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1、(10)申请公布号 CN 103002745 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 103002745 A *CN103002745A* (21)申请号 201180022359.3 (22)申请日 2011.05.03 MI2010A000776 2010.05.04 IT A01P 1/00(2006.01) A01N 63/00(2006.01) (71)申请人 米兰大学 地址 意大利米兰 (72)发明人 C哈姆迪 D达方切奥 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247 代理人 史文静 黄革生 (54) 发明名称 预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组 合物 (。
2、57) 摘要 本发明涉及用于保护蜜蜂健康的益生菌混合 物， 更具体的涉及用于保护免受微生物病状， 例如 由美国幼虫腐臭病 (AFD) 的病原幼虫类芽孢 杆菌 (Paenibacillus larvae) 导致的病变。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.02 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/057029 2011.05.03 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/138310 EN 2011.11.10 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 。
3、1 页 说明书 8 页 1/1 页 2 1. 用于预防和控制蜜蜂中的细菌疾病的组合物， 包含蜜蜂 (Apismellifera) 或其它传 粉昆虫中分离的共生细菌。 2. 权利要求 1 所述的组合物， 其中共生细菌包括一种或两种彼此组合的产孢子细菌， 和 / 或可能但不必需的， 与一种或多种乙酸细菌组合。 3. 权利要求 2 所述的组合物， 其中产孢子细菌选自苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringensis) 和 侧 孢 短 芽 孢 杆 菌 (Brevibacillus laterosporus)， 而 乙 酸 细 菌 是 Saccharibacter sp.。 4. 权利要求 1。
4、 所述的组合物， 其中疾病是蜜蜂的细菌疾病。 5. 权 利 要 求 4 所 述 的 组 合 物， 其 中 蜜 蜂 的 细 菌 疾 病 是 由 幼 虫 类 芽 孢 杆 菌 (Paenibacillus larvae) 或蜂房蜜蜂球菌 (Melissococcus pluton) 导致的。 6. 权利要求 1-4 所述的组合物， 其形式为在用于水中稀释的粉末形式、 浆、 糖浆、 实心 棒或饼中的干细菌生物质。 7. 用于控制和预防蜜蜂的疾病的方法， 包括将蜜蜂 / 幼虫、 蜂巢或蜂箱与有效量的组 合物接触， 所述组合物包含两种产孢子细菌， 所述细菌可能但不必需的组合乙酸细菌。 8. 权利要求 7 。
5、所述的方法， 其中蜜蜂疾病是细菌疾病。 9. 权利要求 8 所述的方法， 其中细菌蜜蜂疾病是由幼虫类芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌引 起的。 10. 权利要求 7 所述的方法， 其中产孢子细菌选自苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌， 而乙酸细菌是 Saccharibacter sp.。 11. 权利要求 7 所述的方法， 其中使用的组合物形式为在用于水中稀释的粉末形式、 浆、 糖浆、 实心棒或饼中的干细菌生物质。 权 利 要 求 书 CN 103002745 A 2 1/8 页 3 预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物 发明领域 0001 本发明涉及用于预防和控制在蜜蜂(Apis mellifera。
