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本申请要求2003年8月25日提交的美国临时专利申请60/497,627的优先权，该申请被全文纳入作为参考。
发明领域
本发明涉及含有莫纳甜(monatin)的新型饮料组合物以及制造这种组合物的方法。本发明还涉及含有莫纳甜的特定立体异构体、莫纳甜立体异构体的特定混合物和/或含有通过生物合成途径在体内(例如细胞内)或体外生产的莫纳甜的饮料组合物。
发明背景
由于对儿童肥胖、II型糖尿病和相关疾病产生的健康顾虑，无热量高强度甜味剂的使用正在增加。因此，需要有甜度明显高于砂糖(蔗糖)等常规甜味剂的甜味剂。许多高强度甜味剂有令人不愉快的异味和/或意外的低于期望值的甜度表现。为克服这些问题，工业上在继续研究苦味抑制剂、掩味技术和甜味剂混合物，以期获得类似于蔗糖的甜度表现。
莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)是一种天然存在的高强度甜味剂，它分离自在南非德兰士瓦地区发现的一种植物Sclerochiton ilicifolius。在相等甜度下，与蔗糖或其它营养甜味剂不同，莫纳甜不含碳水化合物或蔗糖且几乎不含卡路里。
概述
本发明涉及一种饮料组合物，该组合物含有莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸一也称为4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者采用另一种编号系统，叫做4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，该化合物具有下式：
莫纳甜是一种天然存在的高强度甜味剂。莫纳甜有四种立体异构形式：2R，4R(“R，R立体异构体”或“R，R莫纳甜”)；2S，4S(“S，S立体异构体”或“S，S莫纳甜”)；2R，4S(“R，S立体异构体”或“R，S莫纳甜”)以及2S，4R(“S，R立体异构体”或“S，R莫纳甜”)。本文中，除非另有说明，“莫纳甜”是指莫纳甜的所有四种立体异构体，以及莫纳甜立体异构体任意组合的任何混合物(例如莫纳甜的R，R和S，S立体异构体的混合物)。
莫纳甜具有极好的甜度特性。莫纳甜的甜度曲线与已知高强度甜味剂一样清楚或更加清楚。莫纳甜的剂量反应曲线更加呈线性，因此相比糖精等其它高强度甜味剂更类似于蔗糖。莫纳甜出色的甜度特性使莫纳甜可理想地用于桌面甜味剂、食品、饮料和其它产品。
莫纳甜的不同立体异构体，其中包括R，R和S，S立体异构体，有可能用于甜味剂工业，无论是作为单独的成分或在混合物中。莫纳甜单独或与碳水化合物混合时具有优良的味道特性。相比其它高强度甜味剂，莫纳甜以及莫纳甜的立体异构体与其它甜味剂如碳水化合物的混合物被认为具有优良的味道特性和/或物理性质。例如，莫纳甜比阿斯巴特(也称为“APM”)稳定，相比糖精有更加清楚的味道，并且一种立体异构体(R，R莫纳甜)比三氯蔗糖更甜。同时，莫纳甜甜味剂不会有糖精那样苦的后味，或者像其它高强度甜味剂那样有金属味道、酸味、涩味或使用之后感觉喉咙发干。此外，莫纳甜甜味剂不具有某些天然甜味剂(如甜菊糖和甘草甜素)那种甘草后味。
此外，不同于阿斯巴特甜味剂，莫纳甜甜味剂不需要告诫苯并酮尿症患者注意苯丙氨酸。同时，预计莫纳甜不会致龋齿(即不引起蛀牙)，因为它不含可发酵的碳水化合物。也预计莫纳甜与唾液混合时不会使pH降低到～5.7(可伤害牙齿的pH)，如pH降低测试中所测定。由于其强烈甜味，R，R立体异构体相比其它高强度甜味剂更具有商业竞争力。
在一个方面，本发明提供含有莫纳甜或其盐，如R，R、S，S、R，S或S，R莫纳甜或不同立体异构体的混合物的饮料组合物。本文所用的“饮料组合物”指直接可饮用组合物(即不需稀释或“即饮型”)或可被稀释或与液体混合形成可饮用饮料的浓缩液。例如，饮料组合物可以是，可与例如水或牛奶混合形成可饮用饮料的无水饮料混合物(如巧克力饮料混合物、水果饮料混合物、加麦芽饮料或柠檬水饮料)。作为另一例子，饮料组合物可以是可用，例如碳酸水稀释形成碳酸软饮料的饮料糖浆。作为另一例子，可用水/冰和一种或多种其它成分(如龙舌兰酒)稀释饮料糖浆或混合物，形成酒精饮料(如玛格丽塔酒)。可用本文所述的莫纳甜替代其它常见的大散装(bulk)甜味剂，而在味道上没有明显不同。含有莫纳甜的碳酸饮料比用阿斯巴特增甜的可乐型碳酸软饮料的甜味特性有所提高。在酸性软饮料条件下莫纳甜比阿斯巴特更稳定，预计莫纳甜具有较长的保存期限。本文所用术语“碳酸”指含有溶解的和分散的二氧化碳的饮料。
在一些实施方式中，饮料组合物包括莫纳甜和甜味剂(如蔗糖或高果糖玉米糖浆)的混合物。在其它实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物包括调味品、咖啡因和/或散装甜味剂。散装甜味剂可以是，例如：蔗糖甜昧剂、无蔗糖甜味剂和低升糖指数碳水化合物(即升糖指数低于葡萄糖的碳水化合物)。在其它实施方式中，含莫纳甜的饮料组合物包括高强度甜味剂和/或低升糖指数碳水化合物。在其它实施方式中，含莫纳甜的饮料组合物包括甜味增强剂。
在一些实施方式中，饮料组合物含有基本上由S，S或R，R莫纳甜组成的莫纳甜。其它实施方式中，该组合物主要含有S，S或R，R莫纳甜。“主要”是指组合物中存在的莫纳甜的立体异构体，该莫纳甜所含的一种特定立体异构体的比例超过90％。一些实施方式中，该组合物基本上不含S，S或R，R莫纳甜。“基本上不含”是指组合物中存在莫纳甜的立体异构体，其中该组合物所含的一种特定立体异构体的比例低于2％。此外，或另选的，当用来描述用生物合成途径制造的莫纳甜时，“基本上不含”包含在生物合成途径中作为副产物制造的一定量的立体异构体(例如，S，S莫纳甜)，所述生物合成途径涉及采用手性特异性酶(例如D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸转氨酶)和/或手性特异性底物(例如具有一个R立体构型的碳原子)以制造不同的特定立体异构体(例如，R，R莫纳甜)。
在本发明的另一方面，饮料组合物包括在生物合成途径中产生的富含莫纳甜立体异构体的混合物。“富含立体异构体的莫纳甜混合物”是指该混合物含有一种以上莫纳甜立体异构体，且混合物中至少60％的莫纳甜立体异构体为一种特定的立体异构体，如R，R、S，S、S，R或R，S。其它实施方式中，该混合物中一种特定的莫纳甜立体异构体的含量超过65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。另一实施方式中，饮料组合物是富含R，R或S，S莫纳甜的混合物。“富含立体异构体的”R，R莫纳甜是指含有至少60％R，R莫纳甜的莫纳甜混合物。“富含立体异构体的”S，S莫纳甜是指含有至少60％S，S莫纳甜的莫纳甜混合物。其它实施方式中，“富含立体异构体的”莫纳甜含有超过65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的R，R或S，S莫纳甜。
可从植物Sclerochiton ilicifolius的根皮中分离莫纳甜。例如，可磨碎该皮，用水抽提，过滤并冻干，获得茶褐色无定形团块。可将该团块再溶于水，与酸形式的阳离子树脂，如“Biorad”AG50W×8的HCl形式(Bio-Rad LaboratorieS，Richmond，CA)发生反应。可用水洗涤该树脂，用氨水溶液洗脱结合于树脂的化合物。可冻干洗脱物，并进行水性凝胶过滤，参见例如，美国专利号5,128,164。或者，可通过化学方法合成莫纳甜。参见例如，Holzapfel和OlivieR，Synth。Commun。23：2511(1993)；Holzapfel等，Synth.Commun.38：7025(1994)；美国专利号5,128,164；美国专利号4,975,298；和美国专利号5,994,559中的方法。也可用重组方法生产莫纳甜。
在本发明的一个方面，提供了制造含有莫纳甜的饮料组合物的方法。该方法包括在体内和体外用生物合成方法生产莫纳甜。“生物合成途径”包括至少一个生物转化步骤。在一些实施方式中，生物合成途径是多步骤方法，至少一步是生物转化步骤。在其他实施方式中，生物合成途径是包括生物和化学转化步骤的多步骤方法。在一些实施方式中，所产生的莫纳甜是富含立体异构体的混合物。
在本发明的另一方面，提供了含有用生物合成方法生产的莫纳甜的饮料组合物。虽然可以用化学方法合成莫纳甜，但是在饮料应用中用生物合成方法生产的莫纳甜比化学合成的莫纳甜具有优点，因为化学合成的莫纳甜可包括不良污染物。
在本发明的另一方面，存在一些从选自以下的底物制造莫纳甜的生物合成途径：葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、以及吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也称为“莫纳甜前体”、“MP”或莫纳甜的α-酮式)。用来制造或产生莫纳甜或其中间体的生物合成途径的例子示于图1-3和11-13，这些图以框显示了可能的中间产物和终产物。例如，在这些途径中发生一种产物到另一种产物的转化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。
这些转化可用化学方法或生物学方法促进。术语“转化”指在将第一种中间体转化成第2种中间体的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽活性促进的反应。术语“生物转化”指由多肽活性促进的反应。转化可体内或体外发生。当使用生物转化时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物上。转化可用本领域普通技术人员已知的任何反应器完成，例如在分批或连续反应器中。
用来进行生物转化的多肽及其编码序列的实例示于图1-3和11-13。具有一个或多个改变多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。表达这种多肽的分离和重组细胞可用来制造莫纳甜。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
例如，制造莫纳甜的细胞可具有一种或多种(如两种或多种、或者三种或多种)以下活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 125：1096-1104，1976和Furuya等，Biosci Biotechnol Biochem64：1486-93，2000)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8th International Symposium on维生素B6和Carbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
在另一个例子中，细胞包括一种或多种(例如2种或多种或者3种或多种)下列活性：吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(4.1.3.-)，例如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)，合酶/裂解酶(4.1.2.-)，色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)，色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)，D-色氨酸转氨酶，D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)，和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，细胞可包括一种或多种(例如2种或多种或者3种或多种)下列活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)，色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸转氨酶(EC2.6.1.1)，L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)，色氨酸氧化酶，D-色氨酸转氨酶，D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)，D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)，D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)，吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)或4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
进一步的例子是，细胞可包含一种或多种以下醛缩酶活性：KHG醛缩酶、ProA醛缩酶、KDPG醛缩酶和/或相关多肽(KDPH)、转羧基苯丙酮酸水合酶-醛缩酶、4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶、反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶、3-羟基天冬氨酸醛缩酶、苯偶姻醛缩酶、二氢新蝶呤醛缩酶、L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂解酶(苯基丝氨酸醛缩酶)、4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶、1、2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶、和/或2-羟基苯丙酮酸醛缩酶。
能生成莫纳甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物转化成吲哚-3-丙酮酸；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转化成莫纳甜。能用于这些转化的示范多肽示于图2和3。
通过一步或多步生物转化利用生物合成途径制造莫纳甜有一些优点。例如，通过在该生物合成途径中使用特定的多肽和/或某些底物能够制得富含某种立体异构体的混合物，和/或制得基本上不含一种或多种立体异构体的莫纳甜混合物。
用莫纳甜合成法产生的莫纳甜组合物中可能含有一些杂质。仅用合成方法(即不包括至少一步生物转化)制得的莫纳甜组合物中所含的杂质不同于通过生物合成途径制得的莫纳甜组合物。例如，基于所用原料，仅用合成法制得的莫纳甜组合物可含有石油化学的、有毒的和/或对人类消费不利的其它危险污染物。这种污染物的例子包括危险化学品，如LDA、氢-Pd/C、重氮甲烷、KCN、格氏试剂和Na/Hg。另一方面，希望通过生物合成途径制造的莫纳甜组合物可含有可食用或可饮用的杂质，但不含石油化学的、有毒的和/或其它有害物质。
希望在通过一个或多个生物转化的生物合成途径中制造莫纳甜的方法相比单纯的合成方法能够产生较少的有毒或有害污染物，和/或可提供较高百分比的特定立体异构体。例如，希望当用D-氨基酸脱氢酶、D-丙氨酸(天冬氨酸)转氨酶、D-芳基转氨酶或D-甲硫氨酸转氨酶制造莫纳甜时，可以获得至少60％的R，R莫纳甜和少于40％的S，S、S，R和/或R，S莫纳甜。例如，当用上述D-酶类以及至少一种具有R-立体构型的碳原子的底物(例如莫纳甜前体)制造莫纳甜时还希望获得至少95％的R，R莫纳甜和少于5％的S，S、S，R和/或R，S莫纳甜。相反，当仅通过合成法制造莫纳甜时，我们只获得约25％-50％所需立体异构体。
一个实施方式中，通过生物合成途径制造莫纳甜的方法，例如包括一步或多步生物转化，不产生石油化学、有毒或危险污染物。“石油化学、有毒或危险污染物”是指任何石油化学的、有毒的、有害的和/或对人类消费者不利的物质，包括原料带来的污染物或在仅用合成法制造莫纳甜时产生的污染物。另一实施方式中，通过生物合成途径制造莫纳甜的方法，例如包括一步或多步生物转化，仅产生可食用或可饮用的物质。“可食用或可饮用的物质”是指适合人类食用或饮用或对人类消费者安全的一种或多种化合物或物质。可食用或可饮用的物质的例子包括莫纳甜、色氨酸、丙酮酸、谷氨酸、其它氨基酸以及人体内天然存在的其它化合物或物质。
在一个实施方式中，甜度相当时，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物比相同量的用蔗糖或高果糖玉米糖浆替换莫纳甜或其盐的饮料组合物所含热量和碳水化合物少。“甜度相当”或“相当的甜度”指有经验的感觉鉴定者平均测定出，第一种组合物中呈现的甜度是第二种组合物中呈现的甜度的80％-120％。
在其它实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物还含有柑橘调味品，其中，莫纳甜或其盐以能够增强柑橘调味品所提供的味道的量存在。在另一实施方式中，饮料组合物还含有柑橘调味品和碳水化合物，其中莫纳甜或其盐和碳水化合物的存在量能够增强柑橘调味品所提供的味道。碳水化合物可选自但不限于：赤藓醇、麦芽糊精、蔗糖及其组合。
在一个实施方式中，碳酸饮料含有糖浆组合物，含量范围约为该碳酸饮料重量的15％-25％，其中该糖浆组合物含有莫纳甜或其盐。
在另一实施方式中，饮料组合物约含3-10000ppm的莫纳甜或其盐。在其它实施方式中，该饮料组合物约含3-小于30ppm的莫纳甜，或约含大于2500-10000ppm的莫纳甜。在另一实施方式中，饮料组合物是糖浆或无水饮料混合物，其中该组合物约含10-10000ppm的莫纳甜或其盐。例如，该饮料组合物可以是适于约以1份糖浆：3份饮料至1份糖浆：5.5份饮料稀释于饮料的浓缩液糖浆。在一个实施方式中，该糖浆约含有18-300ppm的R，R莫纳甜或其盐。或者，该糖浆约含有0-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐，约含有0-300ppm的R，R莫纳甜或其盐。
在另一实施方式中，饮料组合物是约含10-10000ppm莫纳甜或其盐的无水饮料混合物。在一个实施方式中，无水饮料混合物约含600-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐。在另一实施方式中，该无水饮料混合物约含10-450ppm的R，R莫纳甜或其盐。或者，该无水饮料混合物约含0-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐，约含有0-450ppm的R，R莫纳甜或其盐。
在其它实施方式中，饮料组合物是约含3-10000ppm莫纳甜或其盐，该组合物基本不含R，R莫纳甜或其盐，或基本不含S，S莫纳甜或其盐。在另一实施方式中，该饮料组合物约含3-450ppm的R，R莫纳甜或其盐(如约含6-225ppm的R，R莫纳甜或其盐)。在另一实施方式中，饮料组合物约含3-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐(如约含60-4600ppm的S，S莫纳甜或其盐)。在另一实施方式中，饮料组合物约含0-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐，约含有0-450ppm的R，R莫纳甜或其盐。
在一个实施方式中，饮料组合物是约含3-2000ppm莫纳甜或其盐的即饮型组合物。在另一实施方式中，该即饮型组合物约含5-50ppm的R，R莫纳甜或其盐，或约含60-2000ppmS，S莫纳甜或其盐。
在另一实施方式中，饮料组合物约含450或以下ppm的R，R莫纳甜或其盐，并基本不含S，S、S，R或R，S莫纳甜或其盐。或者，饮料组合物约含10000或以下ppm的S，S莫纳甜或其盐，并基本不含R，R、S，R或R，S莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，饮料组合物中的莫纳甜或其盐主要由R，R莫纳甜或其盐组成，或主要由S，S莫纳甜或其盐组成。在其它实施方式中，饮料组合物中的莫纳甜或其盐是富含R，R立体异构体的莫纳甜或其盐，或者是富含S，S立体异构体的莫纳甜或其盐。在其它实施方式中，饮料组合物中的莫纳甜或其盐至少含有95％R，R莫纳甜或其盐，或至少含有95％S，S莫纳甜或其盐。
在一个实施方式中，该饮料组合物含有由生物合成途径生产的莫纳甜或其盐。在另一实施方式中，饮料组合物含有富含立体异构体的莫纳甜混合物，其中莫纳甜混合物是通过生物合成途径生产的。在一个实施方式中，该生物合成途径是多步骤途径，多步骤途径中至少一步是化学转化。在其它实施方式中，通过生物合成途径生产的莫纳甜混合物主要是R，R莫纳甜或其盐，或主要是S，S莫纳甜或其盐。
在一个实施方式中，饮料组合物含有由生物合成途径生产的莫纳甜组合物，其中莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。在另一实施方式中，饮料组合物含有莫纳甜或其盐，其中莫纳甜混合物由生物合成途径生产，从重组细胞中分离，其中重组细胞不含石油化学、有毒或危险污染物。
在一个实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物是不致龋齿的。在其它实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物还含有赤藓醇、海藻糖、环磺酸盐、D-塔格糖或其组合。
在其它实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物还含有散装甜味剂、高强度甜味剂、低升糖指数碳水化合物、调味品、抗氧化剂、咖啡因、甜味增强剂或其组合。例如，调味品可选自可乐调味品、柑橘调味品及其组合。例如，散装甜昧剂可选自玉米甜味剂、蔗糖、右旋糖、转化糖、麦芽糖、糊精、麦芽糖糊精、果糖、左旋糖、高果糖玉米糖浆、玉米糖浆固体、左旋糖、半乳糖、海藻糖、异麦芽酮糖、果糖-寡糖及其组合。例如，高强度甜味剂可选自三氯蔗糖、阿斯巴特、糖精、安赛蜜K、阿力甜(alitame)、奇异果甜蛋白(thaumatin)、双氢查耳酮、纽甜(neotame)、环磺酸盐、甜菊糖、罗汉果甙(mogroside)、甘草甜素(glycyrrihizin)、叶甜素、莫内林、马槟榔甜蛋白、布那珍(brazzein)、多肽菌素、倍他丁(pentadin)及其组合。例如，低升糖指数碳水化合物可选自D-塔格糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、氢化淀粉水解物、异麦芽糖(isomalt)、D-阿洛酮糖、1，5脱水D-果糖及其组合。例如，甜味增强剂可选自仙茅甜蛋白、非洲奇果蛋白、洋蓟酸、绿原酸、咖啡酸、叉柱花素(strogins)、阿拉伯半乳聚糖、麦芽酚、二羟苯甲酸及其组合。
