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1、(10)申请公布号 CN 102696481 A (43)申请公布日 2012.10.03 CN 102696481 A *CN102696481A* (21)申请号 201210149156.7 (22)申请日 2012.05.15 A01H 4/00(2006.01) A61K 31/58(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 8/63(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 3。
2、7/08(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 9/08(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A23L 1/275(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 周铜水 杨翼信 (74)专利代理机构 上海正旦专利代理有限公司 31200 代理人 陆飞 盛志范 (54) 发明名称 一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产 量的方法 (57) 摘要 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体为 一种提高丹参毛。
3、状根中丹参酮类活性成分产量的 方法。本发明采用脱落酸处理悬浮培养的丹参 毛状根提高丹参酮类成分产量， 具体步骤为 ： 将 在 6,7-V 固体培养基上培养获得的丹参毛状根种 株接种到 GamborgB5 液体培养基中， 黑暗培养箱 中用振荡培养若干天， 然后转移到含有脱落酸的 GamborgB5 液体培养基中培养 1-9 天。本发明处 理后得到的丹参毛状根中包括丹参酮 IIA、 二氢 丹参酮 I、 丹参酮 I、 隐丹参酮等丹参酮类化合物 的含量提高了 2 6 倍。本发明为利用丹参毛状 根快速高效生产丹参酮类活性成分提供了有效途 径。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 。
4、附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法， 其特征在于采用脱落酸处 理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量， 具体步骤为 ： 将在 6,7-V 固体培养基上 培养 3-4 周获得的丹参毛状根种株接种到 Gamborg B5 液体培养基中， 20-30黑暗培养箱 中用 100-300 rpm 水平振荡培养 15-30 天， 然后转移到含有脱落酸的稀释一倍的 Gamborg B5 液体培养基中培养 1-9 天 ； 所述脱落酸的浓度为 1-100。
5、 mol/L。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所用丹参毛状根是利用发根农杆菌 C58C1 诱导丹参无菌苗外植体产生丹参毛状根株系Sm031103。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述脱落酸的处理浓度为 1-25mol/L。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述丹参酮类成分包括丹参酮 IIA、 二氢 丹参酮 I、 丹参酮 I 和隐丹参酮。 5. 由权利要求 1 所述方法得到的丹参酮类成分。 6. 由权利要求 5 所述的丹参酮类成分在制备丹参酮类提取物、 单体化合物及各种丹 参制剂中的应用。 7. 由权利要求 5 所述的丹参酮类成分作为天然色素在。
6、食品、 药品及化妆品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102696481 A 2 1/5 页 3 一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体涉及一种提高丹参毛状根中丹参酮类活 性成分产量的方法。 背景技术 0002 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国一种传统中草药， 因根赤色得名， 始载 于 神农本草经 ， 列为上品， 能活血化瘀、 通经止痛、 清心除烦、 凉血消痈， 现代临床上常用 于心血管疾病的治疗， 具有极高的药用价值。丹参的主要药用活性成分为水溶性的酚酸类 化合物和脂溶性的丹参酮类化合物，。