6、)中发生的病原感染的方法。 技术背景 0002 在过去 20 年间， 养蜂地区在世界范围内极其一致的记录了蜜蜂数量和生产力的 丢失。这些事实对农业 - 食品领域的更大规模也具有不利的影响。仅在 2007 年， 与该灾难 同时发生的若干要素就导致整个意大利和欧洲养蜂资产损失 30-50， 在 USA 的一些地区 损失峰值达 60-70。其破坏并不局限于昆虫死亡或生物多样性的丢失。由于传粉不足对 季节性收获的负面影响， 整个农业 - 食品领域都受到该问题的困扰。在经济上， 与之对应 的损失约为 10 亿欧元 / 年， 分布如下 ： 美国 2 千万， 中国 7 千万， 欧洲 5 亿， 世界其余地区 。
7、4 亿。意大利仅在 2007 年就有 20 万个蜂箱遭到破坏， 导致约 2.5 亿欧元的、 与缺少传粉相关 的经济损失 ( 等于 1240 欧元 / 蜂箱 )( 根据 APAT环境保护和技术服务部 (Agency for the environmentalprotection and technical services) 于 2008 年 1 月 29 日发出的通 告 )。导致这一高死亡率的可能原因是蜂箱的卫生条件、 天气变化、 饲料和水的可利用度和 质量、 电磁污染和植物药物产品 ( 新烟碱类 (neonicotinoid) 有关的污染。这些胁迫因子 作用于减少蜜蜂免疫防御力， 因而使其对。
8、于微生物和病毒感染更加虚弱。 0003 对微生物和病毒疾病的控制是艰巨的难题， 因为目前尚无用于该目的的专门的 注册药物。唯一的解决手段是预防， 例如阻止病毒或细菌的负荷达到导致诱导感染的水 平。这可以通过采用所谓的 Good Apiary Practice 来实现， 即， 在蜂箱内避免材料交换、 消毒设备和保持良好的通风。然而， 该 Good Practice 仍不充分， 传染事件的数量仍然持 续攀升。其中， 美国幼虫腐臭病 (AFD)蜜蜂幼虫最危险的疾病受到最多关注， 因 其目前尚无解决方案 (Genersch E.， 2009.American Foulbrood in honeybee。
9、sand its causative agent， Paenibacillus larvae.J Invertebr Pathol.103Suppl1 ： S10-9)。AFD 的病原是产孢子细菌幼虫类芽孢杆菌 (Paenibacilluslarvae)(Genersch 等人， 2006. Reclassification of Paenibacillus larvaesubsp.pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp larvae as Paenibacilluslarvae without subspecies differentiatio。
10、n. Int J Syst Evol Microbiol56 ： 501-511)。有四个亚类属于幼虫类芽孢杆菌 ： ERIC I、 ERIC II、 ERICIII、 ERIC IV， 每个亚类都具有特定的表型特征 (Raugh 等人， 2009. Negative correlation between individual-insect level virulence andcolony-level virulence of Paenibacillus larvae， the etiological agent ofAmerican foulbrood of honeybees.Appl。
11、 Environ Microbiol75 ： 3344-3347)。ERIC I 和 ERIC II 是最普及 的。该微生物优先感染幼小的幼虫。通过仍然保持健康的成虫进食进行传递。在欧洲， 禁 止使用抗生素控制 AFD 传播， 因为这可能导致出现抗生素抗性病原体以及出于食品安全 的原因 (Miyagi T.， Peng C.Y.S.， Chuang R.Y.， Mussen E.C.， Spivak M.S.， Doi R.H.， 2000.Verification of oxytetracycline-resistant Americanfoulbrood pathogen Paenibac。
