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1、(10)授权公告号 CN 101156630 B (45)授权公告日 2011.05.18 CN 101156630 B *CN101156630B* (21)申请号 200710177513.X (22)申请日 2007.11.16 A23C 9/152(2006.01) A23L 1/30(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路 17 号 (72)发明人 车会莲 邬宝森 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 胡长远 CN 1439313 A,2003.09.03, 全文 . CN 1531932 A。
2、,2004.04.29, 全文 . CN 1820612 A,2006.08.23, 全文 . M Uzzam et al.Thermal and Storage Stability of Nutraceuticals in a MilkBeverage Dietary Supplement.Journal of food science72 3.2007,72(3),E109-E114. 印海峰 . 氨基葡糖在治疗骨关节炎中的应 用 . 食品与药品 7 1A.2005,7(1A),56-57. (54) 发明名称 骨关节强化奶 (57) 摘要 本发明公开了一种骨关节强化奶， 主要是在 脱脂牛。
3、奶中含有氨基葡萄糖硫酸盐、 大豆异黄酮、 肌酸、 硫酸软骨素和乳铁蛋白五种营养因子。 本发 明中五种营养因子有效成分含量高， 为防治骨关 节疾病提供了一种有效手段， 其次本发明采用直 接添加方法生产， 采用超声波进行均质， 工艺简单 易行 ； 本发明生产成本低、 产品质量易于控制。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 陈伟健 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101156630 B1/1 页 2 1. 一种骨关节强化奶， 是指在脱脂牛奶中含有氨基葡萄糖硫酸盐、 大豆异黄酮、 肌酸、 硫酸软骨素和乳铁蛋白 ； 其中每 。
4、100ml 脱脂牛奶中含有氨基葡萄糖硫酸盐 650 700mg、 大 豆异黄酮120130mg、 肌酸750800mg、 硫酸软骨素610630mg、 乳铁蛋白270280mg。 权 利 要 求 书 CN 101156630 B1/6 页 3 骨关节强化奶 技术领域 0001 本发明属于一种乳制品， 具体地说涉及一种含有添加物的脱脂奶。 背景技术 0002 进入21世纪以来， 世界各国相继进入老龄化社会， 我国目前55岁以上的老龄人口 占人口组成的 25， 老人由于咀嚼和吞咽功能的下降， 饮食习惯的改变， 越来越多的健康问 题和衰老相关疾病也随之出现。最近研究发现牛奶可作为补充营养补充剂的载体。
5、， 这种添 加了营养补充剂的牛奶， 可有助于延缓衰老相关疾病的发生和演变进程， 包括心脏病、 骨关 节疾病、 免疫力低下和癌症等。含有营养补充剂的牛奶， 食用起来很方便， 而且牛奶营养丰 富， 是常吃的食物， 可以作为递药系统， 携带一定剂量的营养补充剂的同时还能提供丰富的 营养物质， 如钙、 钾、 蛋白等。应用含有营养因子的牛奶可以有助于老年人摆脱某种疾病的 困扰， 从而达到改善老年人生活质量的目的。 0003 我国老龄人口中患有骨关节疾病的人数达 5000 万之多， 继心脑血管疾病之后， 退 行性骨关节病已成为我国 50 岁以后人口中逐渐丧失劳动能力的第二大病因。临床采用食 疗的方法， 即。
6、用给病人服用添加氨基葡萄糖硫酸盐等功能因子的强化保健品的方法， 来治 疗骨关节疾病。 经过这种治疗， 近一半的患者骨关节疾病的症状得到缓解或者减轻， 关节的 灵活性增加， 疼痛、 肿胀减轻 ； 还有一些患者， 应用此项治疗后， 关节机能障碍的症状 ( 关节 疼痛和骨关节炎 ) 稳定， 不继续恶化。 0004 据美国研究机构者报道， 以液体牛奶为基质， 可向其中添加的营养补充剂包括 - 葡聚糖、 咖啡因、 氨基葡萄糖、 绿茶提取物、 乳铁蛋白、 叶黄素、 S- 腺苷 -L- 蛋氨酸、 大豆 蛋白、 植物甾醇类、 益生菌、 镁及维生素 C 和维生素 E。其中氨基葡萄糖、 硫酸软骨素、 肌酸、 大豆。
7、异黄酮、 乳铁蛋白具有参与骨和软骨组织代谢， 改善骨关节疾病的症状， 缓解关节疼痛 的作用。 0005 氨基葡萄糖 (Glucosamine) 是一种天然的氨基己糖， 是形成软骨细胞的重要营养 素， 是人体内合成的物质， 是健康关节软骨的天然组织成份。 关节软骨细胞在得到了氨基葡 萄糖后， 充分补充了营养， 并在氨基葡萄糖的刺激下合成了足够的蛋白多糖， 从而保持关节 软骨的弹性和厚度， 保持关节不受损伤。氨基葡萄糖它不仅可以刺激软骨细胞合成蛋白多 糖， 还可以帮助修复和维护关节软骨， 保持关节软骨和滑膜等关节周围组织的代谢平衡。 此 外， 氨基葡萄糖在人体内还能大量催生和补充关节滑液， 使关节。
8、软骨表面得到润滑， 减少摩 擦， 使关节灵活自如 ； 并能抑制有害酶类及有害因子对软骨细胞的侵害， 使关节和机体免疫 能力提高， 对软骨基质进行修复， 改善软骨结构， 延缓关节疾病的病理过程和进展 (Ilic MZ 等， Osteoarthritis and Cartilage， 2003， 85(8) ： 613-622 ； MARC COHEN 等， The Journal of Rheumatology， 2003， 303(63) ： 523-528 ； J.Hua 等 Res， 2005， 54(37) ： 127-132 ； H uselmann HJ.ClinicalRheuma。