在另一实施方式中，饮料组合物含有作为R，R莫纳甜或其盐和S，S莫纳甜或其盐的混合物的莫纳甜或其盐。此外，饮料组合物可含有莫纳甜或其盐和非莫纳甜甜味剂的混合物。非莫纳甜甜味剂可选自例如：蔗糖和高果糖玉米糖浆。
在一些实施方式中，制造含有莫纳甜或其盐的饮料组合物的方法包括从选自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫纳甜前体的至少一种基材生产莫纳甜或其盐。该方法还可包括将莫纳甜或其盐与至少一种不是莫纳甜或其盐的其它成分(例如赤藓醇、海藻糖、环磺酸盐、D-塔格糖、麦芽糖糊精或其组合)混合。在一些实施方式中，其它成分可选自例如：填充剂、散装甜味剂、液体甜味剂、低升糖指数碳水化合物、高强度甜味剂、增稠剂、脂肪、油、乳化剂、抗氧化剂、甜味增强剂、着色剂、调味剂、咖啡因、酸、粉末、助流动剂、缓冲液、蛋白来源、味道增强剂、味道稳定剂及其组合。散装甜味剂可选自例如：糖甜味剂、无糖甜味剂、低升糖指数碳水化合物及其组合。在其它实施方式中，由这种方法制得的饮料组合物约含0-10000ppm的S，S莫纳甜或其盐，约含0-450ppm的R，R莫纳甜或其盐。
在其它实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物的制造方法包括用生物合成途径生产莫纳甜或其盐。在一些实施方式中，含有莫纳甜或其盐的饮料组合物的制造方法包括用至少一步生物转化或仅用生物转化来生产莫纳甜或其盐。在另一实施方式中，含有莫纳甜组合物的饮料组合物的制造方法包括：(a)用生物合成途径在重组细胞中生产莫纳甜或其盐；(b)从重组细胞中分离莫纳甜组合物，其中莫纳甜组合物包含莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用物质。
在其它实施方式中，含有莫纳甜组合物的饮料组合物的制造方法包括用生物合成途径生产莫纳甜组合物，其中莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。在其它实施方式中，含有莫纳甜组合物的饮料组合物的制造方法包括在多步骤途径中从基材生产莫纳甜组合物，多步骤途径中一个或多个步骤是生物转化，其中莫纳甜组合物不含石油化学、有毒或危险污染物。
在其它实施方式中，含有莫纳甜组合物的饮料组合物的制造方法包括用生物合成途径生产莫纳甜组合物，其中莫纳甜组合物包含莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用物质。在另一实施方式中，含有莫纳甜组合物的饮料组合物的制造方法包括在多步骤途径中从基材生产莫纳甜组合物，多步骤途径中一个或多个步骤是生物转化，其中莫纳甜组合物包含莫纳甜或其盐以及其它可食用或可饮用物质。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的涵义与本发明所涉及技术领域的普通技术人员所通常理解的相同。虽然在实践或测试本发明的过程中可采用与本文所述内容相似或相同的方法和材料，但下面描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都被全文纳入作为参考。在冲突情况下，本说明书，包括定义将控制(本发明范围)。此外，材料、方法和实施例仅为示范性，不旨在限制。
本领域普通技术人员通过本文内容将明白，本发明的特定实施方式可指向上述一个方面或其组合，以及其它方面。通过以下详述将明白本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1显示用于生成莫纳甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径通过色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种通过吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后通过MP中间体生成莫纳甜。
框中所示化合物是底物和生物合成途径中生成的产物。与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转化成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不依赖于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
图2是使用MP中间体的生物合成途径的更详细图。框中显示了途径中各步骤的底物。实现底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。
图3显示将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。框中显示了途径中各步骤的底物。实现底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述
图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
图5A和5B是色谱图，显示酶法生成的莫纳甜的LC/MS鉴定。
图6是酶法合成的莫纳甜的电喷射质谱。
图7A和7B是酶混合物中生成的莫纳甜的LC/MS/MS子离子分析色谱图。
图8是色谱图，显示酶法生成莫纳甜的高分辨质谱测量。
图9A-9C是色谱图，显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫纳甜的手性分离。
图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的莫纳甜的相对量。(-)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
图11-12是示意图，显示用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图13是示意图，显示能用于增加莫纳甜产量的途径，莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图14表示用莫纳甜的R，R立体异构体获得的用量反应曲线。
图15表示用莫纳甜的R，R/S，S立体异构体获得的用量反应曲线。
图16比较了莫纳甜的R，R/S，S立体异构体混合物与糖精的用量反应曲线。
图17显示了用合成法制造的莫纳甜标准品的反相色谱。
图18显示了莫纳甜标准品的手性色谱。
发明详述
提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，单数形式也指复数，除非上下文另有明确规定。术语“约”包括发生于任何测定中的实验误差的范围。除非另有说明，认为所有的测定数字前面都有“约”字，即使没有明白地使用“约”字。术语“％重量/体积”或“％w/v”指每体积的重量百分数，其中100％重量/体积是1g/mL。因此，例如，1g/100mL是1％重量/体积(在液体组合物中)。术语“ppm”指每百万分之一份。例如，8ppm的莫纳甜指一百万克中有80克(g)莫纳甜。同样，1ppm＝0.0001％w/w，或者对于水溶液而言，＝1mg/L＝1μg/mL＝0.0001％重量/体积。
如图1-3和11-13所示，许多生物合成途径能用于生成莫纳甜或其中间体(如吲哚-3-丙酮酸或MP)。为将各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)转化成各产物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫纳甜)，可使用几种不同多肽。此外，这些反应可在体内、体外完成，或通过体内反应和体外反应的组合，如包括非酶化学反应的体外反应。因此，图1-3和11-13是示范性的，显示能用于获得所需产物的多种不同途径。
葡萄糖到色氨酸
许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。可将含从葡萄糖和/或色氨酸生成莫纳甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转化成莫纳甜。
在其它例子中，用已知多肽改造生物体以生成色氨酸或超量产生色氨酸。例如，美国专利号4,371,614描述用含野生型色氨酸操纵子的质粒转化大肠杆菌菌株。
美国专利号4,371,614所述色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，WO 8701130描述遗传改造大肠杆菌菌株以生成色氨酸并讨论增加L-色氨酸的发酵生产。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
可用一些多肽将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。这些种类包括但不限于称为色氨酸转氨酶的多肽(也称为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、和L-色氨酸：2-氧戊二酸转氨酶)，它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺；D-色氨酸转氨酶，它将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也称为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸：NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也称为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸：苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2；D-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H2O2。这些种类也含有酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
转氨酶种类中有这种活性的11个成员描述于下面的实施例1，包括SEQ IDNOS：11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和氨基酸序列，与SEQID NOS：11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NOS：11和12的片段和融合体，它们保持转氨酶活性或编码有转氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO：11的毗连核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO：12的毗连核苷酸。所示序列(和其变体、片段和融合)可以是载体的一部分。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步生成MP和/或莫纳甜。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分离自一些不同来源，如地中海蝰(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、红口蝮(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobactercresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)、和红球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且能分离自例如鬼伞属(Coprinus)SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。能将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的1个L-氨基酸氧化酶类成员讨论于下面的实施例3以及分子克隆的另外来源。许多D-氨基酸氧化酶基因在分子克隆的数据库中是有用的。
已知色氨酸脱氢酶，且可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。已知许多D-氨基酸脱氢酶基因序列。
如图11-13所示，如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过多种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也称为吲哚乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也称为乳酸脱氢酶、乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也称为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸：NAD(P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也称为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶，1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也称为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸：NAD(P)+氧化还原酶)。可能这些种类中的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此转化的例子提供于实施例2。
化学反应也能用于将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如：使用B2催化剂的空气氧化(China ChemicalReporter，13卷，28期，18页(1)，2002)，金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。
吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)
一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸转化成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也称为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17，也称为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转化成丙酮酸。可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC 4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也称为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点突变可增加β-裂合酶反应速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)和实施例8所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子描述于下。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化学反应产生，如实施例5提供的醛醇缩合。
MP到莫纳甜
MP到莫纳甜的转化可由下列1个或多个催化：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员描述于下(实施例1)，包括SEQ ID NOS：11和12所示新的种类成员，实施例7提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰硼氢化钠进行。
图11-13显示另外的多肽，它们能用于使MP转化成莫纳甜，以及增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫纳甜产量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转化成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶(如草酰乙酸脱羧酶)转化成丙酮酸和二氧化碳(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转化成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转化成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转化成莫纳甜，可使用能再循环NAD(P)H和/或生成挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。
设计生物合成途径中的另外考虑
取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜，能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以提高产物形成。此外，可设计遗传修饰来提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜等产物的产量。类似的，使用宿主细胞可使莫纳甜生产最优化。
去除过氧化氢
过氧化氢(H2O2)是一种产物，如果产生，会对生产细胞、多肽或产生的产物(如中间体)有损害。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢降解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于：tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天兰色链霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应也能包含过氧化氢酶多肽。
吡哆醛5’-磷酸(PLP)有效性的调节
如图1所示，PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。
充分研究大肠杆菌中维生素B6(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，449：45-8，1999)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC)，而3个基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前体是来自4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸的苏氨酸衍生物。转化到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxJ的基因产物催化。
如果PLP成为发酵生产莫纳甜期间的限制营养物，可增加1个或多个途径中的基因在生产宿主细胞中的表达来提高莫纳甜产量。宿主生物体可包含多个其天然途径基因的拷贝，或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体基因组中。另外，可在宿主生物体内克隆入拯救途径基因的多个拷贝。
1个在所有生物体中保守的拯救途径使多种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP可得性。
可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节提高维生素B6水平。PLP阻抑参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成的多肽。此细菌菌株无代谢控制，过度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以类似方式遗传操作产生莫纳甜的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
铵利用
能驱动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)，这是通过制备更能利用的氨或去除水。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来驱动。
氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐而得到。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
除去产物和副产物
色氨酸经色氨酸转氨酶转化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酰胺并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化成2-氧戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原性等价物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸到莫纳甜的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转化成步骤1所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2种独立的转氨酶能提高此途径的效率，其中1种转氨酶的底物非竞争性抑制其它转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的且因此会到达底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加此途径的产量。例如，用通透酶或其它转运蛋白使莫纳甜分泌入发酵液或者从生物催化反应器流中选择性结晶莫纳甜并伴随底物再循环会提高反应产量。
另一种增加反应产量的方法是通过另外的酶反应或氨基供体基团的取代来去除副产物。实施例13讨论了一些例子且示于图11-13。例如，可产生不能在反方向中反应的副产品，这是通过相变(蒸发)或自发转化成惰性的终产物如二氧化碳实现的。
