中国农业大学 ( 西 ) 校区 (72)发明人 刘鹏飞 贾睿哲 李波涛 倪笑霞 卢晓红 CN 102742585 A,2012.10.24, 权利要求 1. KR 20070065957 A,2007.06.27, 说明书第 1 页 . CN 101731254 A,2010.06.16,说明书第1页 第 6 节 . 楼兵干 等 . 一种适合于从植物病组织中分 离腐霉菌的选择性培养基 .杭州电子工业学院 学报 .2000, 第 20 卷 ( 第 3 期 ), 第 72 页摘要 . 李园 等 . 几种土传病原真菌的分离。
3、培养技 术 .农药科学与管理 .2006, 第 25 卷 ( 第 11 期 ), 第 16-18 页 . (54) 发明名称 一种简便的腐霉菌快速分离培养基 (57) 摘要 本发明公开了一种简便、 快速的分离腐霉菌 的选择性培养基， 尤其适用于瓜果腐霉的分离。 属 于微生物技术领域。该培养基是向 PDA 培养基中 添加如下 1) 或 2) 所述杀菌剂得到的 ： 1)、 由多菌 灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平组成 ； 2)、 由咪 鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平组成 ； 实验证 明， 本发明的 PDA 选择性培养基具有可行性、 准确 性、 实用快捷和成本低廉、 制备简便的特点。用本 发。
4、明的 PDA 选择性培养基分离瓜果腐霉等腐霉属 卵菌， 可解决瓜果腐霉等植物病原腐霉分离过程 中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题， 且速 度快， 效率高， 省时、 省力。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王燕燕 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102754655 B CN 102754655 B 1/1 页 2 1. 一种用于分离瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum) 的杀菌剂， 其活性成分如下述 1) 或 2) 所示。
5、 ： 1)、 由多菌灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平组成 ； 所述多菌灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉和 利福平的质量份数比为 (10-50) (10-50) (5-10) (50-100) ； 2)、 由咪鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平组成 ； 所述咪鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉和 利福平的质量份数比为 (10-20) (10-50) (5-10) (50-100)。 2. 根据权利要求 1 所述的杀菌剂， 其特征在于 ： 所 述 1) 中， 所 述 多 菌 灵、 五 氯 硝 基 苯、 氟 吗 啉 和 利 福 平 的 质 量 份 数 比 为 10 10 5 50 或 20 20 7 70 。
6、或 50 50 10 100 ； 所 述 2) 中， 所 述 咪 鲜 胺、 五 氯 硝 基 苯、 氟 吗 啉 和 利 福 平 的 质 量 份 数 比 为 10 10 5 50 或 15 20 7 70 或 20 50 10 100。 3. 一种用于分离瓜果腐霉 (Pythium aphaniderma tum) 的培养基， 为如下 I 或 II 所 示 ： I、 是向 PDA 培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 1) 所示杀菌剂得到的 ； 所述多菌灵在 所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL ； 所述五氯硝基苯在所述 PDA 培养基中的 浓度为10g/mL-50g/m。