12、illus larvae in the United States.Journal ofInvertebrate Pathology 75 ： 说 明 书 CN 103002745 A 3 2/8 页 4 95-96)。与此同时， 根据意大利法律， 向当局报告出现在任何蜂箱中的 AFD 是强制性的。此 外， 根据 Veterinary Police 规定 (D.P.R.8/2/54， n.320， art.154-158)， 由于缺少任何特 异性的治疗， 唯一可接受的解决方案是毁坏受污染的蜂箱。该严厉手段的目的是避免存在 任何可能复发的感染病灶集中点 (focuses)。 0004 如上所述，。
13、 在绝大多数情况下， 使用 Good Apiary Practice 不足以避免感染病灶 集中点的存在。 0005 领域现状 0006 想要作为预防蜜蜂的微生物病状的潜在手段的市场上唯一可获得的产品是 ApiGo(Chemicals LAIF)。这是一种蜜蜂的饲料添加剂， 用麦芽糖糊精、 酵母提取物和维生 素制备而成。它被认为是重新平衡蜜蜂成虫和幼虫的胃肠道微生物群 (microbiota) 的益 生元。然而， 对意大利 3 个地区 ( 即， Piemonte、 Lombardia 和 Emilia Romagna) 的养峰人 进行的调查表明， 该饲料添加剂不足以有效限制微生物病状在蜂箱之间扩。
14、散传播。 0007 R&D目前关注于鉴别以蜜蜂保护、 养峰业产品的健康和终端用户(消费者)安全性 为目的的、 环境友好的解决方案。 0008 US2009/0104288A1 公开了蛇麻草 (hop) 提取物限制蜜蜂的病原体扩散的用途。 0009 US2002/0034529A1 公开了使用尘埃幼虫类芽孢杆菌 (Paenibacilluslarvae pulvifacens)的菌株作为幼虫类芽孢杆菌larvae种(Paenibacilluslarvae larvae)的拮 抗剂。然而， 尘埃幼虫类芽孢杆菌是一种病原体， 即使它毒力低。 0010 Evans 和 Lopez(Evans J.D.。
15、， Lopez D.L.， 2004.Bacterial probioticsinduce an immune response in the honey bee(Hymenoptera ： Apidae).J.Econ.Entomol.97 ： 752-756) 显示， 设计用于人类消费的益生菌混合物可以增加两种具有抗微生物活性的肽 (abaecin 和防卫素 ) 在蜜蜂中的生产。工作最后提示使用这些细菌作为蜜蜂的益生菌。 0011 Evans 和 Armstrong 通过 metagenomic 方法鉴别了至少 4 种可以在体外抑制幼虫 类芽孢杆菌生长的微生物 ( 嗜麦芽糖寡养单胞菌 (S。
16、tenotrophomonas maltophilia)、 不动 杆菌属物种 (Acinetobacter sp.)、 Brevibacillus formosus 和梭状芽孢杆菌 (Bacillus fusiformis)。抑制作用涉及细菌素 (bacteriocines) 的生产 (Evans J.D.， Armstrong T.N.， 2006.Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbionts andimplications for disease.BMC Ecol.6， 4)。Yoshiyama 和 Kimu。
17、ra 提供了关于生产针 对其他菌株的细菌素的相同证据 (Yoshiyama M.， Kimura K.， 2009.Bacteria in the gut of Japanese honeybee， Apis cerana japonica， andtheir antagonistic effect against Paenibacillus larvae， the causal agent ofAmerican foulbrood.J.Invertebr. Pathol.102 ： 91-96)。 0012 Forsgren 等人 (Forsgren E.， Olofsson T.C.， V。
