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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610323912.1 (22)申请日 2016.05.16 (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人 玉柱 田吉鹏 李旭娇 娜日苏 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 黄家俊 (51)Int.Cl. A23K 30/18(2016.01) A23K 10/12(2016.01) A23K 10/18(2016.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/225(2。
2、006.01) (54)发明名称 一种布氏乳杆菌菌剂及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了属于青贮饲料质量安全技术 领域的一种布氏乳杆菌菌剂及其制备方法和应 用。 所述菌剂由布氏乳杆菌和脱脂乳粉组成， 菌 剂中布氏乳杆菌的含量为11010-51010CFU/ g。 通过将布氏乳杆菌菌体与含脱脂乳粉的溶液 混合后， 在真空冷冻条件下冻干成粉末， 制成所 述菌剂。 将所述菌剂应用在全株玉米青贮饲料的 制备中， 能够大幅提高全株玉米青贮饲料的有氧 稳定性， 抑制有氧变败过程中霉菌的增殖并降低 黄曲霉毒素B1含量， 提高了全株玉米青贮饲料的 性能。 所述布氏乳杆菌菌剂的制备方法简单、 易 行，。
3、 在青贮饲料质量安全技术领域具有广泛的应 用前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105941872 A 2016.09.21 CN 105941872 A 1.一种布氏乳杆菌菌剂， 其特征在于， 所述菌剂由布氏乳杆菌和脱脂乳粉组成。 2.根据权利要求1所述的一种布氏乳杆菌菌剂， 其特征在于， 所述菌剂中布氏乳杆菌的 含量为11010-51010CFU/g。 3.根据权利要求1所述的一种布氏乳杆菌菌剂， 其特征在于， 所述菌剂的贮存温度为4- 8。 4.权利要求1-3任一项所述布氏乳杆菌菌剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)菌体的扩大培养： 在MRS液体培养基中接。
4、种布氏乳杆菌， 37下培养36-48h， 获得的 菌液以2-4的比例接入到新的MRS液体培养基中， 扩大培养18-24h， 获得布氏乳杆菌培养 液； (2)菌体的收集： 将获得的布氏乳杆菌培养液在转速为6000-8000rpm的条件下离心10- 15min， 获得的布氏乳杆菌菌体用生理盐水洗涤3-5次， 最终获得清洗后的布氏乳杆菌菌体； (3)菌剂的制备： 向清洗后的布氏乳杆菌菌体中加入质量浓度为10的脱脂乳粉溶液， 混合均匀后， 采用真空冷冻干燥方式冻干成粉末， 获得布氏乳杆菌菌剂； 所述的MRS液体培养基的成分为： 10.0g L-1蛋白胨、 10.0g L-1牛肉膏、 5.0g L-1酵。
5、母膏、 2.0g L-1柠檬酸氢二铵、 20.0g L-1葡萄糖、 1.0g L-1吐温-80、 5.0g L-1乙酸钠、 2.0g L-1磷酸 氢二钾、 0.58g L-1硫酸镁和0.25g L-1硫酸锰。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)所述的真空冷冻干燥方式为： 在温度为-50-60， 真空度为10-12Pa的条件下， 冻干24-48h； 在真空冷冻干燥前， 先于- 70-80冻结4-6h。 6.权利要求1-3任一项所述的布氏乳杆菌菌剂在全株玉米青贮饲料制备中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述应用的操作为： 将处于蜡熟期的玉米 进行刈。