7、L ； 所述氟吗啉在所述PDA培养基中的浓度为5g/mL-10g/mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL ； II、 是向 PDA 培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 2) 所示杀菌剂得到的 ； 所述咪鲜胺 在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL-20g/mL ； 所述五氯硝基苯在所述 PDA 培养基中 的浓度为 10g/mL-50g/mL ； 所述氟吗啉在所述 PDA 培养基中的浓度为 5g/mL-10g/ mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL。 4. 根据权利要求 3 所述的培养基， 其。
8、特征在于 ： 上述培养基中， 所述 I 所示培养基中， 所述多菌灵在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述五氯硝基苯在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/ mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述氟吗啉在所述 PDA 培养基中的浓度为 5g/mL、 7g/mL 或 10g/mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ； 上述培养基中， 所述 II 所示培养基中， 所述咪鲜胺在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL、 15g/mL 或 20g/mL ； 所述五氯硝基苯在。
9、所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/ mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述氟吗啉在所述 PDA 培养基中的浓度为 5g/mL、 7g/mL 或 10g/mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL。 5.权利要求3或4所述培养基在分离瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)中的应用。 6. 一 种 分 离 瓜 果 腐 霉 (pythium aphanidermatum) 的 方 法， 包 括 如 下 步 骤 ： 用 权利要求 3 或 4 中所述培养基进行分离， 用于分离的样本为感染瓜果腐霉 (Pythiu。
10、m aphanidermatum) 的植物的根茎部组织或土壤。 权 利 要 求 书 CN 102754655 B 2 1/7 页 3 一种简便的腐霉菌快速分离培养基 技术领域 0001 本发明涉及一种简便、 快速分离腐霉菌的选择性培养基。属于微生物技术领域。 背景技术 0002 腐霉菌是世界性分布的土壤真菌， 腐生能力很强， 可以侵染 150 多种蔬菜瓜 果作物的根部和幼苗， 引起烂种、 猝倒、 立枯、 烂根和烂果。其中， 由瓜果腐霉 (Pythium aphanidermatum) 引起的猝倒病是瓜菜、 花卉、 药用植物、 烟草和豆类、 棉花、 玉米、 高粱等植 物幼苗期一种世界范围内的毁灭。
11、性病害。由通常在出苗后， 茎基部近地面处产生水渍状暗 色斑， 继而绕茎扩展， 逐渐缢缩呈细线状， 使幼苗地上部因失去支撑能力而折倒， 俗称卡脖 子病。湿度大时病部或土表会产生白色棉絮状物， 即病菌菌丝、 孢囊梗和孢子囊。在气候适 宜的条件下， 短期内就可爆发， 蔓延速度极快， 严重情况下可导致植物幼苗大面积死亡， 造 成缺苗甚至毁种， 给农业生产带来严重的经济损失。 0003 瓜果腐霉 (P.aphanidermatum) 属于卵菌门霜霉目腐霉科腐霉属。病菌以卵孢子 在 12-18cm 表土层越冬， 并在土中长期存活。猝倒病的初侵染源主要以瓜果腐霉的卵孢子 和厚垣孢子在土壤、 病残体中越冬， 。
12、其中土壤中的病残体带菌率最高。 在适宜条件下可萌发 产生孢子囊， 以游动孢子或直接长出芽管侵染幼苗引起猝倒。田间的再侵染主要靠病苗上 产出孢子囊及游动孢子， 借灌溉水或雨水溅附到贴近地面的根茎上引致更严重的损失。该 病主要在幼苗出土后、 长出 1-2 片叶之前发生。尤其是育苗期出现低温、 高湿条件， 利于发 病。 0004 为了对瓜果腐霉进行相关研究， 以及调查病原菌的田间发病情况， 筛选高效的药 剂， 最终达到有效防治该病害的目的， 分离获得纯化的瓜果腐霉是必要的前提条件。 0005 常规的病原菌分离方法是 植病研究方法 介绍的用 75乙醇和 0.1升汞液表 面消毒处理。 实际工作中， 从田。