18、a squez A.， Fries I.， 2010. Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey beelarvae. Apidologie 41 ： 99-108) 提出使用从蜜蜂肠道分离的乙酸乳酸菌 (acetic lactic bacteria)对抗幼虫类芽孢杆菌感染。 显示了该方法在体外和体内的效果。 提出了两种可能 的作用机制 ： i)由于产生有机酸导致pH减少 ； ii)产生细菌素。 Sabat等人(SabatD.C.， Carrillo L.， Audisio M.C.， 2009.In。
19、hibition of Paenibacillus larvae and Ascophaera apis by Bacillus subtilisisolated from honeybee gut and honey samples.Res. 说 明 书 CN 103002745 A 4 3/8 页 5 Microbiol.160 ： 193-199) 还提出使用从蜜蜂的内脏器官和蜂蜜中分离的细菌 ( 即， 枯草 芽孢杆菌 (Bacillus subtiluis) 来控制幼虫类芽孢杆菌和蜜蜂球囊菌 (Ascosphaera apis)。 0013 最后， Alippi e Reynaldi(。
20、Alippi A.M.， Reynaldi F.J.， 2006.Inhibition ofthe growth of Paenibacillus larvae， the causal agent of American foulbroodof honeybees， by selected strains of aerobic spore-forming bacteria isolatedfrom apiarian sources.J.Invertebr.Pathol.91 ： 141-146)研究了一些分离物抑制幼虫类芽孢 杆菌的能力。在生物化学水平进一步探讨了 10 个最令人感兴趣的菌株，。
21、 以鉴别可能参与抑 制幼虫类芽孢杆菌的那些因素。 0014 发明定义 0015 目前发现蜜蜂的一些微生物共生生物可以对成虫和幼虫都具有益生效果， 并可以 具有免疫刺激效果。因此， 预防和控制病原体感染对其特别感兴趣。 0016 更具体而言， 本发明涉及菌株的混合物， 所述菌株具有益生菌活性， 并能够预防由 AFD 的病原幼虫类芽孢杆菌和由蜂房蜜蜂球菌 (Melissococcus pluton)( 欧洲幼虫腐 臭病 (European Foulbrood Disease) 导致的细菌感染。 0017 本 发 明 包 括 一 种 或 多 种 产 孢 子 细 菌 ( 即 苏 云 金 芽 孢 杆 菌。
22、 (Bacillusthuringensis) 和侧孢短芽孢杆菌 (Brevibacillus laterosporus)， 可能但不 必需的联合一种或多种从蜜蜂或其它传粉者中分离的乳酸细菌 ( 例如， Saccharibacter sp.) 的用途。上述三种微生物物种的应用被认为产生了强化免疫系统的益生元效果， 从而 导致预防一些蜜蜂病原体的感染。 0018 本发明的方法包括用本发明混合物对蜜蜂、 幼虫、 蜂箱和所有其它组分的预防性 处理。 0019 针对观察益生菌混合物抗幼虫类芽孢杆菌的效果所进行的具体实验显示 ： 通过多 种作用机制， 所述混合物在保护蜜蜂的成虫和幼虫中具有升高的潜力。处。
23、理导致抗外部胁 迫的更高的保护作用， 以及蜜蜂一般健康的实质性改善。 0020 比较性实验显示了混合物比单一菌株在预防感染中更有效， 在所述实验中蜜蜂的 幼虫在经过或未经过本发明的微生物菌株预处理的条件下， 暴露于幼虫类芽孢杆菌下。 0021 显示了本发明的特定微生物混合物能够产生针对病原体的直接拮抗作用， 同时能 够刺激蜜蜂的免疫系统。该刺激作用在大范围内以若干协同机制发生。这降低了出现针 对本发明作用的抗性的可能性。这是极大的优势， 因为出现抗性菌株是仍然允许使用抗生 素的那些国家中的主要问题 (Lodesani M.， Costa C.， 2005.Limits of chemother。