6、割并切短至2-3cm， 获得青贮原料； 然后将稀释后的布氏乳杆菌菌剂， 喷洒在青贮原 料上混合均匀； 最后将青贮原料压实密封进行发酵， 获得全株玉米青贮饲料。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述布氏乳杆菌菌剂的用量为： 每克青贮 原料中含有1105-5105CFU的布氏乳杆菌。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述青贮原料的压实密度为650-700kg/m3。 10.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述发酵的方式为： 在温度为20-30的 厌氧条件下， 发酵120-150d。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105941872 A 2 一种布氏。
7、乳杆菌菌剂及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于青贮饲料质量安全技术领域， 具体涉及一种布氏乳杆菌菌剂及其制备 方法和应用。 背景技术 0002 在大多数反刍动物的生产系统中， 家畜饲料需求的40-90来源于粗饲料， 而全株 玉米青贮饲料是家畜尤其是高产奶牛主要的粗饲料来源之一。 全株玉米青贮饲料含有很高 的可溶性糖和较低的缓冲能值， 自身很容易进行乳酸菌发酵。 但是在生产过程中， 很多因素 都会引发全株玉米青贮饲料与氧气的接触， 从而造成有氧变败： 如收割期的延迟， 多数的青 贮原料遇到早霜； 原料在切短过程中， 切的过长； 装填密度降低， 装填后没有用重物压紧； 每 日取出量少。
8、， 对暴露面不能及时覆盖或覆盖不严等。 另外， 国内外的研究表明， 全株玉米青 贮饲料中黄曲霉毒素B1(AFB1)的检出率很高。 AFB1能够降低动物的生产性能， 一些瘤胃微 生物对其很敏感， 如果持续饲喂AFB1浓度高的饲料会影响动物生长繁殖及肉、 奶和毛的生 产。 AFB1进入奶牛体内后， 其中有一部分能够转化为毒性较弱的AFM1进入牛奶中， 对人类健 康产生威胁。 0003 研究表明， 添加乳酸菌能够提高青贮牧草的有氧稳定性， 但同质型乳酸菌和异质 型乳酸菌的发酵产物及其对青贮效果的影响有所不同。 同质型乳酸菌发酵产生的主要是乳 酸， 而产生的能够抑制酵母菌、 霉菌等生长繁殖的短链挥发性。
9、脂肪酸非常少。 当青贮饲料与 氧气接触后， 乳酸便给乳酸同化型酵母菌提供了生长繁殖所需的底物， 使酵母菌迅速繁殖， 因此饲料青贮时添加同质型乳酸菌比未添加该类乳酸菌往往更容易发生有氧不稳定。 异质 型乳酸菌更能有效防止二次发酵。 尽管异质型乳酸菌比同质型乳酸菌在青贮过程中消耗更 多的养分， 但异质型乳酸菌在发酵过程中能将碳水化合物分解成乙酸和1,2-丙二醇。 相比 于乳酸， 乙酸等挥发性脂肪酸是一种有效抵抗真菌及霉菌发酵的酸类物质。 0004 布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)是异型发酵乳酸菌的主要代表， 能够在青 贮发酵过程中显著提高乙酸的含量。 近年来的试验已经表明。
10、， 异型发酵乳酸菌的应用可以 提高青贮饲料的有氧稳定性， 并且能够产生更多的乙酸抑制青贮饲料有氧变败过程中真菌 的繁殖。 同样的， 一些乳酸菌还能够对AFB1进行生物吸附， 降低AFB1中毒的风险。 0005 目前我国针对玉米青贮饲料中的乳酸菌添加剂相关专利仍然较少。 专利 CN200710180587.9给出了一种复合乳酸菌制剂， 主要成分包括布氏乳杆菌和植物乳杆菌。 这种复合乳酸菌制剂能够提高玉米青贮的保存性能并且增加产奶量和乳脂率， 但是是否对 青贮饲料中的黄曲霉毒素含量有影响则未知。 专利CN201210451128.0给出了一株植物乳杆 菌用于降低青贮饲料中的AFB1的含量， 但是植。