底物库的调节
可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径调节吲哚库。例如，可通过宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因功能性缺失来减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC4.1.99.1的基因减少或去除从色氨酸生成吲哚。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82：604-6，1996)。此外，可进行遗传修饰以增加中间体，如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸的水平。
在大部分生物体中调节色氨酸生成。一种机制是通过反馈抑制途径中的某些酶；随着色氨酸水平增加，色氨酸的产率减少。因此，当使用经色氨酸中间体生成莫纳甜的经工程改造的宿主细胞时，可使用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，通过反复暴露于高浓度5-甲基色氨酸，选择抗多种色氨酸类似物的生长抑制的玫瑰长春花(Catharanthus roseus)品系(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch 34：541-5，1979)。可能由于基因突变，所得品系的色氨酸合酶活性受到产物抑制的影响小。类似地，可优化用于莫纳甜生成的宿主细胞。
可使用定向进化，以形成对产物抑制不太敏感的多肽来优化色氨酸生成。例如，筛选能在培养基中不含色氨酸，但具有高水平的不可代谢的色氨酸类似物的平板上进行。美国专利号5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加发酵生物体中色氨酸产率的方法。色氨酸生物合成的最后步骤是在吲哚中加入丝氨酸；因此能提高丝氨酸的有效性以增加色氨酸生成。
可通过增加宿主生物体产生的丙酮酸量来提高发酵生物体产生的莫纳甜量。一些酵母如丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35：338-42，2002)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57：451-9，2001)超量产生丙酮酸且能用于实践本文所述方法。此外，可对生物体进行遗传修饰以促进丙酮酸生成，如在大肠杆菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82：604-6，1996)中。
控制手性
通过控制立体化学(手性)能改变莫纳甜的味觉分布。例如，不同食物系统的浓度不同的混合物中需要不同的莫纳甜异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
通过α碳的去质子化和再质子化可在莫纳甜的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋，这能通过pH变化或与酶(例如外消旋酶)结合或在溶液中游离的辅因子PLP反应来发生。在微生物中，pH不太可能变化到足以引起外消旋，但PLP是丰富的。控制多肽手性的方法取决于用于生成莫纳甜的生物合成途径。
当莫纳甜用图2所示途径形成时，可考虑下列各项。在生物催化反应中，碳-2的手性由酶确定，该酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转化成MP，因此可选择形成所需立体异构体的酶。另外，可用定向进化改变将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性，或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性加入氨基，如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象，这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-立体异构体特异，然而，在一些植物中也存在D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》，日本大阪，1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。一些转氨酶仅接受在C2碳有特定构象的此反应的底物。因此，即使转化成MP不是立体定向的，可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的，未反应MP(不需要的立体异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活
磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇相互转化异构体，使它更具反应性。在其它反应中，磷酸化底物通常提供更好的离去基团。类似地，可通过转化成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。
莫纳甜在饮料组合物中的用途
按重量计，莫纳甜的S，S立体异构体比蔗糖甜约50-200倍。按重量计，莫纳甜的R，R立体异构体比蔗糖甜约2000-2400倍。莫纳甜的甜度是由有经验的感觉鉴定员在甜度比较过程中计算的，该过程将测试甜味剂溶液与一系列参考溶液之一的甜度进行比较。例如，溶液可用含有0.16％(v/w)柠檬酸和0.02％(v/w)柠檬酸钠的缓冲液(pH 3.0)制备。
具体的，可采用受过训练熟悉甜味估计方法的一组感觉鉴定者评价甜味剂相对于蔗糖的甜度。在22℃±1℃的温度下一式两份测试所有样品(在相同缓冲液中)。例如，可用含有0.16％(w/v)柠檬酸和0.02％(w/v)柠檬酸钠～pH 3.0制备样品溶液。用3位随机数字号码编码测试溶液，将该溶液随机分给各小组成员。提供蔗糖范围在2.0-10.0％(w/v)的蔗糖参比标准，相邻浓度的增加值为0.5％(w/v)蔗糖。要求小组成员通过比较测试溶液与蔗糖标准品的甜度来估计甜度。通过下述方法进行该测试：吸啜3小口测试溶液，然后吸啜一口水，吸啜水后吸啜3小口蔗糖标准品等。小组成员把甜度估计到一位小数位，如6.8、8.5。在评价测试溶液之间休息5分钟时间。也要求小组成员彻底地嗽口并食用饼干以降低任何可能的后遗作用。
将由一组受过训练的感觉鉴定者确定的蔗糖等价值(SEV)(如％蔗糖)作为莫纳甜浓度的函数作图，获得剂量反应曲线。对剂量反应曲线应用多项式曲线拟合，通过用蔗糖等价值(SEV)除以莫纳甜浓度(如％莫纳甜)来计算具体点上的甜度强度或效能，如8％SEV。参见例如：图15(R，R/S，S莫纳甜剂量反应曲线)；图14(R，R莫纳甜剂量反应曲线)。测定上述S，S和R，R莫纳甜的甜度强度(即分别比相同重量的蔗糖甜约50-200倍和约2000-2400倍)约为8％SEV。
莫纳甜可以消费者喜欢的浓度溶于含水溶液。在某些基料中或与其它甜味剂混合时莫纳甜立体异构体混合物的质量可能较好。将莫纳甜与其它甜味剂混合可使甜味强度和/或特性最大且成本最低。莫纳甜可与其它甜味剂和/或其它成分组合以产生类似于蔗糖的暂时特性，或获得其它益处。
例如，莫纳甜可与其它营养和非营养甜味剂混合以获得特定的味道或卡路里目标。因此，甜味剂组合物可包括莫纳甜与一种或多种以下甜味剂类型的组合：(1)糖醇(如赤藓醇、山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、异麦芽糖、低糖糖浆等)；(2)其它高强度甜味剂(如阿斯巴特、三氯蔗糖、糖精、安赛蜜、甜菊糖、环磺酸盐、纽甜、奇异果甜蛋白、阿力甜、双氢查耳酮、莫尼糖蛋白、甘草甜素、罗汉果甙、叶甜素、马槟榔甜蛋白、布那珍、多肽菌素、倍他丁等)，以及(3)营养甜味剂(如蔗糖、D-塔格糖、转化糖、果糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆(HFCS)、葡萄糖/右旋糖、海藻糖、异麦芽酮糖等)。莫纳甜可作为味道修饰剂用于这种混合物以抑制后味、强化其它味道，如柠檬味，或改善暂时味道特征。数据还显示，莫纳甜与环磺酸盐(在欧洲使用)有协同作用，但与阿斯巴特、糖精、安赛蜜、三氯蔗糖或碳水化合物甜味剂的协同作用不明显。
由于莫纳甜不是碳水化合物，可用其降低饮料组合物中的碳水化合物含量。在一个实施方式中，一定量的含有莫纳甜的饮料组合物所含的热量和碳水化合物比相同量的用糖(如蔗糖和/或高果糖玉米糖浆)替代莫纳甜的饮料组合物少。在其它实施方式中，含有莫纳甜(如含有莫纳甜和一种或多种碳水化合物)的饮料组合物随时间提供的口感、味道和甜度与仅含碳水化合物作为甜味剂的类似饮料组合物所提供的相当。
莫纳甜在干燥形式下稳定，并在单独或与碳水化合物混合物时具有所需味道表现。它未显示出不可逆转的分解，但在低pH时倾向于形成内酯和/或内酰胺(在含水缓冲液中)并达到平衡。在溶液中，它可在4位缓慢外消旋，但这通常在高pH下发生。通常，莫纳甜的稳定性比得上或好于阿斯巴特，莫纳甜的味道表现比得上或好于其它品质的甜味剂，如阿斯巴特、阿力甜和三氯蔗糖。相比糖精和甜菊糖等其它高强度甜味剂，莫纳甜没有不好的后味。
在一些实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物也包括以下物质的一种或多种：缓冲液、填充剂、增稠剂、脂肪、调味剂、着色剂(也称为染料或颜料)、甜味剂和助流动剂。可配制饮料组合物，如通过调整饮料中存在的莫纳甜或其它甜味剂的量，或通过调整组合物中存在的其它类型添加剂包括调味剂或酸的量，使饮料组合物具有特定甜度特性。在其它实施方式中，用于饮料组合物的所有成分都是食品级的，通常认为是安全的。
在一些实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物还包含食品级的抗氧化剂。这种抗氧化剂的例子包括维生素C(如抗坏血酸、抗坏血酸磷酸镁)、异抗坏血酸盐(异抗坏血酸)，类胡罗卜素如叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素，生育酚(如α-生育酚(天然维生素E)、γ-生育酚、δ-生育酚)，羟基肉桂酸(如新绿原酸和绿原酸)，谷胱甘肽，酚醛类(如可可酚、红酒酚、李子中的酚醛类物质)，丁基化羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，叔丁基氢醌(TBHQ)，没食子酸丙酯，乳酸链球菌肽，绿茶萃取物和迷迭香萃取物。在其它实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物还含有某种防腐剂，如苯甲酸钠和/或山梨酸钾。
在其它实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物还含有一种或多种防止非酶褐变反应(如由美拉德反应引起的褐变)的成分。这种成分可包括但不限于：亚硫酸盐和亚硫酸盐化剂(如二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢纳或亚硫酸氢钾、偏亚硫酸氢盐、含巯基的氨基酸)、氯化钙和其它无机卤化物、抗氧化剂和影响水化活性的化合物(如甘油、山梨醇和海藻糖)。
在一些实施方式中，可以容易地分散含有莫纳甜的饮料浓缩物如无水饮料混合物，制备巧克力饮料、水果饮料、加麦芽饮料或柠檬水。在其它实施方式中，饮料浓缩物是可用于制备碳酸软饮料的饮料糖浆。可通过，例如用碳酸水稀释含水的饮料糖浆、莫纳甜和调味剂来制备碳酸饮料。在一些实施方式中，该饮料糖浆也含有其它甜味剂和/或添加剂。可通过，例如将所有成分混合并加热溶解来制备饮料糖浆。饮料糖浆可包括例如：至少80％的水(如至少85％、90％或95％的水)。
在某些实施方式中，所存在的莫纳甜的范围约为饮料组合物的0.0003-1％(即约3-10,000ppm)(如约0.0005-0.2％)，包括该范围中任何特定值(如饮料组合物的0.0003％、0.005％、0.06％或0.2％)。例如，饮料组合物可含有0.0005-0.005％(如0.001-0.0045％)的R，R莫纳甜，或0.005-0.2％(如0.01-0.175％)的S，S莫纳甜。
本领域技术人员将了解，可用甜味剂组合为饮料组合物提供所需味道和热量。因此，饮料组合物中甜味剂的量取决于所选择的甜味剂和所需的甜度强度。甜味剂可从市场上购得，如从Cargill Inc.(Wayzata，MN)和McNeil Specialty(Fort Washington，PA)购得。在一个实施方式中，饮料组合物包括莫纳甜和甜味剂(如蔗糖或高果糖玉米糖浆)的混合物。例如，饮料组合物可包括莫纳甜和散装甜味剂散装甜味剂。
散装甜味剂可选自，例如，糖甜味剂、无糖甜味剂、低升糖指数碳水化合物及其组合。糖甜味剂可包括例如：玉米甜味剂、蔗糖、右旋糖(如工业葡萄糖右旋糖)、麦芽糖、糊精、麦芽糖糊精、转化糖、果糖、高果糖玉米糖浆、左旋糖、半乳糖、玉米糖浆固体、半乳糖、海藻糖、异麦芽酮糖、果糖-寡聚糖(如蔗果三糖或霉菌赤藓醛糖)、高分子量果糖-寡聚糖或其组合。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)和其它玉米衍生的甜味剂是右旋糖(葡萄糖)和果糖的组合。此外，糖甜味剂包括水果糖、槭糖浆和蜂蜜，或其组合。在一个实施方式中，可将0.0003-0.15％莫纳甜(如0.0006-0.004％的R，R莫纳甜)和2-10％(如3-10％或4-6％)的蔗糖或高果糖玉米糖浆用于饮料组合物。
在另一实施方式中，饮料组合物包括无糖甜味剂和/或低升糖指数碳水化合物(即比葡萄糖的升糖指数低的化合物)。无糖甜味剂或低升糖指数碳水化合物包括但不限于：D-塔格糖、山梨醇(包括无定形山梨醇和结晶山梨醇)、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、氢化淀粉水解物、异麦芽糖、D-阿洛酮糖、1，5脱水D-果糖或其组合。
在某些实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物也含有高强度甜味剂。在一些实施方式中，高强度甜味剂比蔗糖至少甜20倍(即20×蔗糖)。这种高强度甜味剂包括但不限于：单独或组合的三氯蔗糖、阿斯巴特、糖精及其盐、乙酰舒泛盐(如安赛蜜)、阿力甜、奇异果甜蛋白、双氢查耳酮(如双氢查耳酮新橙皮素)、纽甜、环磺酸及其盐(即环磺酸盐)、甜菊糖(从甜菊(Stevia rebaudiana)叶中萃取)、罗汉果甙(从罗汉果果实中萃取)、甘草甜素、叶甜素(从绣球(Hydrangea macrophylla)叶中萃取、约400-600×蔗糖)、莫内林、马槟榔甜蛋白、布那珍、多肽菌素、倍他丁。
仅在其它化合物如酸存在的情况下表现出甜味的甜味增强剂也可用于饮料组合物。甜味增强剂(也称为甜味增效剂)的非限制性例子包括仙茅甜蛋白、非洲奇果蛋白、洋蓟酸、绿原酸、咖啡酸、叉柱花素(strogins)、阿拉伯半乳聚糖、麦芽酚和二羟苯甲酸。在某些实施方式中，含有莫纳甜的饮料组合物也包括味道增强剂或味道稳定剂，如SucramaskTM或海藻糖。
饮料组合物中可任选地包括食品级天然或人工着色剂。这些着色剂可选自本领域通常所知和可用的着色剂，包括合成颜料(如偶氮染料、三苯基甲烷、黄嘌呤素、奎宁和靛类染料)、焦糖色、二氧化钛、红色#3、红色#40、蓝色#1和黄色#5。也可采用天然着色剂如甜菜汁(甜菜红)、洋红、姜黄素、叶黄素、胡萝卜汁、浆果汁、调味料(姜黄、胭脂树和/或红辣椒)萃取物和类胡罗卜素。所选着色剂的类型和量将取决于最终产品和消费者偏好。
在一些实施方式中，饮料组合物也包括一种或多种天然或合成调味剂。合适的调味剂包括柑橘和非柑橘水果调味剂；香料；药草；植物性药材；巧克力、可可或巧克力利口酒；咖啡；获自香草豆的调味剂；坚果萃取物；利口酒和利口酒萃取物；水果白兰地酒蒸馏物；芳香化学品、仿制调味剂；以及上述任何物质的浓缩物、萃取物或香精。柑橘香料包括例如：柠檬、酸橙、橙、橘子、柚子、香橼或金橘。许多调味剂可从市场上购得，如从Rhodia USA(Cranbury，NJ)；IFF(South Brunswick，NJ)；Wild Flavors，Inc.(Erlanger，KY)；Silesia Flavors，Inc.(Hoffman Estates，IL)，Chr.Hansen(Milkwaukee，WI)和Firmenisch(Princeton，NJ)购得。
例如，用于制备碳酸软饮料的饮料糖浆可包括可用于将可乐味道赋予饮料的天然可乐调味剂(如来自可乐果萃取物)。在一些实施方式中，可让调味剂形成乳剂，然后再分散到饮料糖浆中。乳剂小滴通常具有比水小的特定重力，因此可形成不同相。增重剂、乳化剂和乳剂稳定剂可用于使乳剂小滴稳定。这种乳化剂和乳剂稳定剂的例子包括树胶、果胶、纤维素、聚山梨醇酯、山梨聚糖酯和丙二醇藻酸盐。在一些实施方式中，可乐味乳剂占饮料糖浆的0.8-1.5％。在其它实施方式中，可用于增强可乐味道的附加调味剂包括柑橘香料如柠檬、酸橙、橙、橘子、柚子、香橼或金橘，以及调味品香料如丁香和香草。在其它实施方式中，柑橘香料(如天然柠檬或酸橙香料)约占饮料糖浆的0.03-0.06％，调味品香料(如香草)占饮料糖浆的0.5-1.5％。
可通过加入酸(如无机酸或有机酸)控制饮料糖浆的pH。一般地，饮料糖浆的pH范围在2.5-约5(如2.5-约4.0)之间。特别有用的无机酸包括可以其未离解形式或作为碱金属盐(如磷酸氢钾或磷酸氢钠，或者磷酸二氢钾或磷酸二氢钠)存在的磷酸。可采用的有机酸的非限制性例子包括柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、己二酸、葡糖酸、葡糖醛酸内酯、羟基柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸、乙酸或其混合物。这些酸可以其非解离形式存在或作为它们各自的盐存在。
在一些实施方式中，饮料糖浆还含有咖啡因(如来自天然可乐香料)。也可单独加入咖啡因。
在一个实施方式中，可通过用碳酸水稀释饮料糖浆使产生的饮料含有15-25％的糖浆和75-85％的水，来制备碳酸饮料。或者，可用非碳酸水稀释该糖浆来制备饮料，然后将二氧化碳引入该饮料以实现碳酸化。在另一实施方式中，一般将碳酸饮料置于容器，如瓶或罐中，然后密封。可采用任何常规碳酸化方法来制造本发明的碳酸饮料。
在一些实施方式中，饮料组合物可以是脱水的饮料混合物。需要注意的是，“脱水”材料可含有残留水平的液体。例如，饮料混合物可以是加麦芽饮料混合物、巧克力味的饮料混合物或粉末水果饮料混合物如或Crystal。在一个实施方式中，可通过下述方法制备脱水的饮料混合物：在溶液中湿混合各液体成分，然后真空干燥这些成分，产生干燥块，然后将该干燥块研磨成粉基。可用成分如油、乳化剂和水与其它干成分混合，如将可可粉加入粉基中。
在另一实施方式中，可将一般不含有甜味剂，而消费者一般会将其与蔗糖混合的饮料粉基，如柠檬水小包，与高强度甜味剂如莫纳甜混合。例如，可用稀释剂或填充剂如麦芽糖糊精、水解淀粉、右旋糖、聚糊精和菊粉帮助混合。
在其它实施方式中，加麦芽饮料混合物包括脱水饮料成分，例如粉末蛋白来源如奶粉、脱脂奶粉，鸡蛋蛋白粉，植物或谷物蛋白分离物如大豆蛋白分离物、麦芽粉、水解谷物粉、淀粉、其它碳水化合物粉、维生素、矿物质、可可粉和粉末调味剂，或这些成分的任何组合。液体加麦芽饮料成分可包括，例如一种或多种脂肪或油，液体麦芽萃取物，液体甜味剂如蜂蜜和葡萄糖浆，以及液体蛋白来源如蔬菜蛋白浓缩物，或其任何组合。合适的脂肪包括但不限于：部分或完全氢化的植物油，如棉花籽油、大豆油、玉米油、葵花油、棕榈油、菜籽油，棕榈仁油、花生油、米糠油，红花油，椰子油，菜籽油，以及它们的中等油酸和高油酸对应物；或其任何组合。也可采用动物脂肪如乳脂。各加麦芽饮料成分的量可根据所需配方而不同。在一些实施方式中，可将莫纳甜与上述散装甜味剂混合。
在一些实施方式中，水果饮料预混合物包括柠檬酸(如60-70％)、调味剂(如2-4％)、着色剂(如0.00别 1-1％)、莫纳甜、磷酸钙(如0-25％)、浊化剂(如0-5％)和抗坏血酸(如0-2％)。例如，水果饮料混合物可包括64.9％柠檬酸、20.5％磷酸钙、3.9％浊化剂、0.78抗坏血酸、2.7％香料、0.1％颜料和莫纳甜。在一些实施方式中，可将莫纳甜与上述散装甜味剂混合。在另一实施方式中，为制备水果饮料，可用水重新构建该预混合物，使产生的饮料约含0.5-1.5％(如0.75％)的混合物。
在一个实施方式中，干巧克力饮料组合物可包括脱脂奶粉(如约20-30％)、乳清粉(如35-45％)、咖啡调白油(如10-15％)、低脂可可粉(如15-20％)、碳酸氢钾(如0.1-10％)、瓜尔胶(如0.06-2％)、角叉聚糖(如0.05-5％)、香料(如巧克力和/或香草)以及莫纳甜。例如，干巧克力饮料组合物可包括26％脱脂奶粉、40％乳清粉、12％咖啡调白油、18％低脂可可粉、1％碳酸氢钾、0.6％瓜尔胶、0.5％角叉聚糖、巧克力香料、香草香料以及莫纳甜。在另一实施方式中，为制备巧克力饮料，可用水或牛奶重新构建预混合物，使产生的饮料约含0.5-1.5％(如0.8％)的混合物。
在一些实施方式中，以组合物形式提供了用于制备饮料组合物的干成分混合物，用于制备饮料组合物的湿成分混合物，或干成分和湿成分的液体混合物(分散体)。可以制品形式提供这种组合物，也可将其包装到合适的容器(如包、桶、盒)中，以易于运输至销售点和制备，也易于倾倒和/或混合。该制品可含有任选物体，如器皿；用于混合的容器；或其它任选成分。该制品可包括制备饮料组合物的说明书。
预计与饮料中的其它甜味剂相比，饮料中所含的莫纳甜的保存期限更长，热稳定性和酸稳定性更高，味道特征和市场前景也更好。下面的实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制所述的本发明范围。
实施例
实施例1
色氨酸转氨酶的克隆和表达
该实施例描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法，它可用于使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。
实验概述