24、apy in beekeeping ： development of resistance and the problem of residues， Bee World86 ： 102-109)。此外， 作用的广谱性 (wide spectrum) 可以导致还有效针对其它病毒或微生物 疾病。 0022 更具体而言， 对蜜蜂的体内研究显示本发明特异性的细菌混合物能够 ： 0023 - 修饰胃肠道的 pH， 因此产生对于病原体不利的环境 ； 0024 - 在蜜蜂的胃肠道中建群， 诱导竞争性排除病原体的机制 ； 0025 - 同时激活蜜蜂的三种调控免疫系统的机制 ： i) 产生抗微生物肽 (AMP)。
25、， ii) 产生 参与调控黑变作用过程的酶酚氧化酶 ； iii) 产生溶菌酶 ； 说 明 书 CN 103002745 A 5 4/8 页 6 0026 - 产生 AFD 病原体拮抗性的细菌素。 0027 总而言之， 本发明特定的益生菌混合物是蜜蜂 collapsing 疾病问题的生物学的、 因而也是环境友好型的解决方案， 它利用作为蜜蜂的共生生物的、 从昆虫自身分离的细菌。 0028 生物质制品 0029 通过单个菌株的发酵工艺， 再冻干细菌生物质， 来制备干燥生物质。 0030 散布细菌混合物的剂型和手段 0031 散布本发明的细菌混合物的制剂和相关手段的例子是 ( 但不限于 ) ： 00。
26、32 1.蒸发或喷雾预先稀释在净水中的细菌生物质的的粉末。 该制剂可以直接散布在 蜜蜂成虫、 幼虫和能与昆虫接触的任何养蜂设备上。建议剂量是每个蜂箱 200mL 细菌悬浮 液， 终浓度范围从 1x103至 1x109cfu/mL， 更具体是从 1x105至 1x107。 0033 2. 施用在浆内的干燥生物质。浆是基于糖的产品， 通常被散布在每个蜂箱的给食 袋 (feeding pocket) 中。建议剂量是每个蜂箱 700mL 细菌悬浮液， 悬浮液终浓度范围从 1x103至 1x109cfu/mL， 更具体是从 1x105至 1x107。 0034 3. 施用实心棒或饼。将细菌生物质溶解在基。
27、于糖的液体中， 然后将其硬化并导 入蜂箱顶盖下。建议剂量是每个蜂箱 500mL 细菌悬浮液， 悬浮液终浓度范围从 1x103至 1x109cfu/mL， 更具体是从 1x105至 1x107。 0035 实验部分 0036 已经在体外和体内研究中探讨了本发明特定的微生物混合物抗病原体的效果和 对于蜜蜂健康的效果。研究的主要阶段如下进行。 0037 1. 从表现出美国幼虫腐臭病症状的蜜蜂幼虫中分离幼虫类芽孢杆菌 larvae 种菌 株 0038 从表现出 AFD 症状的突尼斯和意大利蜂箱取样 10 条幼虫。如文献所述， 在 含有哥伦比亚血琼脂 (Columbia blood agar) 的培养基。
28、上进行分离幼虫类芽孢杆菌 larvae 种 (Genersch 等人， 2006.Reclassification ofPaenibacillus larvae subsp pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsplarvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation.Int J SystEvol Microbiol 56 ： 501-511 ； Bakonyi 等人， 2003.Development andevaluation of PCR assays for the。
29、 detection of Paenibacillus larvae in honeysamples ： comparison with isolation and biochemical characterization.ApplEnviron Microbiol 69 ： 1504-1510)。 通过16S rRNA基因测序和使 用引物ERIC的基因组重复序列扩增(rep-PCR)， 进行类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.) 的 301 株分离菌的分子分型。将 16S rRNA 序列与国际数据库中可获得的数据比对， 而将 ERIC 谱与文献中可获得的比较。在 301 株分离。