7、 其中丹酚酸 B ( 3.0%) 和丹参酮 IIA ( 0.2%) 是 中国药典 规定的指标成分。丹参的这二类化合物都具有抗氧化、 抗凝血、 抗血栓、 抗肿瘤、 抗HIV、 抗过敏、 抗炎、 以及扩张冠状动脉等生物活性活性。 现代医学研究表明不同结构丹参 酮类成分生物活性存在差异 ： 丹参酮I能提高学习和记忆能力， 丹参酮IIA则具有抗增生的 活性， 并能缓解骨吸收疾病的症状 ； 二氢丹参酮 I 和隐丹参酮这两种具有二氢呋喃环的丹 参酮具有抗菌、 抗过敏效果。 此外， 作为二萜醌类色素的丹参酮类成分在植物天然色素开发 领域受到了额外的关注。 0003 应对目前丹参野生资源日益匮乏， 栽培品种的。
8、药材质量差别大、 品质严重退化、 生 长周期长等种种困境， 生物工程技术或植物组织培养技术为丹参次生代谢物的获取提供了 一种优良的替代生产体系， 其中利用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 感染丹参 获得转化毛状根的技术使工业化生产丹参药用有效活性成分成为可能。 毛状根培养系统具 有激素自主、 遗传稳定、 生长快速等优势， 较之植物细胞更适合工业规模的生产。通常毛状 根能够稳定合成母体植物中绝大多数次生代谢物， 甚至还有可能形成一些新的化合物。但 转化过程中 Ri 基因插入宿主基因组中位置的随机性和拷贝数的不确定性导致不同毛状根 株系间的产物性质及生长速度等生理特。
9、征存在差异。在研究初期， 丹参毛状根的丹参酮类 含量仅为干重的0.036%-0.068%， 远小于生药中0.15%丹参酮的含量。 采用生物或非生物诱 导子诱导提高丹参毛状根活性成分的产量是行之有效的方法， 迄今为此， 已报道利用酵母 提取物、 茉莉酸甲脂、 山梨酸、 银离子 (Ag+) 等作为诱导子诱导提高丹参毛状根中丹参酮类 成分产量的方法， 但未见采用脱落酸(abscisic acid, ABA)为诱导子诱导提高丹参酮类成 分产量的研究。 0004 本发明将脱落酸 (abscisic acid, ABA) 加入到丹参毛状根悬浮培养体系中诱导 提高丹参酮类成分， 并对其最适浓度与最佳处理时间。
10、获进行了优化， 为提高丹参毛状根丹 参酮产量提供了新的途径。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种工艺简单、 成本低廉的显著提高丹参毛状根中丹参酮 类成分产量的方法。 0006 本发明的另一个目的在于提供由本发明利用丹参毛状根生产的丹参酮类活性成 说 明 书 CN 102696481 A 3 2/5 页 4 分， 并提供这些成分在制备丹参总酮提取物、 丹参酮 IIa 和隐丹参酮单体成份， 以及在丹参 酮类药物制剂方面的应用。 0007 本发明的再一个目的在于提供利用丹参毛状根生产的丹参酮类作为天然色素， 在 食品、 药品以及化妆品领域的应用。 0008 本发明提供的提高丹参毛状根中丹参。
11、酮类成分产量的方法， 是采用脱落酸处理悬 浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量， 具体步骤为 ： 将在 6,7-V 固体培养基上培养 3-4 周获得的丹参毛状根种株接种到 Gamborg B5 液体培养基中， 20-30黑暗培养箱中用 100-300 rpm 水平振荡培养 15-30 天， 然后转移到含有脱落酸的 Gamborg B5 液体培养基中 培养 1-9 天 ； 所述脱落酸的浓度为 1-100 mol/L。 0009 本发明中， 所用丹参毛状根是利用发根农杆菌 C58C1 诱导丹参无菌苗外植体产生 丹参毛状根株系Sm031103。 0010 本发明中， 所述脱落酸的处理浓度优选为 1。
12、-25mol/L。 0011 本发明中， 所述丹参酮类成分包括丹参酮 IIA、 二氢丹参酮 I、 丹参酮 I 和隐丹参 酮。 0012 本发明采用脱落酸处理丹参毛状根， 显著诱导和提高了丹参酮类成分的含量。实 验证明， 采用浓度为 1-100 mol/L 的脱落酸处理丹参毛状根 1-9 天丹参毛状根中总丹参 酮类成分的含量可提高 2-6 倍。经本方法优化后的最佳脱落酸效应浓度为 1-25mol/L （约 0.26-7.5 mg/L） 。本发明成本低廉， 操作简便， 为利用丹参毛状根培养体系生产丹参药 用活性成分提供了一个稳定、 高效的途径。 0013 本发明的具体操作步骤如下 ： （1） 丹参。