13、间采集到的样本除被瓜果腐霉侵染外， 不可避免的常常带有 镰刀菌， 立枯丝核菌和疫霉等其他非目标真菌和细菌， 按常规方法进行分离组织病原菌时， 由于这些非目标真菌或细菌的污染， 造成目标菌分离率低或难于分离到目标菌。 因此， 利用 普通培养基从病组织上或土壤中分离瓜果腐霉时， 达不到分离纯化的目的。 发明内容 0006 本发明的一个目的是提供一种杀菌剂组合。 0007 本发明所提供的杀菌剂组合， 其活性成分如下述 1)、 2) 所示 ： 0008 1)、 由多菌灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉、 利福平组成 ； 0009 2)、 由咪鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉、 利福平组成 ； 0010 上述杀菌剂。
14、中， 0011 所述 1) 中， 所述多菌灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平的质量份数比为 (10-50) (10-50) (5-10) (50-100)， 具体为 10 10 5 50 或 20 20 7 70 或 50 50 10 100 ； 说 明 书 CN 102754655 B 3 2/7 页 4 0012 所述 2) 中， 所述咪鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利福平的质量份数比为 (10-20) (10-50) (5-10) (50-100)， 具体为 10 10 5 50 或 15 20 7 70 或 20 50 10 100 ； 0013 本发明的另一个目的是提供一种用于分离瓜。
15、果腐霉 (P.aphanidermatum) 的培养 基。 0014 本发明所提供的用于分离瓜果腐霉(P.aphanidermatum)的培养基， 为如下I或II 所示 ： 0015 I、 是向 PDA 培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 1) 所示杀菌剂得到的 ； 0016 II、 是向 PDA 培养基中添加权利要求 1 或 2 中所述 2) 所示杀菌剂得到的 ； 0017 上述培养基中， 所述 I 所示培养基中， 所述多菌灵在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL-50g/mL， 具体为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述五氯硝基苯在所述 PDA 培养基中。
16、的浓度为 10g/mL-50g/mL， 具体为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述氟 吗啉在所述 PDA 培养基中的浓度为 5g/mL-10g/mL， 具体为 5g/mL、 7g/mL 或 10g/ mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL， 具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ； 0018 上述培养基中， 所述 II 所示培养基中， 所述咪鲜胺在所述 PDA 培养基中的浓度为 10g/mL 20g/mL， 具体为 10g/mL、 15g/mL 或 20g/mL ； 所述五氯硝基苯在所述 PDA 培养基中的浓。
17、度为 10g/mL-50g/mL， 具体为 10g/mL、 20g/mL 或 50g/mL ； 所述氟 吗啉在所述 PDA 培养基中的浓度为 5g/mL-10g/mL， 具体为 5g/mL、 7g/mL 或 10g/ mL ； 所述利福平在所述 PDA 培养基中的浓度为 50g/mL-100g/mL， 具体为 50g/mL、 70g/mL 或 100g/mL ； 0019 上述培养基在分离瓜果腐霉 (P.aphanidermatum) 中的应用也属于本发明的保护 范围。 0020 本发明所提供的分离瓜果腐霉 (P.aphanidermatum) 的方法， 包括如下步骤 ： 用上 述任一所述培养。
18、基进行分离， 用于分离的样本为感染瓜果腐霉 (P.aphanidermatum) 的植 物的根茎或土壤。 0021 实验证明， 本发明的 PDA 选择性培养基具有可行性、 准确性、 实用快捷和成本低 廉、 制备简便的特点。用本发明的 PDA 选择性培养基分离瓜果腐霉， 可解决瓜果腐霉等植物 病原腐霉分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题， 且速度快， 效率高， 省时、 省 力。本发明为成功分离其他腐霉属菌株提供了参考， 为进行田间一次性分离以及室内纯化 瓜果腐霉提供技术支持。本发明选择培养基可用于简便、 快捷地从病株组织上或病田土壤 中一次性分离瓜果腐霉以及室内纯化瓜果腐霉。 附图说明 。