30、菌中的 2 株被鉴定为 ERIC I 和 ERIC II。这 是类芽孢杆菌属传播最广的菌株， 因此使用这两株分离菌进行所有的其它实验。 0039 2. 从健康蜂箱的蜜蜂幼虫和成虫中分离共生细菌 0040 选择一个没有 AFD 症状的意大利蜂箱作为环境资源， 分离具有潜在益生菌活性的 细菌。通过 16S rRNA 基因测序， 鉴别出共 270 株分离菌， 在第 2 个阶段， 根据其代谢能力将 分离菌分组。鉴别出 2 个主要组 ： i)196 株乙酸细菌 ； ii)64 株产孢子细菌。 0041 3. 体外筛选抗幼虫类芽孢杆菌 larvae 种的拮抗活性 0042 产孢子细菌 说 明 书 CN 1。
31、03002745 A 6 5/8 页 7 0043 通过抑制测定， 在体外测试 64 株产孢子细菌， 以研讨针对之前选定的 2 株幼虫类 芽孢杆菌larvae种ERIC I和ERIC II菌株的拮抗活性。 测试是在Tryptic Soy Agar(TSA) 上进行的， 如 Sabat 等人， 2009 所述 (SabatD.C.， Carrillo L.， Audisio M.C.， 2009. Inhibition of Paenibacillus larvaeand Ascophaera apis by Bacillus subtilis isolated from honeybee gu。
32、t andhoney samples.Res.Microbiol.160 ： 193-199)。 0044 在37孵育48h后， 测量生长在测试菌株周围的幼虫类芽孢杆菌larvae种的抑制 晕圈， 评估拮抗活性。根据该测试的结果， 选择 2 个产生较大晕圈的菌株 ( 即， 苏云金芽孢 杆菌(Bacillus thuringensis)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)进行 进一步的实验。 0045 评估了选定的细菌对于不同浓度的幼虫类芽孢杆菌larvae种菌株ERIC I和ERIC II 的拮抗作用效力 ( 表 1)。使用大肠杆菌菌株作为阴性对照。 004。
33、6 表 1 ： 由于存在选定的产孢子共生生物导致的幼虫类芽孢杆菌 larvae 种生长的抑 制晕圈的直径 (cm) 0047 0048 ND 未检测到 ； BI 模糊的抑制 ； 在 106/ml CFU/mL 的浓度下 0049 基于产孢子细菌的拮抗活性的作用机制是产生细菌素。 0050 乙酸细菌 0051 以产生对抗幼虫类芽孢杆菌 larvae 种有活性的细菌的协同混合物为目标， 研究 了从蜜蜂中分离的 196 株乙酸细菌的代谢活性。更具体的是， 研究了通过产生乳酸造成的 说 明 书 CN 103002745 A 7 6/8 页 8 pH 改变如何在不影响苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的生长。
34、的条件下， 对抑制病原体生 长发挥作用。 0052 在表 2 中， 报道了幼虫类芽孢杆菌 larvae 种 ERIC I 和 ERIC II、 苏云金芽孢杆菌 和侧孢短芽孢杆菌的菌株能够生长的 pH 范围。 0053 表 2 ： 幼虫类芽孢杆菌 larvae 幼虫、 苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌响应不同 pH 范围的生长测定 0054 0055 ND 未检测到 ； + 正生长 ； - 不生长 0056 低于 5.5 的 pH 值抑制幼虫类芽孢杆菌 larvae 种的病原体菌株的生长， 而益生菌 菌株苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌能够在更低的 pH(4.5) 下生长， 表示其相比病原体 对亚酸。
35、性环境更高的耐受性。因此， 考虑 4.5-5.5 的 pH 范围可以支持苏云金芽孢杆菌和侧 孢短芽孢杆菌的生长， 而不支持幼虫类芽孢杆菌 larvae 种菌株 ERIC I 和 ERIC II 的生长， 鉴别了何种乳酸细菌能够将生长培养基的 pH 降低至低于 5.5 的值。结果从健康蜜蜂中分 离的 Saccharibacter sp. 菌株是最佳候选对象， 这还因为以下事实， 即它可以在与苏云金 芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的共培养中方便的容易的生长。 0057 通过不依赖于培养物的分子指纹技术 PCR-DGGE( 变性梯度凝胶电泳 )， 显示了 Saccharibacter sp. 和 / 或其。