13、毛状根的诱导 ： 应用发根农杆菌 C58C1 侵染丹参无菌外植体形成毛状根。待 毛状根长到 2 厘米左右切下， 除菌后在 6,7-V 固体培养基上培养， 经筛选获得丹参毛状根 Sm031103。 0014 （2） 丹参毛状根的固体培养 ： 将毛状根Sm031103 在 6,7-V 固体培养基上， 22黑 暗静置培养， 3-4 周后继代一次。 0015 （3） 丹参毛状根的液体悬浮培养 ： 毛状根Sm031103 在 6,7-V 固体培养基上培养 了 3-4 周后， 挑取鲜嫩粗壮的毛状根转入稀释一倍的 Gamborg B5 液体培养基， 22， 黑暗， 120rpm 水平振荡培养 3 周。 00。
14、16 （4） 脱落酸诱导处理 ： 将液体悬浮培养 3 周后的丹参毛状根转入含有一定浓度脱 落酸的新鲜稀释一倍的 Gamborg B5 液体培养基， 诱导提高毛状根中丹参酮类成分的含量。 其中， 脱落酸的处理浓度为1-100mol/L， 优选为1-25mol/L。 脱落酸处理时间为1-9天， 优选为 7-9 天。 0017 本发明所述丹参毛状根， 是由唇形科鼠尾草属植物丹参 (Salvia miltiorrhiza Bge.) 无菌幼根或幼苗， 经发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes, C58C1 株系 ) 诱导形 成的毛状根。 0018 本发明中， 所述 6,7-V 。
15、固体培养基组成为 (mg/L) ： (1) 大量元素 (NH4)2SO4 100; KNO3 800; Na2HPO412H2O 20; MgSO47H2O 250; CaCl22H2O 200; NaH2PO4 150; KCl 200) ； (2) 微量元素 (NaMoO42H2O 0.25; CoCl26H2O 0.25; KI 0.05; MnSO44H2O 4.0; ZnSO47H2O 1.5; H3BO3 5.0) ； (3) Fe 盐 (EDTA)2FeNa3H2O 21.1) ； (4) 有机成分 (VB1 说 明 书 CN 102696481 A 4 3/5 页 5 0.5;。
16、 VB6 0.5; 烟酸 1.5; 肌醇 100)。所述 Gamborg B5 液体培养基组成为 (mg/L) ： (1) 大量元素 (NH4)2SO4 134; KNO3 2500; NaH2PO4H2O 150; MgSO47H2O 250; CaCl22H2O 150) ； (2) 微量元素 (NaMoO42H2O 0.25; CoCl26H2O 0.025; KI 0.75; MnSO44H2O 10; ZnSO4 7H2O 2.0; H3BO3 3.0) ； (3) Fe盐(CuSO4 5H2O 0.025; Na2 EDTA 37.3; FeSO4 7H2O 27.8) ； (4)。
17、 有机成分 (VB110; VB6 1.0; 烟酸 1.0; 肌醇 100)。 0019 上述培养基用浓度为 1 mol/L 的 NaOH 和 HCl 调节 pH 值至 5.6-5.8 后， 加入 3% 蔗 糖 （固体培养基中还需加入 7.5 g/L 琼脂粉） ， 121高压灭菌备用。 0020 本发明还提供一种从丹参毛状根中提取丹参总酮提取物的方法， 其步骤为 ： 将上 述利用脱落酸诱导培养获得的丹参毛状根， 滤干培养液后， 粉碎， 用 5-10 倍样品量 ( 重量 比 ) 的丙酮回流提取二次， 每次各 1.0 小时， 合并提取液， 回收丙酮， 浓缩液加 5 倍量去离 子水稀释， 抽滤澄清，。
18、 滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附， 先用体积浓度为的 20-50%( 与水体 积比)乙醇或甲醇洗脱， 收集 20-50%乙醇或甲醇洗脱液弃去， 柱床再用体积浓度为40-95% ( 与水体积比 ) 乙醇或甲醇洗脱， 收集 40-95% 乙醇或甲醇洗脱部分， 浓缩、 冻干， 即得丹参 总酮提取物 （即包括丹参酮类成分） 。提取物中二氢丹参酮 I、 隐丹参酮、 丹参酮 I 和丹参酮 IIA 四种丹参酮的含量总和不低于 75%。 0021 上述获得的丹参总酮提取物， 可直接用于制备丹参酮类药物制剂 ； 或可直接作为 紫红色丹参色素应用于食品、 药品或化妆品的着色剂 ； 或可进一步用于生产丹参酮 I。