11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)D-丙氨酸转氨酶(dat，Genbank登录号Y14082.1bp 28622-29470和Genbank登录号NP_388848.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti也称为Rhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(tatA，SEQ ID NOS：1和2分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定，SEQ ID NOS：3和4分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS：5和6，分别为核酸序列和氨基酸序列)硕大利什曼原虫(Leishmania major)广底物转氨酶(bsat，通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定，SEQ ID NO：7和8分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：9和10分别为核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：11和12，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS：13和14分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa，通过同源性确定，Genbank登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登录号ZP00005082.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC，Genbank登录号AE000195.1bp 2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，SEQ ID NOS：31和32分别为核酸序列和氨基酸序列)。克隆、表达了基因并与可商业购买的酶一起测试它将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的活性。所有11个克隆有活性。
鉴定可包含具有所需活性的多肽的细菌菌株
NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或从纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性，来源如下：羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarum biovar trifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(E.herbicola pv.gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.syringae pv.savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、团聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(L.Helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆(Phaseolus aureus)(绿豆)、葡萄状酵母(卡尔斯伯根糖酵母)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(Clostridium Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
实施例2
吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸
如图1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸间的转化是可逆反应，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸间的转化也是这样。由于在340nm来自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。
0.1mL标准测定混合物含有100mM磷酸钾，pH8.0、0.3mM NAD+、7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。混合多肽和缓冲液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暂混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒间隔阅读。反应在25℃保持5分钟。从NAD+生成NADH后，在340nm的吸光度增加。不用NAD+以及不用底物进行单独的负对照。来自肠膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)似乎显示与吲哚衍生物底物的活性大于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)的活性。
用类似方法，使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸还原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH氧化反应的Vmax约为乳酸的五分之一。也通过使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液，跟踪在327(烯醇-硼酸盐衍生物)的吸光度变化测量吲哚-3-丙酮酸的存在。与用于L和D-LDH多肽的负对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。
此外，可克隆广特异性乳酸脱氢酶(酶活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC1.1.2.3相关)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广特异性脱氢酶的来源包括大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
另外，可通过吲哚-3-乳酸接触来自生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或接触克氏表鞭毛型锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物含有已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或食酸假单胞菌(Pseudomonas Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或锦紫苏(Coleus blumei)，它含有羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)；或麦芽念珠菌(Candida maltosa)，它含有D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)来生成吲哚-3-丙酮酸。描述这种活性的参考文献包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71：119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.141968、Coote和Hassall(Biochem.J.111：237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.C：Biosci.43501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol 135：353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶，如来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.Catalysis B：Enzymatic：18：299-305，2002)可用于将吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
实施例3
用L-氨基酸氧化酶将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸
该实施例描述的方法用于经氧化酶(EC 1.4.3.2)将L-色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸的方法，作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶的另一种选择。L-氨基酸氧化酶纯化自南美响尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登录号包括：CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物含有5mM L-色氨酸、100mM磷酸钠缓冲液pH6.6、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25mM四硼酸钠、0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。负对照含有色氨酸之外的所有成分，空白含有氧化酶之外的所有成分。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨期间形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式，吲哚-3-丙酮酸在327nm显示最大吸光度。在反应混合物中制备0.1-1mM浓度的吲哚-3-丙酮酸标准。
购得的L-氨基酸氧化酶具有每分钟每毫克蛋白形成540μg吲哚-3-丙酮酸的比活。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。
实施例4
用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸
该实施例描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转化成MP，使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是在一种醛的β-碳或酮与另一种醛或酮的羰基碳间形成碳-碳键的反应。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地，亲电底物是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。
然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 1045-029描述从乙醛酸和丙酮酸使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)生成L-4-羟基-2-酮戊二酸。此外，4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC 4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。
克隆
4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化与图2的醛缩酶反应非常相似的反应。设计引物的突出端与pET30Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。
proA基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)proA和苜蓿根瘤菌(S.meliloti)SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定的。睾丸酮丛毛单胞菌基因产物纯化至＞95％纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿根瘤菌基因产物的产量很低，细胞提取物用于酶测定。
两种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的同时存在。当缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(通常比当酶存在时少1个数量级)。
从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准，此峰的质谱显示292.1的碰撞诱导母离子([M+H]+)，产物MP预期的母离子。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征，如色氨酸，λmax为279-280且有约290nm的小肩。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量的增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量增加。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为每毫升反应物10-40μg。
由于苜蓿根瘤菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)的醛缩酶(以睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统为基础)。
khg基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿根瘤菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断的。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到＞95％纯度；用His-结合柱体亲和纯化后，苜蓿根瘤菌基因产物的产量不高。
没有迹象证明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定，报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高，比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25％，如SRM所确定(见实施例10)。根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酰胺(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位)；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位含有活性位点残基苏氨酸，而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿根瘤菌和大肠杆菌酶，其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性
催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广范围的底物，并能用于催化图2所示反应。
也能通过定向进化改进醛缩酶，例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源)，KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应，因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸)，但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature409：232-9，2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与许多羧酸的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的特异性比细菌形式更广，包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R立体异构体有10倍的偏好。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物，在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点，这是莫纳甜生成需要的。
利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶能“进化”以修改多肽特异性、速度和选择性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基团，像吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括但不限于：KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶；4-(2-羧苯基苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基亚苄基丙酮酸醛缩酶)，它缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物)；来自恶臭假单胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作为底物；3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作为底物且被认为在生物体脱氮微球菌(Micrococcusdenitrificans)中；苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含苄基的底物；二氢新蝶呤醛缩酶；L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶)，它缩合甘氨酸与苯甲醛；4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶；1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。
通过筛选感兴趣的克隆可选择有所需活性的多肽，使用下列方法。用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化色氨酸营养缺陷型且生长于含少量莫纳甜或MP的培养基。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的，细胞能从莫纳甜的外消旋混合物生成色氨酸。类似地，通过利用MP或莫纳甜作为碳源和能源的能力可筛选生物体(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是多种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多不寻常的分解代谢途径用于降解芳族分子，它们也含有许多醛缩酶；而根瘤菌含有醛缩酶，已知在植物根瘤中生长，有许多描述用于构建莫纳甜生物合成途径的基因。
实施例5
化学合成莫纳甜前体
实施例4描述的方法使用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。该实施例描述另一种化学合成MP的方法。MP可用典型的醛醇类型缩合形成(图4)。简言之，典型的醛醇类型反应包括用强碱，如LDA(二异丙基酰胺锂)、六甲基二硅氮烷锂或丁基锂产生丙酮酸酯的碳负离子。产生的碳负离子与吲哚-丙酮酸反应以形成偶联产物。
可用于保护吲哚氮的保护基团包括但不限于：叔丁氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羧酸的封闭基团包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、苄基酯)。当使用这些保护基团时，不可能控制所形成产物的立体化学。然而，如果R2和/或R3是手性保护基团(图4)，如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺，可使一种MP对映异构体的形成优于另一种。
实施例6
色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转化成莫纳甜
体外方法使用转氨酶和醛缩酶2种酶，从色氨酸和丙酮酸生成莫纳甜。在第1步中，α-酮戊二酸是转氨反应中来自色氨酸氨基的受体，反应产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛缩酶催化第2个反应，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸盐存在时与吲哚-3-丙酮酸反应，产生莫纳甜(MP)的α-酮衍生物，2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。转移第1个反应中形成的谷氨酸的氨基生成所需产物莫纳甜。纯化和表征产物确定形成的立体异构体是S，S-莫纳甜。描述另外的底物、酶和条件以及对此方法进行的改进。
酶
克隆、表达和纯化来自睾丸酮丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)，如实施例4所述。克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16)，如实施例4所述。
用于结合醛缩酶以生成莫纳甜的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿根瘤菌TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的广底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。如实施例1描述克隆、表达和纯化非哺乳动物蛋白。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)获得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法