19、0022 图 1 为三种抗生素对植株根茎表面细菌的抑制作用。 0023 图 2 为三种抗生素对土壤中细菌的抑制作用。 0024 图 3 为瓜果腐霉病的发病情况和分离情况。A 为健康的黄瓜幼苗 ； B 为瓜果腐霉引 起的猝倒病的病苗 ； C 为田间瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗 ； D 为瓜果腐霉引起的草坪腐霉 枯萎病 ； E 为育苗阶段瓜果腐霉引起的猝倒病 ； F 为发病植株中分离到的瓜果腐霉。 说 明 书 CN 102754655 B 4 3/7 页 5 具体实施方式 0025 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0026 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明。
20、， 均可从商业途径得到。 0027 多菌灵原药购自安徽广信农化股份有限公司 ( 安徽广信农化集团有限公司 )， 其 主要活性成分物质的化学名称是 N-(2- 苯骈咪唑基 )- 氨基甲酸甲酯， 通用名称为多菌灵， 分子式 ： C9H9N3O2。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为 98.9。 0028 五氯硝基苯原药购自山西三立化工有限公司 ( 原山西省临汾有机化工厂 )， 其主 要活性成分物质的化学名称是五氯硝基苯， 通用名称为五氯硝基苯， 分子式 ： C6Cl5NO2。该 药中五氯硝基苯的质量百分含量为 95。 0029 咪鲜胺 ( 又叫 “咪酰胺” ) 原药购自海南力智生物工程有限公司，。
21、 其主要活性成分 物质的化学名称是 N- 丙基 -N-2-(2， 4， 6- 三氯苯氧基 ) 乙基 - 咪唑 -1- 甲酰胺， 分子式 ： C15H16Cl3N3O2。该药中咪鲜胺的质量百分含量为 97。 0030 氟吗啉原药购自沈阳化工研究院， 其主要活性成分物质的化学名称是 4-3-(3， 4- 二甲氧基 )-3-(4- 氟苯基 ) 丙烯酰 吗啉， 通用名称为氟吗啉， 分子式 ： C21H22FNO4。该 药中主要活性成分物质的质量百分含量为 96。 0031 青霉素、 利福平、 氯霉素均购自北京拓英坊科技有限公司。 0032 实施例 1、 三种真菌抑制剂、 一种疫霉抑制剂和三种抗生素对瓜。
22、果腐霉抑制作用 0033 一、 三种真菌抑制剂和一种疫霉抑制剂对瓜果腐霉的抑制作用 0034 以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂， 以丙酮或甲醇为咪鲜胺、 五氯硝基苯和氟吗啉 的溶剂， 分别配制 5000g/mL 的四种药剂母液 10ml ； 其中， 将多菌灵、 五氯硝基苯和咪鲜胺 这三种真菌抑制剂的母液分别配制系列浓度为50g/mL、 20g/mL和10g/mL的含药PDA 平板 ； 将氟吗啉这种疫霉抑制剂的母液分别配制系列浓度为 20g/mL、 10g/mL 和 5g/ mL 的含药 PDA 平板， 以加有溶剂的平板为对照 ； 然后采用菌丝生长速率法测定瓜果腐霉对 菌灵、 五氯硝基苯、 咪鲜胺和。
23、氟吗啉的敏感性。 将供试的瓜果腐霉菌株在PDA平板上于25 预培养 2d， 用直径为 5mm 的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼， 将菌饼接种到分别 含有四种药剂系列浓度的 PDA 含药平板中央 ( 各浓度含等量有机溶剂 )， 于 25下黑暗培 养， 2-3d 后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径 ( 菌落直径减去菌饼直径 5mm)， 每处 理重复 3 次 ； 最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率 ( )， 抑制率 ( ) ( 对照菌落增长直径 - 处理菌落增长直径 )/( 对照菌落增长直径 )100。 0035 测定了供试的四种真菌抑制剂对瓜果腐霉的抑制作用， 结果如表。