19、IA， 隐 丹参酮等单体化合物， 用作药物制剂原料或中间体。 附图说明 0022 图 1. 为 ABA 诱导丹参毛状根酮类成分含量测定 HPLC 色谱图。 0023 图 2. 为不同浓度脱落酸处理丹参毛状根后丹参酮类成分含量柱状图。 0024 图 3. 为相同浓度 (5 mol/L) 的脱落酸处理不同时间后丹参毛状根中丹参酮类 成分含量图。 具体实施方式 0025 以下以具体实施实例进一步说明本发明内容 ： 实施例 1. 以脱落酸诱导丹参毛状根高效生产丹参酮类成分的方法 实验材料 ： YEB 培养基组成为 (g/L) ： ( 胰蛋白胨 5.0 ； 酵母提取物 1.0 ； 牛肉膏 5.0 ； M。
20、gSO4 7H2O 0.493)。 0026 6,7-V 固体培养基组成为 (mg/L) ： (1) 大量元素 (NH4)2SO4 100; KNO3 800; Na2HPO412H2O 20; MgSO47H2O 250; CaCl22H2O 200; NaH2PO4 150; KCl 200) ； (2) 微 量元素 (NaMoO42H2O 0.25; CoCl26H2O 0.25; KI 0.05; MnSO44H2O 4.0; ZnSO47H2O 1.5; H3BO3 5.0) ； (3) Fe 盐 (EDTA)2FeNa 3H2O 21.1) ； (4) 有机成分 (VB1 0.5;。
21、 VB6 0.5; 烟酸 1.5; 肌醇 100)。 0027 MS 固 体 培 养 基 组 成 为 (mg/L) ： (1) 大 量 元 素 (NH4NO3 1,650; KNO3 1,900; MgSO47H2O 370; CaCl22H2O 440; KH2PO4 170) ； (2) 微量元素 (Na2MoO42H2O 0.25; CoCl2 6H2O 0.025; KI 0.83; MnSO4 4H2O 22.3; ZnSO4 7H2O 8.6; H3BO3 6.2; CuSO4 5H2O 说 明 书 CN 102696481 A 5 4/5 页 6 0.025) ； (3) Fe盐。
22、(Na2EDTA 2 H2O 37.3; FeSO4 7H2O 27.8) ； (4) 有机成分(VB1 0.5; VB6 0.4; 烟酸 0.5; 肌醇 100; 甘氨酸 2.0)。 0028 Gamborg B5液体培养基组成为(mg/L) ： (1) 大量元素(NH4)2SO4 134; KNO3 2500; NaH2PO4 H2O 150; MgSO4 7H2O 250; CaCl2 2H2O 150) ； (2) 微量元素(NaMoO4 2H2O 0.25; CoCl26H2O 0.025; KI 0.75; MnSO44H2O 10; ZnSO47H2O 2.0; H3BO3 3.。
23、0) ； (3) Fe 盐 (CuSO4 5H2O 0.025; Na2 EDTA 37.3; FeSO4 7H2O 27.8) ； (4) 有机成分(VB110; VB6 1.0; 烟酸 1.0; 肌醇 100)。 0029 上述培养基用浓度为 1 mol/L 的 NaOH 和 HCl 调节 pH 值至 5.6-5.8 后， 加入 3% 蔗 糖 （固体培养基中还需加入 7.5 g/L 琼脂粉） ， 121高压灭菌备用。 0030 方法和步骤 ： (1). 丹参无菌苗的培养 ： 取丹参种子， 过 40 目筛后， 挑选饱满结实的种子用于发芽实 验。 在超净工作台上用75%乙醇表面灭菌80s， 用。
24、无菌水漂洗3-5次。 其后含有0.1%Triton X-100(w/v) 的 4%NaClO(v/v) 溶液 80rpm 水平振荡 8min 后立即用无菌水漂洗 3-5 次， 至无泡沫残留。将上述表面消毒后的种子用无菌长柄镊接种于稀释一倍的 MS(Duchefa Biochemie, cat.no. M0222)固体培养基 （1%蔗糖， 3%琼脂） ， 然后移入22光照培养箱中 萌发， 每天 16h 光照。 0031 2). 丹参毛状根的诱导、 保种和继代 ： 在超净工作台上， 用无菌手术刀将丹参无菌 苗分解为 1cm2大小的叶片和 1cm 左右茎段、 根部， 将这些外植体浸入发根农杆菌 YE。