1升反应混合物中含有50mM醋酸铵，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mM α-酮戊二酸、160mg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化细胞提取物，～30％醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化细胞提取物，～40％醛缩酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。随后加入酶，反应溶液30℃孵育并温和振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时，在反应中加入固体色氨酸等分样品(各50微摩尔)。所有加入的色氨酸不溶解，但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后，滤去固体色氨酸。使用确定的色氨酸量作为标准通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM且莫纳甜浓度为5.81mM(1.05g)。
下列方法用于纯化终产物。90％的澄清溶液加到BioRad AG50W-X8树脂柱(225mL；结合力为1.7meq/mL)上。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流过部分的组分。然后柱用1M醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个300-mL部分。所有4个部分含有莫纳甜并用旋转蒸发器蒸发到105mL，蒸发器装有温水浴。随着体积减小形成沉淀且在蒸发过程中滤去。
通过LC/MS分析柱部分显示99％色氨酸和莫纳甜结合于柱。蒸发过程中形成的沉淀含有＞97％色氨酸和＜2％莫纳甜。上清中色氨酸与产物的比例约为2∶1。
上清(7ml)应用于100mLFast Flow DEAE琼脂糖(Amersham Biosciences)柱，柱预先用0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵，pH8.4和0.5L水洗转化成醋酸盐形式。上清以＜2mL/分钟上样，柱用3-4mL/分钟的水洗直到280nm的吸光度约为0。莫纳甜用100mM醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个100-mL部分。
部分的分析显示流过部分的色氨酸与莫纳甜比例为85∶15且洗脱部分的比例为7∶93。假定莫纳甜在280nm的消光系数与色氨酸相同，洗脱部分含有0.146毫摩尔产物。对于68％的回收，推断总共1L的反应会生成约2.4毫摩尔(约710mg)莫纳甜。
来自DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到＜20mL。通过用C8制备级反相柱进一步纯化等分产物，所用色谱条件与实施例10所述用于分析-规模莫纳甜特征的条件相同。Waters FractionlynxTM软件用于在检测m/z＝293离子基础上触发自动分部收集莫纳甜。收集来自莫纳甜的相应质子化分子离子的C8柱的部分，蒸发到干燥，随后溶于小体积水。此部分用于产物的表征。
所得产物用下列方法确定特征。
UV/可见光谱学.UV/可见光谱测量酶法生成的莫纳甜用Cary 100 Bio UV/可见光分光光度计完成。溶于水的纯化产物显示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析用于莫纳甜的混合物分析如实施例10所述完成，莫纳甜获得自体外生化反应。图5描述体外酶合成混合物中莫纳甜的典型LC/MS分析。图5的下面一组阐明莫纳甜的质子化分子离子在m/z＝293的所选离子色谱。混合物中的此莫纳甜鉴定通过图6所述质谱确证。LC/MS分析纯化产物显示293的分子离子单峰和280nm的吸光度。质谱与图6所示相同。
MS/MS分析.如实施例10所述，也对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。图7阐述莫纳甜的子离子质谱。对图7中标记的所有片段离子进行了实验性结构分配。这些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。如预料的，如果获得自分子的吲哚部分，许多这些情况与MP获得的(实施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所见高1个质量单位。
莫纳甜的精确质量测量.图8阐明使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪获得的纯化莫纳甜的质谱。使用色氨酸作为内部质量校准标准，质子化莫纳甜的测量质量是293.1144。在C14H17N2O5元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova 500MHz仪器上进行。莫纳甜样品(～3mg)溶于0.5ml D2O。溶剂(D2O)起初用作4.78ppm的内部参考。由于水的峰大，运行1H-NMR，同时抑制水峰。随后，由于水峰宽，莫纳甜的C-2质子用作参考峰，设在7.192ppm的发表值。
对于13C-NMR，几百次扫描的初始运行表明样品太稀释不能在规定时间获得适当13C谱。因此，进行异核多级量子相干(HMQC)实验，它能使其附着的氢和碳相关，也提供碳化学位移的信息。
表1和2显示1H和HMQC数据的概括。通过与发表值比较，NMR数据表明酶法生成的莫纳甜是(S，S)、(R，R)或两者的混合物。
手性LC/MS分析.为确定体外生成的莫纳甜是一种立体异构体而不是(R，R)和(S，S)对映异构体的混合物，用实施例10所述仪器完成手性LC/MS分析。
用Chirobiotic T(高级分离技术)手性色谱柱在室温进行手性LC分离。在供应商发表的方案基础上，对色氨酸的R-(D)和S-(L)立体异构体优化分离和检测。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脱在70％A和30％b为等度。流速为1.0mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫纳甜的仪器参数与实施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于莫纳甜的[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
图9显示R-和S-色氨酸和莫纳甜的色谱，它们由手性色谱分离并通过MS监控。莫纳甜色谱中的单峰表明该化合物是一种立体异构体，保留时间几乎与S-色氨酸相同。
表1
1H-NMR数据
1Vleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
表2
13C-NMR数据(来自HMQC谱)
Cargill Veleggaar等1 原子 δC δC 2 126.1 126.03 3 * 110.31 4 120.4 120.46 5 120.2 120.25 6 122.8 122.74 7 112.8 112.79
8 * 137.06 9 * 129.23 10a 36.4 36.53 12 39.5 39.31 13 54.9 54.89 14 * 175.30 15 * 181.18
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光性。莫纳甜制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液，S，S莫纳甜(盐形式)的预期比旋光([α]D20)是-49.6(Veleggaar等)。观察到纯化、酶法生成莫纳甜的[α]D20为-28.1，表明它是S，S异构体。
改进
优化包括试剂和酶浓度的反应条件，5-10mg/mL的产量用下列试剂混合物产生：50mM醋酸铵，pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(钠或铵盐)、5mM α-酮戊二酸(钠盐)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到1mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物；总蛋白浓度为167μg/mL)、1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物；总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应中未溶解)。混合物在30℃孵育4小时并温和搅拌或混合。
取代
α-酮戊二酸的浓度可减少到1mM并补充9mM天冬氨酸，莫纳甜的产量相等。另外的氨基酸受体可用于第1个步骤，如草酰乙酸。
当用重组硕大利什曼原虫广底物转氨酶取代大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时，获得类似的莫纳甜产量。然而，分子量为292的第2种未鉴定产物(主要产物的3-10％)也通过LC-MS分析检测。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿根瘤菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时，产生0.1-0.5mg/mL的莫纳甜浓度。当反应从吲哚-3-丙酮酸开始时，还原性胺化可用于最后步骤，此步有谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例7)。
来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根瘤菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用以酶法生成莫纳甜。使用下列反应条件：50mM NH4-OAc pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)、大约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应在30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌酶法生成的莫纳甜量为80ng/mL，随着醛缩酶量增加而提高。如果用饱和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫纳甜产量增加到360ng/mL。用50mMTris pH8.3中的3种30μg/mL KHG酶和饱和量的色氨酸重复反应，进行1小时以增加检测。如实施例4，杆菌酶活性最高，产生约4000ng/mL莫纳甜。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL莫纳甜，苜蓿根瘤菌酶产生2300ng/mL。
实施例7
MP和莫纳甜间的相互转化
MP的胺化以形成莫纳甜可通过如实施例1和6鉴定的转氨酶，或通过需要还原辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶催化。这些反应是可逆的且能以任何一个方向测量。当使用脱氢酶时，方向性主要通过铵盐的浓度控制。
脱氢酶活性.随着NAD(P)+转化成更发色的NAD(P)H，通过跟踪340nm吸光度增加来监控莫纳甜的氧化脱氨。如实施例6所述酶法生成和纯化莫纳甜。
典型的0.2mL测定混合物含有50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22单位的谷氨酸脱氢酶(Sigma)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器读数。将酶、缓冲液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暂混合后，以10秒间隔监控340nm的吸光度增加。反应在25℃孵育10分钟。不加入底物作为负对照，谷氨酸用作正对照。来自牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(Sigma#G-7882)催化莫纳甜转化为莫纳甜前体，转化率约为谷氨酰胺转化为α-酮戊二酸的百分之一。
转氨活性.用来自大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行莫纳甜转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。实验混合物含有(0.5mL中)50mM Tris-HCl，pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受体、5mM莫纳甜和25μg转氨酶。实验物在30℃孵育30分钟，通过加入0.5mL异丙醇终止反应。莫纳甜损失通过LC/MS监控(实施例10)。注意到以草酰乙酸作为氨基受体的硕大利什曼原虫BSAT活性量最高，接着是以α-酮戊二酸作为氨基受体的相同酶。草酰乙酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪IIa型＞猪I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪I型＞猪IIa型＞TyrB。
实施例8
从色氨酸和除了丙酮酸的C3来源生成莫纳甜
如上面实施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能转化成莫纳甜，使用丙酮酸作为C3分子。然而，在一些情况中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂贵，或如果加入培养基对发酵有不利影响。
丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。
色氨酸酶样酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。来自此类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸(如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸)产生氨和丙酮酸。
可通过根据Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)的方法使β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶突变，改进用EC 4.1.99.-多肽生成莫纳甜的方法。Mouratou等描述将β-酪氨酸酶转化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶没有报导在自然界中产生。通过使缬氨酸(V)283转化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来完成特异性变化。这些氨基酸变化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸的来源用于随后的醛醇缩合反应。
另外，能提供乳酸和将乳酸转化成丙酮酸的酶的细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。
反应混合物包括50mM Tris-Cl pH8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mMα-酮戊二酸、钠盐、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾pH7.5、25μg如实施例4制备的粗重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、500μg如实施例1制备的粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在整个反应中未溶解)。反应混合物在30℃混合孵育30分钟。提供丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源。用或不用能进行β-消除反应和β-裂合酶反应(色氨酸酶(TNA)的二级PLP酶(纯化的)、双突变体色氨酸酶、β-酪氨酸酶(TPL))进行测定。结果示于表3：
表3
用另外的C3-碳源产生莫纳甜
C3-碳源 另外的PLP酶 相对活性 无 无 0％ 丙酮酸 无 100％ 丝氨酸 无 3％ 丝氨酸 11μg野生型TNA(1U) 5.1％ 丝氨酸 80μg双突变体TNA 4.6％ 丙氨酸 无 32％ 丙氨酸 11ug野生型TNA 41.7％ 丙氨酸 80μg突变体TNA 43.9％ 天冬氨酸 110μg野生型TNA(1U) 7.7％ 天冬氨酸 5U野生型TPL(粗) 5.1％ 天冬氨酸 80μg突变体TNA 3.3％
从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的莫纳甜通过LC/MS/MS子扫描分析确认，与实施例6中产生的莫纳甜特征相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一，通过AspC酶转氨。产生的莫纳甜量通过加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作为二级活性转氨。通过加入色氨酸酶，用丝氨酸作为碳源产生的莫纳甜量几乎加倍，即使与转氨酶相比仅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些单独的β-消除活性的量。天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随着定点诱变增加，定点诱变与前面β-酪氨酸酶提示的相同。预期突变体β-酪氨酸酶具有产生莫纳甜的较高活性。
实施例9
化学合成莫纳甜
丙氨酸与吲哚-3-丙酮酸加成生成莫纳甜，此反应能用Grignard或有机锂试剂合成进行。
例如，镁在无水条件下加入3-氯-或3-溴-丙氨酸，3-氯或3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被适当封闭。随后加入吲哚-3-丙酮酸(适当封闭)以形成结合产物，接着去除保护基团以形成莫纳甜。特别有用的保护基团包括THP(四氢吡喃醚)，它易附着和去除。
实施例10
检测色氨酸莫纳甜和MP
该实施例描述的方法用于检测莫纳甜或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。
LC/MS分析
用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)仪器进行用于体外或体内生化反应获得的莫纳甜、MP和/或色氨酸的混合物分析，该仪器包括Waters 2690液相色谱，装有Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监控器，串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。用Supelco Discovery C18反相色谱柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色谱柱，2.1mm×250mm室温进行LC分离。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脱是从5％B到35％B线性，0-9分钟，从35％B到90％B线性，9-16分钟，在90％B等度，16-120分钟，从90％B到5％B线性，20-22分钟，运行间有10分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟，从200nm到4000nm监控PDA吸光度。所有ESI-MS参数是基于产生感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]+)、生成特征性片段离子基础上优化和选择的。
下列仪器参数用于莫纳甜的LC/MS分析：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；六角形(Hex)1：20V；孔径：0V；六角形(Hex)2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：15.0；高质量分辨率(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：50V；碰撞能量：2；出口：50V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。报导的质量/电荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01％。混合物中莫纳甜α-酮酸形式(MP)和莫纳甜的初始检测用LC/MS监控完成，收集m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于MP的[M+H]+＝292，用于莫纳甜的[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
MS/MS分析
如下对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于莫纳甜，m/z＝293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱的碰撞细胞，其中导入氩并使母离子化学解离成片段(子)离子。随后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子，它们可用于确证母离子结构分配。
下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1：20V；孔径：0V；Hex 2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：15.0；高质量分辨(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。
高通量测定莫纳甜和色氨酸