11、物乳杆菌本身为同型发酵乳酸菌， 其对于青 贮饲料中有氧稳定性具有反效果。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种布氏乳杆菌菌剂及其制备方法和应用， 采取的技术方 说 明 书 1/5 页 3 CN 105941872 A 3 案如下： 0007 一种布氏乳杆菌菌剂， 所述菌剂由布氏乳杆菌和脱脂乳粉组成。 0008 所述菌剂中布氏乳杆菌的含量为11010-51010CFU/g。 0009 所述菌剂的贮存温度为4-8。 0010 所述布氏乳杆菌菌剂的制备方法， 包括以下步骤： 0011 (1)菌体的扩大培养： 在MRS液体培养基中接种布氏乳杆菌， 37下培养36-48h， 获 得的菌液以2-4。
12、的比例接入到新的MRS液体培养基中， 扩大培养18-24h， 获得布氏乳杆菌 培养液； 0012 (2)菌体的收集： 将获得的布氏乳杆菌培养液在转速为6000-8000rpm的条件下离 心10-15min， 获得的布氏乳杆菌菌体用生理盐水洗涤3-5次， 最终获得清洗后的布氏乳杆菌 菌体； 0013 (3)菌剂的制备： 向清洗后的布氏乳杆菌菌体中加入质量浓度为10的脱脂奶粉 溶液， 混合均匀后， 采用真空冷冻干燥方式冻干成粉末， 获得布氏乳杆菌菌剂； 0014 所述的MRS液体培养基的成分为： 10.0g L-1蛋白胨、 10.0g L-1牛肉膏、 5.0g L-1酵 母膏、 2.0g L-1柠。
13、檬酸氢二铵、 20.0g L-1葡萄糖、 1.0g L-1吐温-80、 5.0g L-1乙酸钠、 2.0g L -1磷酸氢二钾、 0.58g L-1硫酸镁和0.25g L-1硫酸锰。 0015 步骤(3)所述的真空冷冻干燥方式为： 在温度为-50-60， 真空度为10-12Pa的 条件下， 冻干24-48h； 在真空冷冻干燥前， 于-70-80冻结4-6h。 0016 所述的布氏乳杆菌菌剂在全株玉米青贮饲料制备中的应用。 0017 所述应用的操作为： 将处于蜡熟期的玉米进行刈割并切短至2-3cm， 获得青贮原 料； 然后将稀释后的布氏乳杆菌菌剂， 喷洒在青贮原料上混合均匀； 最后将青贮原料压实。
14、密 封进行发酵， 获得全株玉米青贮饲料。 0018 所述布氏乳杆菌菌剂的用量为： 每克青贮原料中含有1105-5105CFU的布氏乳 杆菌。 0019 所述青贮原料的压实密度为650-700kg/m3。 0020 所述发酵的方式为： 在温度为20-30的厌氧条件下， 发酵120-150d。 0021 本发明的有益效果为： 本发明所述的布氏乳杆菌菌剂， 能够大幅提高全株玉米青 贮饲料的有氧稳定性， 抑制有氧变败过程中霉菌的增殖并降低黄曲霉毒素B1含量， 提高了 全株玉米青贮饲料的性能； 且所述布氏乳杆菌菌剂的制备方法简单、 易行， 在青贮饲料质量 安全技术领域具有广泛的应用前景。 附图说明 00。
15、22 图1为布氏乳杆菌菌剂对全株玉米青贮饲料有氧稳定性的影响图。 0023 图2为布氏乳杆菌菌剂对全株玉米青贮饲料有氧变败第0天和第7天时AFB1含量的 影响图。 具体实施方式 0024 下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述， 但本发明的保护范围不限于此。 所述方法如无特别说明均为常规方法， 所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而 说 明 书 2/5 页 4 CN 105941872 A 4 得， 实施例中所用的全株玉米的品种为京科516。 0025 实施例1： 布氏乳杆菌菌剂的制备 0026 (1)菌体的扩大培养： 在MRS液体培养基中接种布氏乳杆菌， 37下培养48h， 获得 的菌。