24、 1 所示， 不同浓 度的多菌灵、 五氯硝基苯对瓜果腐霉的抑制率均低于 10， 因此可以采用 10-50g/mL 的多菌灵、 五氯硝基苯作为选择性药剂 ； 50g/mL 咪鲜胺对瓜果腐霉的抑制率为 27， 10-20g/mL 浓度的咪鲜胺对瓜果腐霉抑制率较低， 所以可以采用 10-20g/mL 的咪鲜 胺为分离腐霉中使用的选择性药剂。浓度为 20g/mL 氟吗啉对瓜果腐霉的抑制率大于 11.2， 10g/mL 氟吗啉对瓜果腐霉抑制率为 4.5， 2g/mL 的浓度对辣椒疫霉没有抑制 作用， 因此， 可以采用 2-10g/mL 浓度的氟吗啉作为选择性药剂 ； 0036 表 1 四种真菌抑制剂对瓜。
25、果腐霉的抑制作用 0037 说 明 书 CN 102754655 B 5 4/7 页 6 0038 二、 三种抗生素对瓜果腐霉的抑制作用 0039 用灭菌水将上述三种抗生素均配制成 5104g/mL 的母液， 使用三种母液分别 配制成浓度为 100g/mL、 50g/mL 的利福平、 青霉素和氯霉素， 以加有无菌水的平板为对 照。然后采用菌丝生长速率法测定瓜果腐霉对这三种抗生素的敏感性。将供试的瓜果腐霉 菌株在 PDA 平板上于 25预培养 2d， 用直径为 5mm 的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取 菌饼， 将菌饼接种到分别含药剂系列浓度的PDA含药平板中央， 于25下黑暗培养， 2-3d后。
26、 用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)， 每处理重复3次 ； 最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率()， 抑制率()(对照 菌落增长直径 - 处理菌落增长直径 )/( 对照菌落增长直径 )100。 0040 同时测定了不同浓度的三种抗生素对瓜果腐霉的抑制作用， 结果见表 2， 浓度为 100和50g/mL的青霉素、 利福平和氯霉素对瓜果腐霉均没有明显的抑制作用。 因此， 可以 在分离瓜果腐霉时使用100g/mL或是50g/mL浓度的青霉素、 利福平和氯霉素作为分离 纯化瓜果腐霉选择性培养基中的抗生素成份。 并进一步测定三种抗生素对环境中带菌土壤 和。
27、辣椒组织上携带的细菌的抑制作用。 0041 表 2 三种抗生素对瓜果腐霉的抑制作用 0042 0043 实施例 2、 三种抗生素对环境中细菌的抑制作用 0044 供试植株 ： 将感病黄瓜品种长春密刺栽培于 15cm， 高 12cm 的育苗钵内， 置于中 国农业大学科学园辣椒试验田培养， 植株长到 2 叶期后随即采集根茎部， 用于菌悬液的制 备。 0045 供试土壤 ： 于 2011 年从北京大兴区猝倒病发病严重地区采集土样， 备用。 0046 试验方法 ： 此试验是在实施例 1 结果的基础上检测所选择的三种浓度抗生素是否 可有效抑制环境中的细菌。对于环境中细菌的检测， 主要针对来自植株茎基部以。
28、及发病土 壤中的细菌， 这是根据瓜果腐霉的分离部位主要是发病的茎基部以及带病土壤决定的， 本 实验采用的是黄瓜茎基部以及猝倒病发生比较严重的北京大兴区田间的土样。首先， 采 30 棵黄瓜幼苗的根茎部， 剪碎后采用四分法将样本随机分成 4 份， 取出其中 1 份放入 25ml 离 心管中， 加入 15ml 灭菌水， 200r/min 振荡 2 分钟， 过滤取滤液， 使用无菌水稀释 100， 分 别取 100l 涂布在分别含有 100g/mL、 50g/mL 的利福平、 青霉素和氯霉素， 以不含药 说 明 书 CN 102754655 B 6 5/7 页 7 平板为对照， 每处理 3 个重复， 2。
29、 天后观察其对细菌的抑制作用 ； 然后从猝倒病发病严重的 北京大兴田间取土样， 称取 5g， 放入烧杯中加入 20ml 灭菌水， 200r/min 振荡 20min， 取上清 100l 分别涂布在含有 100g/mL、 50g/mL 的利福平、 青霉素和氯霉素， 以不含药平板为 对照， 每处理 3 个重复， 2 天后观察其对细菌的作用。选择对细菌具有明显抑制作用的抗生 素浓度。 0047 本研究在表 2 结果的基础之上， 分别测定了初步选择可用的三种抗生素对幼苗茎 基部和土壤中细菌的抑制作用， 两个研究的结果一致。从图 1 和图 2 看出， 氯霉素抑菌活性 差， 在其浓度达到 100g/mL 。