用上述仪器高通量分析(＜5分钟/样品)莫纳甜和色氨酸的混合物，莫纳甜和色氨酸来源于体外和体内反应，参数与LC/MS/MS所述相同。LC分离用4.6mm×50mmAdvanced Separation Technologies Chirobiotic T柱在室温进行。LC流动相为A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇。用50％B等度洗脱0-5分钟。流速为0.6mL/min。优化ESI-MS/MS系统的所有参数，并基于色氨酸和内标2H5-色氨酸的质子化分子离子的最佳来源产生、以及多反应监测(MRM)实验中碰撞诱导的氨基酸特异性片段离子的产生进行选择。下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜和色氨酸：毛细管：3.5kV；圆锥：20V；Hex 1：15V；孔径：1V；Hex 2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：40L/h；低质量分辨(Q1)：12.0；高质量分辨(Q1)：12.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：0.5；倍增器：650。MRM参数：信道间延迟：0.03s；中间扫描延迟：0.03s；停留：0.05s。
莫纳甜的精确质量测量
使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨MS分子。使用色氨酸作为内部质量校准标准，测量质子化莫纳甜的质量。在C14H17N2O5元素组成的基础上，质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。用实施例A描述的生物催化法制得的莫纳甜的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
实施例11
在细菌中产生莫纳甜
该实施例描述的方法用于在大肠杆菌细胞中产生莫纳甜。本领域技术人员理解类似方法可用于在其它细菌细胞中产生莫纳甜。此外，可使用含莫纳甜合成途径中其它基因(图2)的载体。
极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量(Zeman等，Folia Microbiol.35：200-4，1990)，此培养基如下制备。在700mL纳米纯水中加入下列试剂：2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO47H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O。pH调至7.0，体积增加到850mL，培养基高压灭菌。单独制备50％葡萄糖溶液并无菌过滤。在基础培养基(850mL)中加入40ml，终体积1L。
在0.1M磷酸钠pH7中制备10g/L L-色氨酸溶液并无菌过滤。通常加入十分之一体积到下面特定的培养物中。还制备了10％丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等分样品。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液，无菌过滤，使用前-20℃贮存。吐温20(聚氧乙烯20-单月桂酸山梨聚糖)以0.2/％(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用，通常为1-10μg/mL终浓度。
在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备大肠杆菌BL21(DE3)：睾丸酮丛毛单胞菌proA/pET30Xa/LIC的新鲜平板(实施例4中描述)。从单菌落中接种过夜培养物(5mL)且30℃在含卡那霉素的LB培养基上培养。通常，1到50个接种物用于trp-1+葡萄糖培养基中的诱导。加入新鲜抗生素到50mg/L的终浓度。诱导前，摇瓶在37℃生长。
每小时细胞取样，直到获得0.35-0.8的OD600。随后用0.1mM IPTG诱导细胞，温度降到34℃。诱导前(0时间点)收集样品(1ml)并5000x g离心。上清在-20℃冷冻用于LC/MS分析。诱导后4小时，收集另外的1mL样品，离心以从细胞沉淀中分离培养液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。
诱导后细胞生长48小时，另取1mL样品且如上制备。在48小时，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后)，3500rpm 4℃离心整个培养物体积20分钟。轻轻倒出上清，培养液和细胞都在-80℃冷冻。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例10所述监控[M+H]+＝293峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。数据也对于细胞生长标准化，这是通过绘出[M+H]+＝293峰的高度图，峰高除以培养物在600nm的光密度。
当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而不是诱导时加入时，产生较高水平的莫纳甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸盐或MgCl2不增加莫纳甜产量。当使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸时且当色氨酸在诱导后而不是接种或诱导时加入时，获得较高效价的莫纳甜。诱导前和诱导后4小时(底物加入时)，发酵液或细胞提取物中通常没有可检测水平的莫纳甜。负对照仅用有pET30a载体的细胞以及培养物进行，培养物中不加入色氨酸和丙酮酸。母体(parent)MS扫描证明(m+1)/z＝293的化合物不来源于较大分子，子扫描(如实施例10进行)类似于体外产生的莫纳甜。
用0、0.2％(体积/体积)和0.6％终浓度吐温-20研究吐温的效果。0.2％吐温摇瓶产生最高量的莫纳甜。氨苄青霉素浓度在0和10μg/mL间变化。在0-1μg/mL间细胞培养液中的莫纳甜量迅速增加(2.5倍)，当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时，莫纳甜量增加1.3倍。
显示典型结果的时程实验示于图10。甚至当值对于细胞生长标准化时，分泌到细胞培养液的莫纳甜量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数，培养液中的莫纳甜量估计小于10μg/mL。用不含proA插入的载体的细胞重复相同实验。许多数字为负，表明这些培养物中m/z＝293的峰高度小于单独培养基中的峰高度(图10)。当色氨酸和丙酮酸缺乏时，数字一致较低，证明莫纳甜生成是醛缩酶催化酶反应的结果。
在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复细菌细胞中的莫纳甜体内生成。通过阴离子交换层析和制备级反相液相色谱纯化250mL莫纳甜样品(在无细胞的培养液中)。蒸发此样品，用于高分辨质量分析(如实施例6所述)。高分辨MS表明生成的代谢物是莫纳甜。
体外测定说明转氨酶需要以高于醛缩酶的水平存在(参见实施例6)，因此来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶联合醛缩酶基因超量表达，以增加产生的莫纳甜量。设计引物以将睾丸酮丛毛单胞菌proA导入有aspC/pET30Xa/LIC的操纵子，引物如下：5’引物：ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO：67)和3’引物：CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQ ID NO：68)。5’引物包含BamHI位点，3’引物包含SalI位点，用于克隆。PCR如实施例4所述进行并凝胶纯化。aspC/pET30 Xa/LIC构建物用BamHI和SalI消化，PCR产物也如此。消化物用Qiagen自旋柱纯化。根据厂商说明用RocheRapid DNA连接试剂盒(Indianapolis，IN)将proA PCR产物连接到载体。用Novablues Singles(Novagen)进行化学转化，如实施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长且质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化。通过限制酶消化分析筛选克隆并由Seqwright(Houston，TX)确定序列。构建物亚克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。proA/pET30 Xa/LIC构建物也转化入BL21(DE3)pLysS。
在上述标准条件下初始比较BLR(DE3)摇瓶样品，证明加入第2个基因(aspC)使产生的莫纳甜量提高7倍。为加速生长，使用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。proA克隆和2个基因操纵子克隆在上面的Trp-1培养基中诱导，pLysS宿主也有加入培养基的氯霉素(34mg/L)。加入或不加入0.2％吐温-20和1mg/L氨苄青霉素，进行摇瓶实验。用体外生成的纯化莫纳甜作为标准计算培养液中的莫纳甜量。SRM分析如实施例10所述进行。在0、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时生长时细胞取样。
结果示于表4，显示培养液中生成的最大量。在大多数情况下，2个基因构建物产生的值高于单独proA构建物。细胞包膜更易渗漏的pLysS菌株分泌的莫纳甜水平较高，尽管这些菌株通常以较慢的速度生长。加入吐温和氨苄青霉素是有益的。
表4：
大肠杆菌产生的莫纳甜量
构建物 宿主 吐温+Amp μg/mL莫纳甜 时间 proA BL21(DE3) - 0.41 72小时 proA BL21(DE3) + 1.58 48小时 proA BL21(DE3)pLysS - 1.04 48小时 proA BL21(DE3)pLysS + 1.60 48小时
aspC：proA BL21(DE3) - 0.09 48小时 aspC：proA BL21(DE3) + 0.58 48小时 aspC：proA BL21(DE3)pLysS - 1.39 48小时 aspC：proA BL21(DE3)pLysS + 6.68 48小时
实施例12
酵母中莫纳甜的产生
该实施例描述用于在真核细胞中生成莫纳甜的方法。本领域技术人员理解类似方法可用于在任何感兴趣细胞中生成莫纳甜。此外，除了该实施例所述的那些基因，还可另外或额外使用其它基因(例如图2所列)。
pESC酵母抗原表位标记载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)用于克隆和表达大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC载体含有相反链上的GAL1和GAL10启动子，有2个不同多克隆位点，可同时表达2个基因。pESC-His载体也含有His3基因用于互补宿主(YPH500)中的组氨酸营养缺陷型。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖抑制且由半乳糖诱导；Kozak序列用于在酵母中最佳表达。pESC载体是穿梭载体，能在大肠杆菌中产生初始构建物(具有bla基因用于选择)；然而，多克隆位点中没有细菌核糖体结合部位。
设计下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位点加下划线，Kozak序列粗体显示)：aspC(BamHI/SalI)，GAL 1：5’CGCGGATCCTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO：69)和5’ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ IDNO：70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL 10：5’-CCGGAATTCTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：71)和5’GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO：72)。
由于导入Kozak序列，两种成熟蛋白的第2个密码子从芳族氨基酸变成缬氨酸。用来自实施例1和实施例4所述克隆的pET30 Xa/LIC miniprep DNA作为模板扩增感兴趣的基因。使用Eppendorf Master循环梯度热循环仪进行PCR，和下列用于50μL反应的方案：1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括94℃5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复：94℃ 30秒，50℃ 1分钟45秒，72℃ 2分钟15秒。29个重复后，样品在72℃维持10分钟，随后于4℃贮存。纯化PCR产物是通过在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离，接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His载体DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝胶纯化。用BamHI/SalI消化aspC PCR产物并用QIAquick PCR纯化柱纯化。用Roche迅速DNA连接试剂盒根据厂商的方案进行连接。根据厂商的说明，使用附加脉冲控制器的Biorad基因脉冲器II在0.2cm Biorad一次性小杯中将脱盐的连接物电穿孔入40μL ElectromasxDH10B感受态细胞(Invitrogen)中。在1mL SOC培养基中恢复1小时后，转化子平板培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用于克隆的质粒DNA制品用QIAprepSpin Miniprep试剂盒完成。质粒DNA通过限制酶切消化筛选，用设计用于载体的引物测序(Seqwright)以确认。
aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proA PCR产物也如此。DNA如上纯化和连接。2个基因构建物转化入DH10B细胞中并通过限制酶切消化和DNA测序筛选。
使用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)将构建物转化入酿酒酵母菌株YPH500。转化反应物铺在含2％葡萄糖的SC-His极限培养基(Invitrogen pYES2手册)上。通过菌落PCR用上面的PCR引物筛选单独酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀细胞(2μl)悬浮于20μL含1μl酶解酶的Y-裂解缓冲液(Zymo Research)并于37℃加热10分钟。随后4μL此悬浮液用于50μL PCR反应，使用上述PCR反应混合物和程序。
5mL培养物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生长过夜。逐步调整细胞在棉子糖上生长以便将半乳糖诱导前的延滞期减至最小。生长约12小时后，测量600nm的吸光度，旋下适当体积的细胞且重悬浮于新鲜SC-His培养基中产生0.4的OD。连续使用下列碳源：1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于诱导。
诱导培养基中生长约16小时后，50mL培养物分成双份25mL培养物，下列仅加入其中一份：(终浓度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸钠pH7.1、1g/L丙酮酸钠、1mMMgCl2。来自非诱导培养基和来自加入莫纳甜途径的底物之前16小时培养液和细胞沉淀的样品保存作为负对照。此外，仅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的构建物用作另一种负对照。细胞可在诱导后总共生长69小时。酵母细胞偶尔在较低OD诱导，仅在加入色氨酸和丙酮酸前生长4小时。然而，这些莫纳甜底物似乎抑制生长且在较高OD加入更有效。
来自培养物的细胞沉淀用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(湿重)细胞遵循厂商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制剂和benzonase核酸酶。过滤培养液和细胞提取物并通过SRM分析，如实施例10所述。使用此方法，培养液样品中没有检测到莫纳甜，表明细胞不能在这些条件下分泌莫纳甜。这些条件下的质子动力可能不足或一般的氨基酸转运子可用色氨酸饱和。蛋白表达水平不能用SDS-PAGE检测变化。
当色氨酸和丙酮酸加入培养基时，可在具有2个功能基因的培养物的细胞提取物中短暂检测到莫纳甜(约60μg/mL)。任何负对照细胞提取物中不能检测到莫纳甜。用4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)进行2次莫纳甜的体外测定，使用实施例6所述的优化实验。加入32μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mL AspC转氨酶进行其它实验，以确定哪个酶在细胞提取物中是限制性的。不加入酶或仅加入AspC转氨酶(没有酶时在某种程度上可发生醛醇缩合)作为负对照。正对照用部分纯化的酶(30-40％)进行，使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶。
SRM分析体外结果。细胞提取物分析显示当色氨酸在诱导后加入培养基时，它被有效转运入细胞中，使色氨酸水平比没有另外加入色氨酸的高2个数量级。体外莫纳甜的分析结果示于表5(数字表示ng/mL)。
表5：用酵母细胞提取物产生莫纳甜
aspC 构建物 +醛缩酶 +AspC 二基因 构建物 +醛缩酶 +AspC 抑制(葡萄糖培养基) 0 888.3 173.5 0 465.2 829 24小时诱导 0 2832.8 642.4 0 1375.6 9146.6 69小时诱导 0 4937.3 340.3 71.9 1652.8 23693.5 69小时+底物 0 556.9 659.1 21.9 755.6 16688.2 +对照(纯化酶) 21853 21853 -对照(无酶) 0 254.3 0 254.3
用加入或不加入底物的生长培养基的全二基因构建物细胞提取物获得阳性结果。这些结果与正对照相比，表明酶表达水平接近酵母中1％的总蛋白。当aspC构建物(截短的proA)的细胞提取物用醛缩酶测定时，产生的莫纳甜量显著大于单独细胞提取物测定，表明重组AspC转氨酶包含约1-2％酵母总蛋白。由于细胞中存在天然转氨酶，用醛缩酶测定时未诱导培养物的细胞提取物有小量活性。当用AspC转氨酶测定时，来自未诱导细胞的提取物活性增加到用AspC的负对照生成的莫纳甜量(大约200ng/ml)。相反，补充转氨酶时二基因构建物细胞提取物测定中观察到的活性增加大于加入醛缩酶时观察到的活性。由于2个基因都应以相同水平表达，表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时，产生的莫纳甜量最大，与实施例6所示结果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制细胞生长，而且也明显抑制蛋白表达。加入pESC-Trp质粒可用于纠正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型，是一种提供色氨酸而对生长、表达和分泌效果更少的方法。
实施例13
采用偶联反应改进酶方法
理论上，如果没有副反应或底物降解或产生中间体，从图1所述酶反应中形成的最大产物量直接与各反应的平衡常数、色氨酸和丙酮酸的浓度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸浓度似乎对产量有负作用(参见实施例6)。
理想地，莫纳甜浓度相对于底物最大化以降低分离成本。可进行物理分离，这样莫纳甜从反应混合物中取出，防止逆反应发生。原料和催化剂可随后再生。由于莫纳甜的大小、电荷和疏水性与一些试剂和中间体类似，物理分离困难，除非对莫纳甜的亲和性高(如亲和层析技术)。然而，莫纳甜反应可偶联其它反应，这样系统的平衡向莫纳甜生成移动。以下是改进莫纳甜产量的方法的例子，莫纳甜获得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
采用草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)的偶联反应
图11是反应的说明。色氨酸氧化酶和过氧化氢酶用于在吲哚-3-丙酮酸生成的方向驱动反应。过氧化氢酶过量使用，因而过氧化氢不能在逆方向中起作用或者损害酶或中间体。氧在过氧化氢酶反应期间再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供体，使用天冬氨酸转氨酶。理想地，与MP对莫纳甜反应相比，使用对色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反应特异性低的转氨酶，这样天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸。可加入草酰乙酸脱羧酶(来自假单胞菌属)以将草酰乙酸转化成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是挥发性的，它不能用于与酶反应，减少或防止逆反应。此步骤中产生的丙酮酸也能用于醛醇缩合反应。可使用其它脱羧酶，已知同系物存在于伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、几种博德特氏菌(Bordetella)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亚菌(Mannheimiahaemolytica)、鞭毛甲基杆菌KT(Methylobacillus flagellatus KT)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella Multocida)Pm70、微热石袍菌(Petrotoga miotherma)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、几种假单胞菌、几种火球菌(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、几种沙门氏菌(Salmonella)、几种链球菌(Streptococcus)、微温热着色菌(Thermochromatium tepidum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)和几种弧菌(Vibrio)。