16、液以3的比例接入到新的MRS液体培养基中， 扩大培养24h， 获得布氏乳杆菌培养液； 0027 (2)菌体的收集： 将获得的布氏乳杆菌培养液在转速为8000rpm的条件下离心 15min， 获得的布氏乳杆菌菌体用生理盐水洗涤3次， 最终获得清洗后的布氏乳杆菌菌体； 0028 (3)菌剂的制备： 向清洗后的布氏乳杆菌菌体中加入10的脱脂奶粉， 混合均匀 后， 先于-80下冻结4h； 然后在温度为-50， 真空度为10Pa的条件下， 冻干36h， 获得布氏 乳杆菌菌剂。 0029 实施例2： 全株玉米青贮饲料的制备 0030 在京科516半数吐丝后的第7天， 在玉米穗的一侧接种2.1ml产毒黄曲霉。
17、， 所用产毒 黄曲霉的菌数为1107， 购自中国普通微生物菌种保藏中心。 0031 将处于蜡熟期含水量接近65的京科516刈割， 保证原料清洁、 无霉烂变质后， 再 切短至2-3cm， 获得青贮原料； 然后将稀释后的布氏乳杆菌菌剂， 喷洒在青贮原料上混合均 匀， 使每克青贮原料中含有1105CFU的布氏乳杆菌； 最后将青贮原料装填压实， 压实过程 中留意青贮窖(桶)的边角及四周， 确保充分压实， 且压实过程在刈割当日内完成； 压实后， 立即在窖上覆盖塑料膜， 用重物或泥土踩实封严， 于20-30厌氧发酵150天， 获得全株玉米 青贮饲料。 另外， 0032 以添加等量蒸馏水的青贮原料为对照。 。
18、0033 对获得的全株玉米青贮饲料中的营养成分和有氧稳定性进行检测， 测定时每个处 理重复三次； 营养成分检测结果如表1所示， 有氧稳定性的检测结果如图1所示。 0034 表1布氏乳杆菌菌剂对全株玉米青贮饲料营养成分的影响 0035 0036 从表1可知， 添加布氏乳杆菌菌剂的全株玉米青贮饲料相对于对照组， 消耗了少量 淀粉， 造成中性洗涤纤维增加。 全株玉米青贮饲料是奶牛等瘤胃动物的主要粗饲料之一， 中 性洗涤纤维含量的增加对维持瘤胃正常的发酵功能具有重要意义。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105941872 A 5 0037 从图1可知， 添加布氏乳杆菌菌剂的全株玉米青贮饲料相对于对。
19、照组而言， 其有氧 稳定性提高了1倍以上， 提高了饲料的质量品质。 0038 分别测定有氧变败第0天和有氧变败第7天时全株玉米青贮饲料的品质， 测定时每 个处理重复三次。 其中， 有机酸、 霉菌、 酵母菌的含量与pH值如表1所示； AFB1的含量如图2所 示。 0039 表2布氏乳杆菌菌剂对全株玉米青贮饲料品质的影响 0040 0041 0042 从表2可知， 添加布氏乳杆菌菌剂的全株玉米青贮饲料在开窖接触氧气后的第7 天， 其pH仍然处于较低水平， 且相对对照组残留了更多的乳酸和乙酸， 提高了饲料的品质。 0043 饲料中霉菌数量达到104CFU/g时， 会对家畜产生危害。 添加布氏乳杆菌菌。
20、剂的全 说 明 书 4/5 页 6 CN 105941872 A 6 株玉米青贮饲料刚开窖时， 未检测出霉菌， 对照组已接近104CFU/g； 当有氧变败第7天后， 对 照组和布氏乳杆菌处理组霉菌数量均已超过104CFU/g， 不适宜饲喂。 0044 从图2可知， 有氧变败第7天时的全株玉米青贮饲料相对于刚开窖时， 具有更高的 AFB1含量。 但是添加布氏乳杆菌菌剂的处理组， 不仅在刚开窖时的AFB1含量远低于对照组， 且在有氧变败7天时， 其AFB1含量的增长也远低于对照组。 0045 综上所述， 添加布氏乳杆菌菌剂不仅能够提高全株玉米青贮饲料的有氧稳定性， 而且能够降低其中的AFB1含量。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105941872 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105941872 A 8 。