36、它乙酸细菌与健康蜜蜂幼虫和成虫的普遍关联。 0058 4. 选定的细菌抗幼虫类芽孢杆菌 larvae 种的体内拮抗活性。单个菌株及其混合 物的效果 0059 体内研究证实了混合物改善和保护蜜蜂健康的功效。在来自 10 个不同蜂箱的不 同年龄 (12 至 36 小时之间， 对感染最敏感的时期 ) 的 2046 条蜜蜂幼虫中测试本发明的功 效。实验 ( 按每批约 500 条幼虫进行 ) 显示， 向饮食中添加细菌混合物能够保护幼虫免受 说 明 书 CN 103002745 A 8 7/8 页 9 AFD 感染。在存在幼虫类芽孢杆菌的条件下， 幼虫的死亡率在 50至 90之间。死亡率水 平降低至与用本。
37、发明的菌株预先处理时的幼虫没有暴露于病原体时死亡率水平相似的值。 相比对照， 单个菌株和细菌混合物都实现了 90至 100存活， 其中后者具有最佳效果。 0060 表 3 中概括了体内的结果。 0061 表 3 ： 评估用益生菌菌株苏云金芽孢杆菌、 侧孢短芽孢杆菌、 Saccharibacter sp. 和非益生菌大肠杆菌处理时， 保护蜜蜂免受幼虫类芽孢杆菌 larvae 种的程度的体内实 验结果。通过一侧 ANOVA 评估处理之间的显著差异， 使用 Turkey s 检验比较单个平均值。 具有不同字母的样品是统计学不同的 (p 0.05)。 0062 0063 0064 还测试了分离的益生菌。
38、菌株在蜜蜂胃肠道中建群的能力， 所述能力因此可以导致 竞争性排除病原体的机制。用补充了益生菌菌株的糖饮食喂养蜜蜂成虫 3 天。之后用病原 体取代饮食中的益生菌菌株。一周后， 将肠内容物置于选择性培养基上， 研究病原体的存 在。不可能重新获得病原体的存在， 同时已经重新分离并通过分子技术表征了苏云金芽孢 杆菌、 侧孢短芽孢杆菌和Saccharibacter sp.。 该方法显示， 本发明的细菌在肠相关性微生 物群落中成为主流。 0065 5. 选定的益生菌混合物在蜜蜂的幼虫和成虫中的免疫刺激活性 0066 无脊椎动物的免疫系统通过 2 种机制控制感染 ： i) 由具有抗微生物活性的可溶性 说 明。
39、 书 CN 103002745 A 9 8/8 页 10 肽 (AMP)、 蛋白酶等 介导的体液应答 ； ii) 细胞应答。参与第一种机制的典型 AMP 是 防御素或 abaecin， 这是可以导致微生物裂解的物质。另一个体液应答的例子是产生溶菌 酶， 其生产受 3 个基因 (lys1-3) 的调控。细胞应答包括血细胞的吞噬作用、 包囊作用和结 瘤作用。更具体而言， 在包囊作用的过程中， 病原体被主要由黑色素 ( 黑变作用 ) 组成的层 包围。该层吸附在病变组织上， 形成分隔入侵者的屏障。黑变作用的过程受酶酚氧化酶介 导， 并受基因 proPOact 调控。 0067 为了研究本发明的益生菌菌。
40、株是否能够刺激蜜蜂的免疫系统的主要机制， 我们研 究了在用本发明的细菌混合物 (20l 终浓度为 3x104小细胞 /l 的苏云金芽孢杆菌和 侧孢短芽孢杆菌 ) 修正的饮食喂养的 10 条幼虫和 10 只成虫中， 相比在用基础饮食 ( 果 糖、 葡萄糖、 酵母提取物和王浆 ) 喂养的 5 条幼虫中， 编码 i)abaecin ； ii) 防御素 I ； iii) lys-1 ； iv)proPOact 和 v)hym(hymenoptaecin) 的基因转录水平。在处理 3 天和禁食 1 天 后， 从每只幼虫 / 成虫中提取总 RNA。通过使用特定引物的实时 qPCR 定量基因表达。用益 生菌混合物处理能够导致基因防御素 I(+0.5Log) 和 Hym(+2.8Log) 在幼虫中， 和所有的研 究基因 ： abaecin(+0.1Log)、 防御素 I(+3.8Log)、 lys-1(+0.5Log)、 proPOact(+0.1Log) 和 Hym(+2.8Log) 在成虫中的统计学显著的增加 ( 与昆虫 5S 的比例 )。在对照情况下 ( 基础 糖饮食 )， 没有观察到所研究基因的表达的显著改变。 说 明 书 CN 103002745 A 10 。