用来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行色氨酸转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。比较用莫纳甜的活性(实施例7)相对用色氨酸的活性的比例，用于确定哪一个酶对莫纳甜转氨酶反应的特异性最高。这些结果表明莫纳甜反应相对于色氨酸反应特异性最高的酶是猪II-A型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特异性不取决于使用的氨基受体。因此，此酶用于具有草酰乙酸脱羧酶的偶联反应。
从吲哚-3-丙酮酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸钠、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和3单位/mL脱羧酶(SigmaO4878)。反应可在26℃进行1小时。在一些情况中，省略脱羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作为负对照)。也测试上述取代GOAT的转氨酶以证实早期特异性实验。过滤样品并通过LC/MS分析，如实施例10所述。结果证明GOAT酶法生成最高量的莫纳甜每mg蛋白，而产生最少量的色氨酸作为副产物。此外，加入脱羧酶可增加2-3倍。与其它转氨酶相比，大肠杆菌AspC酶也生成大量莫纳甜。
提高莫纳甜产量是通过：1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小时到1小时)，2)在厌氧环境中或用脱气缓冲液进行反应，3)允许反应过夜进行和4)使用没有多次冻融的新鲜制备的脱羧酶。丙酮酸浓度＞12mM会抑制脱羧酶。吲哚-3-丙酮酸浓度高于4mM时，与吲哚-3-丙酮酸的副反应加速。如果也增加醛缩酶量，用于反应的吲哚-3-丙酮酸量可增加。发现高水平的磷酸盐(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脱羧酶。在1小时反应中，加入的脱羧酶量能减少到0.5U/mL，而莫纳甜产量没有降低。当温度从26℃提高到30℃和从30℃提高到37℃时，产生的莫纳甜量增加；然而，37℃时吲哚-3-丙酮酸的副反应也加速。生成的莫纳甜量随着pH从7增加到7.3而增大，且从pH 7.3-7.8相对稳定。
从色氨酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸钠、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和4单位/mL脱羧酶、5-200mU/mL L-氨基酸氧化酶(Sigma A-2805)、168U/mL过氧化氢酶(Sigma C-3515)和0.008mg FAD。反应可在30℃进行30分钟。加入脱羧酶观察到改进。当使用50mU/mL氧化酶时，产生最大量的莫纳甜。改进类似于当吲哚-3-丙酮酸用作底物时观察到的。此外，当1)色氨酸水平低(即低于转氨酶的Km且因此不能与MP竞争活性位点)和2)氧化酶与醛缩酶和转氨酶的比例维持在不能积聚吲哚-3-丙酮酸的水平时，产生的莫纳甜量增加。
无论从吲哚-3-丙酮酸还是色氨酸起始，当使用2-4倍的所有酶量且同时维持相同酶比例时，孵育时间为1-2小时的实验中产生的莫纳甜量增加。使用任一底物，都达到约1mg/mL莫纳甜浓度。如果从吲哚-3-丙酮酸起始，产生的色氨酸量通常低于20％的产物量，显示出使用偶联反应的益处。随着中间体浓度和副反应的进一步最优化和控制，产率和产量能大幅提高。
采用赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)的偶联反应
在一些生物体中发现赖氨酸ε转氨酶(L-赖氨酸6-转氨酶)，包括红球菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)、黄杆菌、产朊假丝酵母(Candida utilis)和链霉菌。生物体利用此酶作为生成一些β-内酰胺抗生素中的和一步骤(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，7：95-100，1997)。此酶将赖氨酸转化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛赖氨酸)，这是通过PLP-介导的赖氨酸的C-6转氨，α-酮戊二酸用作氨基受体。ε-醛赖氨酸不稳定且自发经历分子内脱水以形成环状分子1-哌啶6-羧酸盐。这有效抑制任何逆反应发生。图12描述反应流程。也能使用另外的酶赖氨酸-丙酮酸6-转氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反应包含：50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸钾pH8、2-50mM丙酮酸钠、1.5mM MgCl2、50mM赖氨酸、100μg转氨酶(赖氨酸ε转氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。产生的莫纳甜量随着丙酮酸浓度增加而增加。用这些反应条件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脱羧酶(约0.1mg/mL)的偶联反应观察到的低10倍。
[M+H]+＝293的峰在莫纳甜预期时间洗脱且质谱包含一些用其它酶方法观察到的相同片段。第2个有正确质量与电荷比(293)洗脱的峰稍早于实施例6中生成的S，S莫纳甜通常观察到的，可能表明存在另一种莫纳甜的立体异构体。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能对丙酮酸有一些活性(产生丙氨酸作为副产物)。同样，已知酶不稳定。可通过定向进化实验进行改进以增加稳定性，减少与丙酮酸的活性并提高与MP的活性。这些反应也能与上述L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶偶联。
其它偶联反应
图13显示另一种能提高来自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫纳甜产量的偶联反应。甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脱氢酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脱氢酶在前面的例子中催化莫纳甜前体和莫纳甜间的相互转化，使用以铵为基础的缓冲液。甲酸铵和甲酸脱氢酶的存在是辅因子再生的有效系统，二氧化碳生成是降低逆反应速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalyslysis 10：37，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.63：4651-6，1997)。此外，大量甲酸铵能溶于反应缓冲液。加入甲酸脱氢酶和甲酸铵可改进谷氨酸脱氢酶反应(或类似的还原性胺化)生成的莫纳甜产量。
其它方法能用于驱动平衡趋向莫纳甜生成。例如，如果在用Ω-氨基酸转氨酶(EC2.6.1.18)(如美国专利5,360,724和5,300,437所述)使MP转化成莫纳甜中，使用氨丙烷用作氨基酸供体，所得产物之一将会是丙酮，它是比底物氨丙烷更易挥发的产物。可周期性短期提高温度以急骤蒸发丙酮，从而缓解平衡。丙酮的沸点为47℃，如果使用短时间段，此温度不可能降解中间体。大部分对α-酮戊二酸有活性的转氨酶也对莫纳甜前体有活性。类似地，如果乙醛酸/芳族酸转氨酶(EC 2.6.1.60)与作为氨基供体的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相对不稳定且沸点比甘氨酸低很多。
实施例14：剂量反应曲线
在pH 3.2的含有0.14％(w/v)柠檬酸和0.04％(w/v)柠檬酸钠的模型软饮料系统中制备15、30、45、60、75和90ppm莫纳甜溶液(约96％的2R，4R/2S，4S对应异构体对和4％的2R，4S/2S，4R对应异构体对的混合物-也称为莫纳甜的“外销旋混合物”)。用下述甜度估计方法测定莫纳甜相对于蔗糖的甜度。由一组(n＝6-8)受过训练具有甜度测定方法经验的小组成员重复进行所有评价。使所有样品的温度在20℃±1℃。
编码莫纳甜溶液，以随机顺序分给各小组成员。也提供范围在2.0-11.0％(w/v)蔗糖，相邻浓度的增加值为0.5％(w/v)蔗糖蔗糖的参比标准。要求小组成员通过比较测试溶液与蔗糖标准品的甜度来估计甜度。通过下述方法进行该测试：吸啜3小口测试溶液，然后吸啜一口水，然后吸啜3小口蔗糖标准品，然后吸啜一口水等。小组成员把甜度估计到一位小数位，如6.8、8.5。在评价测试溶液之间休息5分钟时间。也要求小组成员彻底地嗽口并食用饼干以降低任何可能的后遗作用。表6中小结了蔗糖等价值(SEV)和标准差。
经判断，所有混合物都具有迅速开始的甜味和建立到最大强度的甜度。甜度也迅速衰减。经判断，大部分混合物的果香不及蔗糖，除了莫纳甜/葡萄糖混合物。注意到有轻微的持续甜后味，非常轻微的苦味/金属味。没有发现甘草或冰凉后味。
表6
莫纳甜剂量反应数据
莫纳甜浓度(ppm) SEV(％；w/v) 标准差 15 3.6 ±0.7 30 4.9 ±0.5 45 7.1 ±0.6 60 8.5 ±0.5 75 9.8 ±0.5 90 10.5 ±0.6
实施例15：将莫纳甜与碳水化合物甜味剂混合
制备与10.0％(w/v)蔗糖等甜的莫纳甜(如实施例14所述)与蔗糖、HFCS(55％果糖)和葡萄糖糖浆(63右旋糖等价物，DE)的混合物。对于各碳水化合物甜味剂而言，调整莫纳甜：甜味剂比，使莫纳甜产生总甜度的25、50和75％。用实施例14中所述的甜度估计方法测定与10.0％(w/v)蔗糖相同的甜度。如实施例14所述，用6-8个小组成员在pH 3.2的模型软饮料系统中通过对各样品的重复辨味进行所有评价。结果见表7-9。莫纳甜与三氯蔗糖相比类似，莫纳甜的甜味开始有轻微延迟。
表7
莫纳甜和蔗糖的等甜混合物
莫纳甜的甜度贡献(％) 蔗糖浓度(％；w/v) 莫纳甜浓度(ppm) 莫纳甜的有效相对 甜味强度(x蔗糖) 25 7.5 12.3 2000 50 5.0 30.8 1600 75 2.5 50.3 1500
表8
莫纳甜和HFCS的等甜混合物
莫纳甜的甜度贡献(％) HFCS浓度(％；w/v固体) 莫纳甜浓度(ppm) 25 7.8 12.3
50 4.7 30.8 75 2.7 50.3
表9
莫纳甜和葡萄糖糖浆的等甜混合物
莫纳甜的甜度贡献(％) 葡萄糖糖浆浓度(％；w/v固体) 莫纳甜浓度(ppm) 25 16.4 12.3 50 10.4 30.8 75 5.4 50.3
然后，由一小组受过训练的评价者来评价等甜莫纳甜/碳水化合物(50∶50)混合物相对于蔗糖的质量。以“双盲法”进行此评价。将蔗糖增甜系统作为对照，随机编号所有其它产品。要求小组成员相对于对照评价随机编号的样品的以下性质：甜度特性：开始，建立和衰减；味道特性：酸、苦和其它特征；口感；以及后味。也要求小组成员为甜味剂系统的质量指定一个分数(1；差-5；优)。所作评论和所给分数的小结见表10。
表10
莫纳甜/碳水化合物混合物的味觉特性
甜味剂系统 甜味特性 味道特性 口感 后味 平均分数 蔗糖 迅速开始并 建立到峰值 甜度。衰减 快速而干 净。 愉快，柑橘 酸味。没有 检测到苦 味。 浓郁、糖浆 状和温暖。 轻微的持续 甜味，本质 上不令人恶 心。没有检 测到异味。 4.0 蔗糖/莫纳甜 迅速开始并 建立。本质 上总特性相 当平稳，衰 减相当快速 而干净。 果香和柑橘 味比蔗糖 少。可检测 到轻微苦 味。 糖浆状，但 比蔗糖稍 淡。 可检测到轻 微的持续甜 味。微苦微 酸。 3.4
HFCS/莫纳 甜 迅速开始并 建立到最大 强度。衰减 相当快速， 有一些持续 甜味。本质 上非常轻微 地令人恶 心。 果香和柑橘 味比蔗糖 少。可检测 到轻微的棉 花糖味。微 苦。 比蔗糖口感 淡。在甜味 消失时有些 干燥感。 可检测到轻 微的持续甜 味。察觉到 一些苦味/金 属味。相当 干燥、空洞 的后味。 2.9 葡萄糖糖浆/ 莫纳甜 迅速开始并 建立到最大 强度，稍慢 于蔗糖。衰 减快速而干 净。 非常类似于 蔗糖。 浓郁、糖状 和温暖。类 似于蔗糖。 可检测到轻 微甜味。 3.2
实施例16：莫纳甜在软饮料系统中的时间强度特性
在实施例14所述的pH 3.2模型软饮料系统中制备80ppm莫纳甜(实施例14所述的莫纳甜外消旋混合物)、10.0％(w/v)蔗糖和200ppm三氯蔗糖的溶液。然后用以下方法评价这些溶液的时间强度特性。该研究中包括六个小组成员。根据这些小组成员的总感觉敏度对他们进行筛选，并根据他们对甜味强度和甜味质量差异的敏感度进行选择。所有成员都有甜度评价方法的经验，并接受过时间强度评价的特殊训练。一开始先进行训练过程，使该小组熟悉用计算机化数据输入系统随时间评价样品和对样品打分的方法。
对各溶液样品(13mL)编号，以随机顺序分给各小组成员。对各小组成员，咽下后，计算机迅速以每秒0-100次，至高达60秒一次记录时间强度读数。重复评价各溶液。表11小结了时间强度特性的结果。
表11
时间强度研究结果
蔗糖 莫纳甜 三氯蔗糖 最大甜味强度(单位) 64.1 66.6 64.6 达到最大甜度的时间(秒) 8.0 9.0 8.0 达到最大甜度一半的时间(秒) 2.3 2.4 2.6
甜度下降到最大值一半的时间(秒) 24.9 34.2 33.1 开始速率(单位/秒) 17.9 14.9 16.0 下降速率(单位/秒) 2.3 2.2 2.1 曲线下面积(单位×秒) 116.9 117.3 119.7
这些结果说明了莫纳甜的时间味觉属性与蔗糖相当，这说明它是高质量的甜味剂。此外，相比而言莫纳甜比常用的高强度甜味剂三氯蔗糖更优。
实施例17：制备含有莫纳甜的可乐和柠檬/酸橙饮料
用以下配方制备可乐和柠檬/酸橙饮料，用蔗糖、HFCS(55％果糖)、阿斯巴特、三氯蔗糖、莫纳甜(实施例14所述的外消旋混合物)、莫纳甜/蔗糖或莫纳甜/HFCS增甜。将一份糖浆加入5.5份碳酸水中并评价。
柠檬/酸橙糖浆配方：
成分 ％重量/体积
柠檬酸 2.400
柠檬酸钠 0.500
苯甲酸钠 0.106
香料 0.450(柠檬/酸橙香料730301-H ex.Givaudan Roure)
甜味剂 见下
水至 100.000
可乐糖浆配方：
成分 ％重量/体积
磷酸 0.650(75％溶液)
柠檬酸 0.066
柠檬酸钠 0.300
苯甲酸钠 0.106
可乐香料A 1.100(A01161ex.Givaudan Roure)
可乐香料B 1.100(B01161ex.Givaudan Roure)
甜味剂 见下
水至 100.000
柠檬/酸橙或可乐碳酸水中甜味剂的浓度：
成分 ％重量/体积
蔗糖 10％
HFCS(55％果糖) 10％(固体)
阿斯巴特 500ppm
三氯蔗糖 200ppm
莫纳甜 67ppm(柠檬/酸橙碳酸水中)；80ppm(可乐碳酸水中)
莫纳甜/蔗糖 30.8ppm/5.0％
莫纳甜/HFCS 30.8ppm/5.0％(固体)
由一组受过训练的品尝者进行“双盲”评价。将蔗糖增甜产品作为对照，随机编号所有其它产品。要求小组成员相对于对照评价随机编号的样品的以下性质：
味道特性：酸
苦
其它特征
甜度特性：开始
建立
强度
衰减
口感
后味
也要求小组成员为甜味剂系统的质量指定一个分数(1；差-5；优)。分别对柠檬/酸橙碳酸水和可乐所作评论以及所给平均分的小结见表12和13。在柠檬/酸橙香料中，莫纳甜在味道上相当于阿斯巴特。莫纳甜/碳水化合物混合物的分数较高。可乐香料中，莫纳甜与阿斯巴特类似。
表12
柠檬/酸橙碳酸水的味觉特性
甜味剂系统 味道特性 甜味特性 口感 后味 平均分数 蔗糖 淡(无酒精)，平 衡的柠檬/酸橙 香味。稍缺乏清 凉味道。可检测 到的酸橙味比 柠檬味更多。 甜昧开始稍 有延迟，但 迅速建立到 峰值强度。 快速衰减。 温暖、相当浓 郁和糖浆状- 尤其是近味道 结束时。 微苦，有些涩 味。有些甜味但 不令人恶心或 持续。 4.8 HFCS 果香和辛辣味 道相当浓。比对 照稍酸。可检测 到的酸橙味比 柠檬味更多。 规则特性。 快速开始， 快速建立到 峰值强度， 快速衰减。 比对照稀，稍 有水样感觉。 微苦。不如对照 般干净。 3.6 阿斯巴特 稍缺乏前味。后 来性质上与对 照相当类似。 甜味开始得 相当快。总 峰相当平。 可检测到有 些后甜味。 比对照稍稀稍 冷。 相当干净但有 些持续甜味。可 检测到轻微的 “阿司匹林”样 味道。 4.0
三氯蔗糖 辛辣和提神的 香味。也可检测 到有些油味。 开始有延 迟，但建立 得相当快。 在喉咙背部 可检测到一 些甜味。 与对照口感类 似。 在后味中可检 测到轻微的甘 草味。也可检测 到一些苦昧。 4.1
表12续：柠檬/酸橙碳酸水的味觉特性
甜味剂系统 味道特性 甜味特性 口感 后味 平均分数 莫纳甜 比对照味道更 淡。味道浓度 较低和酸味较 少。 开始稍有延迟 -稍强于对 照。平稳的甜 度特性，而不 是建立峰值。 衰减稍慢于对 照。 比对照口感稍 差。但相当浓 郁和糖浆状。 相当干净，可 检测到稍微的 持续甜味。也 可检测到一些 苦味和金属 味。 4.0 莫纳甜/蔗糖 比对照味道更 明亮并更具果 香。辛辣的香 味。相当提神。 规则和圆滑特 性。快速开始、 建立和衰减。 浓郁和糖浆 状。比对照稍 冷。 后味干净。后 味中可检测到 一些香味和酸 味。本质上微 甜，但不太强 烈或令人恶 心。 5.0 莫纳甜/HFCS 比对照香味稍 淡。酸味稍少。 开始稍有延 迟。宽且圆滑 的峰。衰减速 率良好。 相当浓郁、糖 浆状和温暖。 比对照稍差。 微甜，但相当 干净。本质上 不令人恶心。 4.4
表13
可乐的味觉特性
甜味剂系统 味道特性 甜味特性 口感 后昧 平均分数 蔗糖 甜、完熟、温 暖的可乐味。 本质上相当 辣、柑橘味和 柠檬味。近味 道结束时稍 酸。 甜味开始有非 常轻微的延 迟，迅速建立 到圆滑峰。快 速衰减。 口感相当温 暖、浓郁和糖 浆状。 相当清洁和平 衡。微甜。微 苦，也检测到 有些香味和酸 味。 4.5
HFCS 甜、稍辣。比 对照味道稍 软、浓度稍低， 尤其是前味。 甜味开始稍有 延迟。甜度特 性更平稳。衰 减相当快。 相当浓郁但比 对照冷，比对 照稍稀。 可检测到有些 甜味，但本质 上不令人恶 心。微苦微酸。 3.3 阿斯巴特 甜味，比对照 前味更平稳。 可检测到褐色 /焦糖色和辣 味更少，但柠 檬味更多。 甜味开始延 迟。比对照建 立峰的速度稍 慢，有些持续 甜味。但总的 来说是相当圆 滑的峰。 口感比对照 稀，但仍然相 当温暖。 可检测到持续 甜昧，本质上 轻微地令人恶 心。比对照苦。 3.3 三氯蔗糖 甜味，比对照 前味褐色稍 深。然后近味 道结束时变得 更酸，柠檬味 更多。 甜味开始有些 延迟。比对照 建立速度稍 慢，似乎通过 特性建立。 比对照稍稀， 但仍然相当浓 郁和糖浆状。 在后味中可检 测到轻微一些 甜味。本质上 轻微地令人恶 心。可检测到 通过甜味携带 的香味。 3.8
表13续：可乐的味觉特性
甜味剂系统 味道特性 甜味特性 口感 后味 平均分数 莫纳甜 比对照稍平稳。 本质上更酸且 更具柑橘味。较 不温暖，焦糖色 较少。 开始延迟，但建 立得相当快。总 的来说，性质比 对照平稳。比对 照衰减慢，可检 测到一些持续甜 味。 比对照稀。前味 稍冷且水样感 觉较多。 可检测到一些 持续甜味-本 质上令人恶心。 也可检测到一 些苦味。 2.9 莫纳甜/蔗糖 比对照的可乐 味少。较平稳， 辣昧较少。本质 上柑橘味/柠檬 味较多，尤其是 近味道结束时。 开始的延迟非常 轻微。建立得相 当快。相对快速 地衰减，没有持 续甜味。特性较 平稳，而不是建 立峰。 比对照稍冷。相 当浓郁和糖浆 状。 比对照稍苦。稍 甜但香味较淡。 3.0 莫纳甜 /HFCS 前味浓郁、温 暖、辣。味道结 束时稍空洞，比 对照的柑橘昧/ 柠檬味更多。 迅速开始，相当 快速地建立到峰 值甜度。衰减稍 慢。可检测到一 些持续甜味。 比对照稍淡。 可检测到一些 甜味。本质上稍 令人恶心。也可 检测到一些香 味、苦味和酸 味。 3.3
讨论
用于本实施例的莫纳甜具有清洁的甜味特性，基本无天然高强度甜味剂中常见的苦味、冷味和甘草味。用于本实施例莫纳甜立体异构体产生平滑、规则的剂量反应曲线，其相对甜味强度比10.0％(w/v)SEV的蔗糖甜1250倍。
时间强度研究的结果显示，莫纳甜具有的时间/甜味强度特性很宽，类似于蔗糖和三氯蔗糖。与蔗糖相比，莫纳甜需要稍长时间来达到最大强度，且衰减速率较慢，评价(60秒)结束时达到较高甜度。然而，所观察到的差异不是统计显著的。
当与碳水化合物甜味剂混合时，莫纳甜产生的甜味强度是蔗糖的1500-2000倍。所得混合物的甜味和香味特性的质量非常优良。观察到甜味开始几乎没有延迟，且仅可检测到低水平的持续甜味。可采用莫纳甜和碳水化合物甜味剂的混合物，例如，以制备中等热量的饮料。
所评价的莫纳甜作为单独的甜味剂和与碳水化合物混合时，性能良好。在柠檬/酸橙碳酸水中，仅用莫纳甜增甜的产品的味觉特性与阿斯巴特和三氯蔗糖增甜的饮料非常相似。莫纳甜/蔗糖饮料尤其优良，实际上通过判断比蔗糖对照产品更可接受。预计莫纳甜与其它碳水化合物甜味剂混合后将增强柠檬/酸橙香味。在可乐体系中，将莫纳甜与HFCS混合产生的饮料与HFCS对照一样可以接受。
实施例18：莫纳甜的水溶液的感觉稳定性
在室温下储存0-6小时后研究莫纳甜(如实施例14所述的外消旋混合物)的水溶液(8％SEV)的感觉稳定性。制备莫纳甜溶液0-1小时后或5-6小时后监测SEV(如实施例14所述)。室温下6小时后，没有检测到莫纳甜SEV下降；用LC/MS进行的分析研究证实了这些数据(如没有观察到内酯化)。
实施例19：制备加麦芽饮料预混合物
用表14中所列成分制备加麦芽饮料预混合物。
表14
成分 ％(重量) 麦芽提取物 31-35 脱脂奶粉 10-12 可可 5-10 莫纳甜 0.001-0.46 脂肪 8-9 矿物质和维生素 0.5-1
稀释剂 按需要定
实施例20：制备巧克力味的饮料预混合物