30、时， 与对照相比， 抑菌效果不明显。青霉素、 利福平的抑菌活性 较强， 可以达到抑菌的作用。 由于环境中细菌种类的多样性， 青霉素主要对革兰氏阳性菌有 较强的抑制作用， 所以平板中有少许零星革兰氏阴性菌菌落。 而对于利福平， 平板中只有少 许真菌菌落。因此， 利福平对幼苗根茎部和土壤中的细菌具有广谱的抑菌作用。 0048 综上所述， 本发明筛选药剂的原则是对瓜果腐霉抑制率小于 10的前提下， 尽 可能选择高浓度的药剂， 以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以 看出， 应用于从田间一次性分离瓜果腐霉的选择性培养基， 可以选择的真菌抑制剂为多菌 灵、 咪鲜胺、 五氯硝基苯和氟吗啉，。
31、 浓度分别为 10-50g/mL、 10-20g/mL、 10-50g/mL 和 5-10g/mL ； 可以选择的抗生素类为利福平， 浓度采用 50-100g/mL。 0049 实施例 3、 用于分离瓜果腐霉的 PDA 选择性培养基 0050 一、 分离方法 0051 于 2011 和 2012 年间从北京大兴， 平谷、 昌平、 顺义区猝倒病发病严重地区采集病 样， 用于分离瓜果腐霉。 0052 瓜果腐霉的分离按下述方法进行 ： 在同一地区选择不同的田块， 采集猝倒病的病 样 ( 根茎和土壤 ) 进行分离。 0053 分离步骤 ： 将发病组织使用清水清理干净后充分晾干， 切取根茎部病健交界处的。
32、 小块组织接种在本发明的选择性培养基上， 25下黑暗培养， 至有菌丝长出 ； 挑取生长旺盛 的小块菌丝体至清水中， 在 20下培养 24-48h， 可观察到菌丝顶端生成大量的孢子囊， 且 孢子囊在水中 12-24h 即会萌发并产生泡囊， 15-30min 后游动孢子可从泡囊中释放出 ； 挑单 游动孢子置于普通 PDA 培养基上培养， 至长出菌落， 得到瓜果腐霉。对得到的瓜果腐霉进行 鉴定。将真正的瓜果腐霉菌落保存在 PDA 试管斜面上， 加适量的灭菌石蜡油置于室温下保 存备用。 0054 根据现有的瓜果腐霉菌鉴定方法进行鉴定。 0055 二、 分离中使用的培养基 0056 (一)1、 马铃薯葡。
33、萄糖琼脂培养基(PDA)的配制方法 ： 马铃薯200g， 葡萄糖20g， 琼 脂粉 14g， 加蒸馏水定容至 1000mL， 高压蒸汽灭菌， 121， 20min。 0057 2、 玉米粉 - 琼脂培养基 (CMA) 的配制方法 ： 玉米粉 300g， 双层纱布过滤， 琼脂粉 14g， 加蒸馏水定容至 1000mL， 高压蒸汽灭菌， 121， 20min。 0058 (二)从发病田土壤或病样根茎部分离瓜果腐霉使用不同的PDA选择培养基， 具体 如下 ： 0059 1、 病样分离部位为根茎 ： 0060 PDA选择培养基I ： 向未冷却的PDA培养基中添加多菌灵、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利 说 。
34、明 书 CN 102754655 B 7 6/7 页 8 福平， 并用未冷却的PDA培养基定容至1升 ； 多菌灵在PDA选择培养基I中的浓度为20g/ mL， 五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为20g/mL， 氟吗啉在PDA选择培养基I中的 浓度为 7g/mL， 利福平在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 70g/mL。 0061 PDA 选择培养基 II ： 与 PDA 选择培养基 I 基本相同， 不同之处在于 ： 多菌灵在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 10g/mL， 五氯硝基苯在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 10g/ mL， 氟吗啉在 PDA 选择培养基 I 中的浓。
35、度为 5g/mL， 利福平在 PDA 选择培养基 I 中的浓度 为 50g/mL。 0062 PDA 选择培养基 III ： 与 PDA 选择培养基 I 基本相同， 不同之处在于 ： 多菌灵在 PDA 选择培养基I中的浓度为50g/mL， 五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为50g/mL， 氟吗啉在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 10g/mL， 利福平在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 100g/mL， 0063 2、 病样分离部位为土壤 ： 0064 PDA选择培养基I ： 向未冷却的PDA培养基中添加咪鲜胺、 五氯硝基苯、 氟吗啉和利 福平， 并用未冷却的PDA培养基定容至1。