25、B 液体 培养液 （含 100 mg/L 利福平） ， 共培养 5 分钟后将外植体上多余的菌液用无菌吸水纸吸干， 转移到稀释一倍的 MS 培养基， 在生长箱中培养 1-3 天后转至含有 100 mg/L 利福平及 500 mg/L 头孢噻肟钠的稀释一倍的 MS MS 固体培养基 （1% 蔗糖， 3% 琼脂） 继续培养 1-2 周后在 茎段、 根段及叶盘切口周围长出转化毛状根。毛状根生长到 2cm 左右切下转入不含抗生素 的稀释一倍的MS培养基， 在39-40下培养48h， 移到22左右常温培养。 毛状根转入新鲜 的 6,7-V 固体培养基上， 22静置暗培养， 每 3-4 周继代一次， 备用。。
26、 0032 (3). 丹参毛状根的液体培养与脱落酸诱导 ： 选取固体培养 3-4 周粗壮幼嫩的毛状 根1.0 g接种到含有40ml 稀释一倍的Gamborg s B5液体培养基的150 ml锥形瓶中， 22， 黑暗， 120rpm 水平振荡培养 20 天后接受脱落酸诱导处理。其方法是 ： 将生长了 20 天的丹 参毛状根转移入含有不同浓度 （1 -100mol/L） 脱落酸的新鲜稀释一倍的 Gamborg B5 液 体培养基， 120rpm， 22黑暗振荡培养 9 天。以在不含脱落酸的稀释一倍的 Gamborg B5 液 体培养基培养9天的毛状根为对照。 另外采用最大响应浓度 (5 mol/L。
27、)的脱落酸处理生 长了 20 天的丹参毛状根， 在转速为 120rpm 的摇床上黑暗条件下培养 1-9 天， 分别以不含脱 落酸的稀释一倍的 Gamborg B5 液体培养基培养相同天数的毛状根为对照 (Ctrl)。 0033 (4). 实验结果 ： 丹参毛状根中丹参酮类成分的含量采用高效液相色谱法进行测 定。色谱条件 ： Agilent 1100 高效液相色谱仪 ； DAD 检测器 ； Kinetex 2.6 C18 100 100 mm 4.60 mm 色谱柱 ； 检测波长 ： 280 nm ； 流动相 ： A-1三氟乙酸水， B- 乙腈 ； 柱温 ： 30 ； 流速 ： 1ml/min。。
28、采用梯度洗脱 ： A: 93% (0 min) 至 19% (36 min) ； B ： 7% (0 min) 至 81% (36 min)。 样品处理 ： 将丹参毛状根从培养液中取出， 用蒸馏水冲洗2-3次， 去除残 余的培养基， 于滤纸上吸干附着水分后冷冻干燥。在研钵中将干燥后的毛状根研磨成均匀 细分。精密称取 0.1 g 丹参毛状根干粉于 4 ml EP 管中， 加入 2.5 ml 70% 甲醇， 超声提取 说 明 书 CN 102696481 A 6 5/5 页 7 20分钟， 5000rpm离心10分钟， 取上清液， 加入5 ml容量瓶中。 重复提取1次， 合并上清液， 定容至 5 。
29、ml， 0.22 m 微孔滤膜过滤后备用。分析结果 ： 如图 1 、 图 2 和图 3 所示。 0034 实施例 2. 利用脱落酸诱导后生产的丹参毛状根制备丹参总酮提取物的方法 将上述利用脱落酸诱导培养获得的丹参毛状根， 滤干培养液后， 称取新鲜毛状根 500 克， 碾碎， 用 5-10 倍样品量 ( 重量比 ) 的丙酮回流提取二次， 每次各 1.0 小时， 合并提取液， 回收丙酮， 浓缩液加5倍量去离子水稀释， 抽滤澄清， 滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附， 先用 体积浓度为的 20-50%( 与水体积比 ) 乙醇或甲醇洗脱， 收集 20-50% 乙醇或甲醇洗脱液弃 去， 柱床再用体积浓度。
30、为 40-95% ( 与水体积比 ) 乙醇或甲醇洗脱， 收集 40-95% 乙醇或甲 醇洗脱部分， 浓缩、 冻干， 即得丹参总酮提取物 26.5 克， 得率 5.3%( 提取物干重 / 毛状根鲜 重 )。 0035 采用上述 HPLC 含量测定方法， 测得提取物中二氢丹参酮 (1) 17.7%、 隐丹参酮 (2)52.1%、 丹参酮 (3)4.9% 和丹参酮 IIA(4) 5.25%， 四种丹参酮的含量总约为丹参酮总 提取物的 80.0%。 说 明 书 CN 102696481 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102696481 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102696481 A 9 。