用表15中所列成分制备巧克力味的饮料预混合物。无奶奶油可包括植物油、增稠剂、卵磷脂、蛋白质、维生素、矿物质、乳化剂(如卵磷脂、DATEM和甘油单酯和甘油二酯)和填充剂(如玉米糖浆固体、低热量填充剂)。
表15
成分 ％(重量) 可可粉 3-13 焦糖粉 3-5 麦芽提取物 10-20 莫纳甜 0.015-1 味道增强剂/盐 0.25-1 无奶奶油 10-32 稀释剂 按需要定
实施例21：制备橙味饮料预混合物
用表16中所列成分制备橙味饮料预混合物。
表16
成分 ％(重量) 乳清蛋白浓缩物 60-70 果糖 20-25 干甜乳清 8-10 无水柠檬酸 3-7 橙香料 0.5-1
微生物/矿物质预混合物 0.10-0.15 莫纳甜 S，S 0.06-0.35 R，R 0.006-0.1 或混合物 人工色素 0.006-0.010
可通过将约1盎司干混合物溶于8盎司水，然后搅拌或振荡直到充分水合来制备橙味饮料。因此，最终的即饮型饮料约含有66-440ppm的S，S莫纳甜，6-13ppm的R，R或其混合物。
实施例22：用莫纳甜甜味剂制备柠檬水
人们可制备含有莫纳甜的甜味剂的方便的单用途小包装，其中配制甜味剂，使其提供的甜度相当于2茶匙(～8克)砂糖。因为S，S比蔗糖甜50-200倍，40-160毫克S，S莫纳甜产生的甜度相当于8克砂糖。因此，例如，考虑到+/-25％甜度优化，单用途小包装中1克莫纳甜配方约可含有40-200毫克S，S莫纳甜。
同样，因为R，R比蔗糖甜2000-2400倍，3.3-4.0毫克R，R莫纳甜产生的甜度相当于8克砂糖。因此，在另一实施方式中，考虑到+/-25％甜度优化，单用途小包装中1克莫纳甜配方约可含有3.3-5.0毫克R，R莫纳甜。在另一实施方式中，在每克总重中量相同或较少的情况下，小包装配方可含有40-200毫克S，S莫纳甜、3.3-5.0毫克R，R莫纳甜或其组合f，以提供与2茶匙砂糖相当的甜度。
为制作柠檬水，在高玻璃杯中将2大汤匙的柠檬汁和3包(3克)莫纳甜小包装配方与3/4杯水混合，直到溶解。加入冰。莫纳甜增甜的柠檬水与用6茶匙(24克)蔗糖增甜的柠檬水甜度几乎相等并且同等优选，而且它的热量显著较低(约0卡路里与96卡路里)。
实施例23：在咖啡和冰茶中评价含有R，R莫纳甜的甜味剂。
在咖啡和冰茶中，相对于其它已知甜味剂(阿斯巴特和三氯蔗糖)来评价莫纳甜甜味剂配方，它含有R，R莫纳甜或R，R莫纳甜/赤藓醇组合。评价的关键感受参数包括甜味质量、后味、苦味及其后味。进行定性评价。
产品配方
(i)咖啡
使用标准咖啡来评价甜味剂性能(表17)。
表17.咖啡配方
按照以下浓度在咖啡中加入甜味剂：
阿斯巴特 0.025％(w/v)
三氯蔗糖 0.0082％(w/v)
R，R莫纳甜 0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克麦芽糊精
R，R莫纳甜/赤藓醇 0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克赤藓醇
(ii)冰茶
用冰茶制品来评价甜味剂性能(表18)。
表18.冰茶配方
成分 供应商 浓度(w/v)柠檬酸 0.200柠檬酸钠 0.020茶叶提取物′Assam′285002 Plantextrakt 0.150天然红茶香料提取物31108304010000 Rudolph Wild 0.050硼酸钠(20％w/w) 0.075甜味剂 按需水 加至所需体积
按照以下浓度在咖啡中加入甜味剂：
阿斯巴特 0.0450％(w/v)
三氯蔗糖 0.0170％(w/v)
R，R莫纳甜* 0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克麦芽糊精
R，R莫纳甜/赤藓醇 0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克赤藓醇
感觉评价
采用一小组(n＝6)有经验的感觉鉴定员来评价这些咖啡和茶饮品，这些鉴定员将先品尝咖啡产品然后再品尝茶产品。这些评定的结果总结在表19中。
表19.咖啡和茶的感觉评价(每份200ml)
产品 甜味剂/浓度 评论 咖啡 阿斯巴特/250ppm 平衡的甜味表现。苦味水平非常低，大概是由于APM的抑 制作用。平稳均匀地输送咖啡的味道。舌头背部有典型的 APM后味。
三氯蔗糖/82ppm 缓慢产生甜味使得咖啡味显著。后味中咖啡的苦味非常明 显，但不管怎样三氯蔗糖延迟的甜味表现平衡了这种味道。 莫纳甜(25ppm)+麦 芽糊精(1克)(0.5％) 平衡的甜度表现。后味中有清晰的咖啡味道。比任何一种其 它甜味剂都有更加强烈的咖啡味道，尽管这可能(至少部分) 由于莫纳甜有限的苦味抑制能力。 莫纳甜(25ppm)+赤 藓醇(1克)(0.5％) 在莫纳甜样品中咖啡味更加明显。相比莫纳甜/麦芽糊精， 莫纳甜/赤藓醇混合物延迟甜味产生的时间较短。赤藓醇使 咖啡风味平稳并能稍快产生甜味。 冰茶 阿斯巴特/450ppm 良好的暂时特性，尽管阿斯巴特的典型味道非常明显。平衡 的，但茶味淡。无证据显示味道增强。 三氯蔗糖/170ppm 甜味出现延迟，第一感觉是酸味。但产品的味道和总体感觉 不平衡的，这是因为甜味表现与酸度或香味表现不匹配。 莫纳甜(40ppm)+麦 芽糊精(1克)(0.5％) 甜味和香味表现非常平衡。相比其它甜味剂柠檬香味显著增 强。 莫纳甜(40ppm)+赤 藓醇(1克)(0.5％) 甜味和香味表现平衡。柠檬香味比单独使用莫纳甜/麦芽糊 精更强。后味的收敛大大降低/消除。
讨论
莫纳甜能给甜味剂制品带来意想不到的好处，其中包括明显的感官益处。当把莫纳甜加入咖啡时，感觉到咖啡的香味水平明显提高。加入低浓度赤藓醇进一步增强了这种益处，赤藓醇能够平衡并缓和香味同时缩短甜味开始的时间。在冰茶尤其是酸化的茶中，莫纳甜增强了柠檬的香味。同时，将赤藓醇与莫纳甜混合能带来其它的香味益处。
在通常消费的饮料如茶和咖啡中，莫纳甜具有改进的感觉特性(例如较少的后味、较少的怪味、没有味道遮蔽作用)。莫纳甜增甜的咖啡含有的热量接近于0卡路里，相比之下用2茶匙(～8克)蔗糖增甜的咖啡中含有32卡路里的热量。
预计与阿斯巴特或三氯蔗糖相比，莫纳甜在饮料组合物中能增强所有柑橘味，以及使甜度的时间/强度特性更适宜。还预计与阿斯巴特或三氯蔗糖相比，莫纳甜和赤藓醇的混合物在饮料组合物中能够进一步增强柑橘味，并使甜度特性更适宜。预计莫纳甜和赤藓醇在维持于低温的任何饮料组合物，如软饮料、碳酸饮料、糖浆、干饮料混合物和糖浆饮料中都具有这些益处。
实施例24：在饮料中评价R，R莫纳甜
配制饮料(可乐、柠檬-酸橙和橙饮料)，用阿斯巴特、三氯蔗糖或R，R莫纳甜增甜。进行定性评价。
产品配方
表20中列出了开发和评价的软饮料配方。术语“投”指溶于水。例如，投“1+4”指将1份浓缩物配制在4份水中。因此，如果浓缩液配方中包括0.021％重量/体积(即210ppm)的R，R莫纳甜，例如，投1+4使稀释的饮料含有42ppm(210ppm/5)R，R莫纳甜。
表20软饮料配方(浓缩物)
香料 成分 浓度(％；w/v) 柠檬/酸橙 L/L香料：76291-76 0.55 柠檬酸 0.80 柠檬酸钠 0.10 苯甲酸钠(20％溶液) 0.38 甜味剂 (i)阿斯巴特0.250 (ii)三氯蔗糖0.100 (iii)R，R莫纳甜0.021 水 至体积 投 1+4 橙汁 橙汁浓缩物(6×) 5.420 柠檬酸 2.600 柠檬酸钠 0.520 橙味香料2SX-73268 0.650 β-胡萝卜素0F0996 0.100 苯甲酸钠(20％溶液) 0.488 甜味剂 (i)阿斯巴特0.3575 (ii)三氯蔗糖0.1430 (iii)R，R莫纳甜0.0293 水 至体积
投 1+5.5 可乐 可乐香料C40385 0.7150 可乐香料C40386 0.7150 苯甲酸钠(20％溶液) 0.3750 甜味剂 (i)阿斯巴特0.275 (ii)三氯蔗糖0.110 (iii)R，R莫纳甜0.0225 水 至体积 投 1+4
最终即饮型饮料(投后)所含的甜味剂浓度如下：
柠檬/酸橙 阿斯巴特 500ppm
三氯蔗糖 200ppm
R，R莫纳甜 42ppm
橙汁 阿斯巴特 550ppm
三氯蔗糖 220ppm
R，R莫纳甜 45ppm
可乐 阿斯巴特 550ppm
三氯蔗糖 220ppm
R，R莫纳甜 45ppm
饮料的感觉评价
由一组(n＝6)评价者对这些软饮料进行评价，他们通过单独品尝来评价各组饮料。评价结果小结在表21中。
表21.软饮料的感觉评价
产品 甜味剂/浓度 评论 柠檬/酸橙 阿斯巴特/500ppm 平衡的甜味/酸味表现。苦味水平非常低。愉快的果 香味。舌头背部有典型的APM后味。 三氯蔗糖/200ppm 缓慢产生甜味使前味中的柠檬/酸橙味更强。强烈的 持续甜味、令人厌恶的后味打断了味道，没有留下 愉快的果香后味。
莫纳甜/42ppm 平衡的甜味/酸味表现，但感受到的柠檬/酸橙味道 的前味水平较低。 橙汁 阿斯巴特/550ppm 良好的时间特性，尽管阿斯巴特的典型味道非常明 显。无证据显示味道增强。 三氯蔗糖/220ppm 甜味开始延迟，意味着第一印象是酸味。产品的味 道和总体感觉有些不平衡，这是因为甜味表现与酸 味或香味表现不匹配。 莫纳甜/45ppm 良好的时间特性，尽管阿斯巴特的典型后味明显。 无证据显示强烈的味道增强。总的来说，定性判断 它与阿斯巴特非常相似。 可乐 阿斯巴特/550ppm 良好的时间特性，尽管阿斯巴特的典型味道非常明 显。良好的甜味/酸味平衡。 三氯蔗糖/220ppm 甜味开始延迟，意味着第一印象是酸味。产品的味 道和总体感觉有些不平衡，这是因为甜味表现与酸 味或香味表现不匹配。 莫纳甜/45ppm 总的来说，定性判断它与阿斯巴特相当相似。莫纳 甜的开始似乎有些轻微延迟，这使得产品有些不平 衡。无证据显示强烈的味道增强。
讨论
在柠檬/酸橙、橙汁和可乐饮料中，莫纳甜产生了质量上类似于阿斯巴特并稍优于三氯蔗糖的甜味，这两种物质都是高质量甜味剂。在柠檬/酸橙饮料中，莫纳甜配方比阿斯巴特配方的后味少。而且，R，R莫纳甜的效能比阿斯巴特和三氯蔗糖强。
实施例25：莫纳甜和糖精的甜度剂量反应曲线
用20个受过训练的感觉评价者来评价莫纳甜和糖精的甜度，判断重复2次。在pH 3.2的柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液中制备测试和参比溶液。参见图16。与糖精相比，R，R/S，S莫纳甜的线性反应更好，这与产生更类似于糖的味觉特征相一致。10％SEV以上的平台说明缺少异味和后味的“混合抑制”/其水平低。莫纳甜的剂量反应曲线形状与阿斯巴特、三氯蔗糖和阿力甜相似，他们都是“质量”甜味剂。
在模型系统(pH 3.2)中用R，R/S，S莫纳甜作为单独甜味剂，观察到以下特征：(1)甜昧开始有轻微延迟；(2)甜味衰退相当迅速；(3)轻微的“阿斯巴特样”后味，轻微的甜后味，后味中没有苦味；和(4)在未调味的系统中残留有冰凉感觉。
实施例26：莫纳甜随温度增加在pH 3时的稳定性
将合成的莫纳甜样品置于pH 3，25℃、50℃和100℃的环境下。室温pH 3时，观察到48小时内损失14％莫纳甜。这种损失是由于形成内酯。50℃pH 3时，48小时内损失23％莫纳甜。这种损失是由于形成内酯并在约15.5分钟后有未知化合物聚集。100℃ pH 3时，24小时内几乎所有莫纳甜都损失了。主要的可检测成分是15.5分钟时出现的未知物质。
实施例27：40℃ pH 2.5、3.0、4.0时莫纳甜和阿斯巴特的感觉稳定性
监测在pH 2.5、3.0和4.0制备并储藏于40℃的莫纳甜溶液100天内的感觉稳定性。将这些溶液损失的甜味与在相同条件下制造并储存的阿斯巴特溶液损失的甜味进行比较。
在40℃储存之后测量莫纳甜(8％SEV，约55ppm，含有约96％2R，4R/2S，4S对映体对和4％2R，4S/2S，4R对映体对的合成混合物)在pH值为2.5、3.0和4.0的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液中的稳定性。比较莫纳甜和相同缓冲液中阿斯巴特(400ppm)的稳定性。用与莫纳甜和阿斯巴特溶液相同的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液制备三种蔗糖参考溶液。所有制备的溶液避光储存。
缓冲液组成：pH2.5 磷酸(75％溶液)0.127％(w/v)
一水合柠檬酸三钠0.005％(w/v)
pH3.0 磷酸(75％溶液)0.092％(w/v)
一水合柠檬酸三钠0.031％(w/v)
pH4.0 磷酸(75％溶液)0.071％(w/v)
一水合柠檬酸三钠0.047％(w/v)
通过一小组(n＝8)经过训练的熟悉甜味评定过程的感觉鉴定员来评估每种甜味剂相对蔗糖的甜度，该过程一式两份进行。所有样品(用同样的缓冲液配制)在22℃±1℃下一式两份。莫纳甜(测试)溶液用3个随机数字编号，并分别随机给予鉴定员。还提供了以0.5％(w/v)蔗糖递增的蔗糖参考标准(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鉴定员通过比较测试溶液和蔗糖标准的甜度来评价甜度。评定时吸啜3口测试溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖标准，然后在吸啜1口水，依此类推。鉴定员用1位小数评价甜度，例如6.8、8.5。在评价测试溶液之间休息5分钟。要求鉴定员彻底漱口并食用一些饼干以降低任何可能的附带结果。
表22和23显示了在磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中进行的稳定性研究的结果。在每个pH下40℃避光储存100天后，莫纳甜甜度的残留百分比大于阿斯巴特的残留百分比。在pH 4.0时，莫纳甜溶液甜味的损失几乎稳定，因为在第17-100天测得的甜度变化很小，而阿斯巴特溶液的甜味却继续损失。
表22
莫纳甜的感觉稳定性：40℃储存100天后的甜度
A.
pH 时间(天) 莫纳甜SEV (％蔗糖) 莫纳甜甜味 的保留(％) 阿斯巴特 SEV(％蔗糖) 阿斯巴特甜 味的保留(％) 2.5 0 7.35 7.34 1 6.86 93.3 6.90 94.0
2 6.70 91.2 6.80 92.6 3 6.50 88.4 6.60 89.9 4 6.26 85.2 6.29 85.7 7 6.08 82.7 6.01 81.9 8 5.98 81.4 5.98 81.5 9 5.89 80.1 5.97 81.3 11 5.78 78.6 5.86 79.8 50 4.61 62.7 4.19 57.1 100 2.10 28.6 0.80 10.9
B.
pH 时间(天) 莫纳甜SEV (％蔗糖) 莫纳甜甜味 的保留(％) 阿斯巴特 SEV(％蔗糖) 阿斯巴特甜 味的保留(％) 3.0 0 7.08 7.15 1 7.05 99.6 6.90 96.5 2 6.60 93.2 6.87 96.1 3 6.47 91.4 6.60 92.3 4 6.49 91.6 6.43 89.9 7 6.04 85.3 6.17 86.3 8 5.93 83.8 5.93 82.9 9 5.88 83.1 5.94 83.1 11 5.88 83.1 5.83 81.5 50 5.12 72.3 4.71 65.9 100 4.10 57.9 2.20 30.8
C.
pH 时间(天) 莫纳甜SEV (％蔗糖) 莫纳甜甜味 的保留(％) 阿斯巴特 SEV(％蔗糖) 阿斯巴特甜 味的保留(％) 4.0 0 7.40 7.10 3 7.08 95.7 6.75 95.1 8 6.42 86.8 6.23 87.8 11 6.36 85.9 6.02 84.8 17 6.10 82.4 5.75 81.0 24 6.25 84.5 5.85 82.4 50 6.14 82.9 5.29 74.5 100 5.80 78.4 4.10 57.7
表23
稳定性：在规定pH于40℃储存100天后剩余甜度的量
pH 甜味剂 剩余甜度(％) 2.5 阿斯巴特 11 2.5 莫纳甜 29 3.0 阿斯巴特 31 3.0 莫纳甜 58 4.0 阿斯巴特 58 4.0 莫纳甜 78
如表24所见，各种缓冲液可有效维持pH。
表24
甜味剂 标定pH 实际pH(50天后) 莫纳甜 2.5 2.39 3.0 3.13 4.0 4.28 阿斯巴特 2.5 2.49 3.0 3.13 4.0 4.19
如果假设有伪第一顺序中断反应，用logn保留百分比对时间作图(logn％RTN v.t)以估算任何给定条件下甜度损失的半衰期(t1/2)和速度常数(k)。如此便可得出如下表25总结的莫纳甜和阿斯巴特甜度损失动力学。
表25
甜味剂 PH半衰期(t1/2；天) 速度常数(k；天-1) 莫纳甜 2.5 65天 0.011天-1 3.0 115天 0.006天-1 4.0 230天 0.003天-1 阿斯巴特 2.5 55天 0.013天-1 3.0 75天 0.009天-1 4.0 140天 0.005天-1
每个pH于40℃储存100天后，莫纳甜甜度的保留百分比大于阿斯巴特的保留百分比。在pH 4.0时，莫纳甜溶液甜味的损失几乎稳定，因为在第17-100天测得的甜度变化很小，而阿斯巴特溶液的甜味却继续损失。
莫纳甜和阿斯巴特估计的半衰期说明，莫纳甜的甜度损失速度低于阿斯巴特。在pH 2.5、3.0和4.0时估算的莫纳甜甜度的半衰期分别为65天、115天和230天。相同条件下估算的阿斯巴特的半衰期为55天、75天和140天。
因此，在酸性条件并于40℃储存的条件下，莫纳甜可比阿斯巴特产生的甜味更加稳定。在具有低pH的可乐和其它饮料以及高温中莫纳甜的稳定性优于阿斯巴特。因为莫纳甜的稳定性优于阿斯巴特，并达到平衡，在pH 3时不会不可逆地分解，所以预计莫纳甜能够在低pH饮料，如可乐饮料中提供长期稳定的甜味。
还发现(数据未显示)，当暴露于紫外光(UV)时，莫纳甜在pH3的磷酸/柠檬酸盐缓冲液(环境温度)中的稳定性类似于或稍高于阿斯巴特。某种味道系统可加速UV不稳定性。UV吸收性包装材料、着色剂和/或抗氧化剂可保护含莫纳甜的饮料防止其中发生UV光诱导的香料相互作用。
实施例28：莫纳甜立体异构体的层析
样品制备-在微离心管中放入约50-75μg冻干物质。在其中加入1.0mL HPLC级甲醇。将溶液涡漩搅拌30分钟，离心并取出等分量上清进行分析。
反相HPLC-用2.1×250mm XterraTM MS C8 5μm(Waters Corporation)HPLC柱进行层析获得两个分离的非对映体峰(R，R/S，S和R，S/S，R)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相进行以下梯度：
时间(分钟) 0 9 16 20 21
0.05％TFA A％ 95 65 10 10 95
甲醇，0.05％TFA B％ 5 35 90 90 5
流速mL/min 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
手性HPLC-用250×4.6mm Chirobiotic T(Advanced Separations Technologies，Inc.)HPLC柱进行层析获得两个清楚的莫纳甜立体异构体(R，R和S，S)。用Micromass的UltimaTM三重四极质谱仪进行检测。流动相由甲醇和0.2％乙酸以及0.05％氨水构成。
质谱(MS/MS)-通过选择反应监控(SRM，Selected Reaction Monitoring)实验检测莫纳甜的存在。莫纳甜的质子化分子离子([M+H]+)的m/z＝293.3。断裂该分子离子产生m/z＝257.3的显著离子，这是将分子离子多次脱水得到的。这种跃迁是莫纳甜特有的，并选择(293.3至257.3)在SRM实验过程中作为跃迁加以监测。这种检测方法可用于莫纳甜的反相和手性分离。
结果-用反相HPLC评价R，S/S，R和S，S/R，R标准样品。通过衍生和酶法拆分制备样品。标准溶液的色谱图示于图17。反相分析之后进行手性层析以评估样品内存在的特定异构体。标准S，S和R，R莫纳甜溶液的手性层析示于图18。
实施例29：莫纳甜在高温(80℃)和中性pH下的稳定性
使用pH7下的100毫升75ppm的莫纳甜溶液作为原料溶液。所述合成的莫纳甜样品包含约96％的2R，4R/2S，4S对映体对和4％的2R，4S/2S，4R对映体对。在整个试验过程中，将所述样品保温在80℃和pH7的条件下，在0、1、2、3、4小时和1、2、4、7、14、21和35天时抽取样品。所有试验条件均一式两份进行。
使用LC-MS并使用反相色谱法进行分离和定量-建立合成莫纳甜的两个检测到的非对映体峰的响应曲线。用溶解在去离子水中的合成莫纳甜标准物纳入(bracketed)5-150ppm的范围。使用3.9×150mm的Novapak C18(Waters Corporation)HPLC柱来完成两个非对映体峰的分离。串联使用紫外-可见(UV)和质谱仪(MS)来进行检测和定量。莫纳甜及其内酯的峰各自在279nm处具有Uvmax，这有助于精确检测。通过正离子电喷模式获得293.3m/z和275.3m/z的选择性离子监控(SIM)扫描来进行定量。
结果-在中性pH下，即使在7-35天之后，莫纳甜的降解程度也不明显。莫纳甜随时间变化而消失的程度取决于pH，这是因为所述主要副产物是环化以及可能出现的很少量的外消旋作用。在80℃和pH7的实验过程中，在使用LC-MS进行定量检测所达到的精确度范围内没有检测到外消旋RR/SS莫纳甜或其内酯的浓度出现变化。
由于莫纳甜在中性pH时的耐热性，预计莫纳甜的稳定性适用于中性pH饮料(如乳制品或粉末化的饮料组合物)。也预计与其它高强度甜味剂(如阿斯巴特)相比，莫纳甜在这些饮料组合物中的保存限期更长。此外，预计莫纳甜在处理条件，如加热填充过程中更稳定。
实施例30：其它软饮料配方(浓缩物)
配方A：
成分 浓度(％；重量/体积) 可乐香料C40385 0.7150 可乐香料C40386 0.7150 苯甲酸钠(20％溶液) 0.3750 S，S莫纳甜 0.99 水 至体积
投1+4。该稀释的即饮型饮料含有1980ppm S，S莫纳甜。
配方B：
成分 浓度(％；重量/体积) 可乐香料C40385 0.7150 可乐香料C40386 0.7150 苯甲酸钠(20％溶液) 0.3750 莫纳甜(外消旋混合物) 0.04 水 至体积
投1+4。该稀释的即饮型饮料含有80ppm莫纳甜外消旋混合物。
配方C：
成分 浓度(％；重量/体积) 可乐香料C40385 0.7150 可乐香料C40386 0.7150 苯甲酸钠(20％溶液) 0.3750 S，S莫纳甜 0.275 R，R莫纳甜 0.016 水 至体积
投1+4。该稀释的即饮型饮料含有550ppm S，S莫纳甜和32ppm R，R莫纳甜。
考虑到应用本文所述原理的许多可能实施方式，应意识到所述实施方式仅是本公开的具体实施例，而不应限制本公开的范围。