36、升 ； 咪鲜胺在PDA选择培养基I中的浓度为15g/ mL， 五氯硝基苯在PDA选择培养基I中的浓度为20g/mL， 氟吗啉在PDA选择培养基I中的 浓度为 7g/mL， 利福平在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 70g/mL。 0065 PDA 选择培养基 II ： 与 PDA 选择培养基 I 基本相同， 不同之处在于 ： 咪鲜胺在 PDA 选择培养基 II 中的浓度为 10g/mL， 五氯硝基苯在 PDA 选择培养基 II 中的浓度为 10g/ mL， 氟吗啉在PDA选择培养基I中的浓度为5g/mL， 利福平在PDA选择培养基II中的浓度 为 50g/mL。 0066 PDA 选择培养。
37、基 III ： 与 PDA 选择培养基 I 基本相同， 不同之处在于 ： 咪鲜胺在 PDA 选择培养基 III 中的浓度为 20g/mL， 五氯硝基苯在 PDA 选择培养基 III 中的浓度为 50g/mL， 氟吗啉在 PDA 选择培养基 I 中的浓度为 10g/mL， 利福平在 PDA 选择培养基 III 中的浓度为 100g/mL。 0067 真菌抑制剂溶液的配制 ： 以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂， 以丙酮或甲醇为咪鲜 胺、 氟吗啉和五氯硝基苯的溶剂， 以多菌灵原药、 咪鲜胺原药、 五氯硝基苯原药和氟吗啉原 药为溶质， 分别配制浓度为 5000g/mL 的母液 10ml， 四种原药的称量量。
38、依次为 51.4mg、 50.8mg、 51.2mg 和 50.5mg ； 0068 细菌抑制剂溶液的配制 ： 用灭菌水将各种抗生素均配制成浓度为5104g/mL的 溶液。 0069 四、 分离及鉴定结果 0070 在使用不同的本发明选择培养基进行分离的过程中， PDA 选择培养基中均没有杂 菌长出， 只有瓜果腐霉能够生长， 说明本发明的 PDA 选择培养基抑制了杂菌和疫霉生长， 使 瓜果腐霉的分离更容易。 本发明方法从开始将病变组织接种至选择性培养基上至有瓜果腐 霉菌丝长出， 一般只需要 2-3 天， 本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生 长， 使瓜果腐霉在培养基中成为优势菌群，。
39、 生长速度提高， 从而加快了分离进程。 0071 从上述北京大兴， 平谷、 昌平、 顺义区的猝倒病发病严重地区的黄瓜、 甜瓜和辣椒 等病组织中共分离得到 62 株瓜果腐霉菌株， 62 株瓜果腐霉菌均鉴定正确。 0072 在用于田间一次性分离瓜果腐霉时， 根据瓜果腐霉分离部位和采样地区施药历史 说 明 书 CN 102754655 B 8 7/7 页 9 的不同， 用于瓜果腐霉分离培养的杀菌剂组合物中以疫霉抑制剂氟吗啉和细菌抑制剂利福 平为主， 加入的其它真菌抑制剂可以有不同的组合。 针对不同的分离部位， 选择不同的真菌 抑制剂。其中， 多菌灵价格低， 使用范围广， 在分离根茎时应该加入。因此，。
40、 对于植物根茎部 组织中瓜果腐霉的分离， 真菌抑制剂组合可选 10-50g/mL 多菌灵， 有利于降低成本， 扩大 抑菌谱。 咪鲜胺对镰刀属真菌有特效， 对立枯丝核菌也有显著的抑制作用， 在从病土中分离 瓜果腐霉时， 可以用于腐生镰刀菌及丝核菌的真菌抑制剂。 因此， 对于土壤中瓜果腐霉的分 离， 真菌抑制剂组合可选择 10-20g/mL 咪鲜胺 ； 五氯硝基苯对子囊菌门的根霉特效， 主要 用于环境温度较高时空气中黑根霉的抑制， 因此如在温度较高的季节分离瓜果腐霉， 需在 上述杀菌剂组合物中添加浓度为 1050g/mL 五氯硝基苯后使用效果最佳。氟吗啉对植物 病原卵菌疫霉特效， 在从根茎部组织中或从土壤中分离瓜果腐霉时， 可以用于疫霉菌的抑 制剂。因此， 对于土壤中瓜果腐霉的分离， 疫霉抑制剂组合可选择 5-10g/mL 氟吗啉。将 上述该含有不同杀菌谱的真菌抑制剂和抗生素类杀细菌剂的杀菌剂组合物添加至 PDA 培 养基中， 制备成瓜果腐霉的选择性培养基。 说 明 书 CN 102754655 B 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102754655 B 10 2/3 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102754655 B 11 3/3 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102754655 B 12 。