9、tology， 2001， 75(4) ： 595-607)。 由于氨基葡萄糖既具有参与 软骨构建和损伤软骨修复作用， 又具有抗炎作用， 被美国 FDA 批准为饮食补充剂， 我国也将 其批准为保健食品。氨基葡萄糖的各种盐中以硫酸盐对骨关节疾病的保健作用尤为突出。 说 明 书 CN 101156630 B2/6 页 4 0006 硫酸软骨素 (Chondroitin sulfate) 是一种天然酸性粘多糖， 属生物高分子化合 物， 在体内无法单独存在， 多以粘多糖蛋白质的形式存在。硫酸软骨素广泛存在于人和一 些动物如猪、 牛、 羊和鱼等软骨组织中， 且通过共价键与核心蛋白相结合。饮食补充硫酸软 。
10、骨素可直接补充软骨的基质成分、 减少软骨成分的降解、 促进软骨细胞的代谢、 恢复软骨细 胞基质分泌功能、 抑制关节内多种胶原酶的活性 ； 此外硫酸软骨素还具有调整身体机能、 保持体内水分和微量营养素、 促进创口愈合、 防止细菌感染、 保持角膜的透明性、 促进冠状 动脉循环、 降血脂、 抗凝血和心血管硬化、 抗肿瘤等活性 (Maksimenko A V 等 .MetabEng， 2003， 5(3) ： 177-182 ； Tapon-Bretaudiere J 等 .Thromb Haemost， 2000， 4(2) ： 332-337 ； Vakhrusheva T 等， Chem Phy。
11、s Lipids， 2006， 140(1-2) ： 18-27 ； Mourao P A 等 .Thromb Res， 2001， 102(2) ： 167-176 ； Pacheco R G 等 .BloodCoagul Fibrinolysis， 2000， 11(6) ： 563-573 ； Chou M M 等 .Exp Biol Med(Maywood)， 2005， 230(4) ： 255-262 ； Omata T 等， Arzneimittelforsch， 2000， 50(2) ： 148-53 ； Nishimoto S 等， J Biosci Bioeng， 200。
12、5， 100(1) ： 123-126)。 0007 肌酸 (Creatine) 是一种人体内天然合成的氨基酸化合物， 可以从肉类食物中获 得， 或在肝、 肾、 脑等组织中合成。 它是合成磷酸肌酸的重要原料， 在运动中可以将贮存的能 量快速地转变为 ATP， 从而为机体快速提供能量。而在骨骼肌能量代谢中， 磷酸肌酸是机体 能量的贮存形式， 是能量的 “后备来源” 或 “仓库” ， 当体内的 ATP 水平下降时， 磷酸肌酸可以 使 ATP 再合成并提供能量， 此外肌酸还能增加力量、 增长肌肉、 加速疲劳恢复 ( 张立 . 湖北 体育科技， 2002， 2l(1) ： 19-20 ； 刘大川 . 。
13、首都体育学院学报， 2002， 14(3) ： 94-96 ； Hellgren L 等， Eur J Cardiothorac Surg， 2002， 22(6) ： 904-911 ； MoibenkoAA 等， Curr Ther RES， 1992， 52(8) ： 791-801)。 肌酸在人体内储存越多， 能量的供给就越充分， 疲劳恢复得越快， 运 动能力也越强。当体能消耗较大时， 人体每天大约需要补充 5 克肌酸， 而人每天从牛、 羊、 鱼 等食物中仅能获取 l 克左右的肌酸， 要百分百从日常食物中得到所需肌酸是不可能的。 0008 大豆异黄酮 (Soy isoflavonet)。
14、 是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。由于 是从植物中提取， 与雌激素有相似结构， 因此称为植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用 影响到激素分泌、 代谢生物学活性、 蛋白质合成、 生长因子活性， 是天然的癌症化学预防剂 (LAZIER M G 等 .Arch Int Med， 2001， 161(9) ： 1161-1163 ； UPMALIS DH 等 .Menopanse， 2000， 7(4) ： 236-242 ； 薛晓鸥等 . 中国中西医结合杂志， 2004， 24(9) ： 835-836 ； 王玉双 等.中国综合临床， 2006， 22(1) ： 86-88 ； UNFER V等.。
15、Fertil Steril， 2004， 82(1) ： 145-148 ； DOG L T.Am J Med， 2005， 118(12 Suppl 2) ： 98-108)。大豆异黄酮在化学上作为结构类似 物与雌激素活性有关， 显示抑制和协同的双向调节功效 ： 当人体内雌激素水平偏低时， 异黄 酮占据雌激素受体， 发挥弱雌激素效应， 表现出提高雌激素水平的作用 ； 当人体内雌激素水 平过高时， 异黄酮以 “竞争” 方式占据受体位置， 同时发挥弱雌激素效应， 因而从总体上表现 出降低体内雌激素水平的作用。 它能有选择地与雌激素受体结合且性质温和， 它与脑、 前列 腺、 膀胱、 心血管、 骨组。
16、织这些受体的亲和力强， 而对子宫、 卵巢、 乳腺等的亲和力弱， 而且其 活性只有雌性激素的 1/1000 1/100000。因而避免了补充雌激素可能诱发癌症的风险。 0009 乳铁蛋白 (Lactoferrin) 是一种多功能蛋白质， 具有高度结合铁的能力， 从而使 细菌失去生长所需的基本养分铁。另外， 乳铁蛋白通过氨基末端强阳离子结合区域， 增加 细菌细胞膜的通透性， 使细菌的脂多糖从外膜渗出， 达到直接杀菌作用。乳铁蛋白可以通 说 明 书 CN 101156630 B3/6 页 5 过抑制病毒进入细胞， 减轻对人体肝细胞的损害。乳铁蛋白具有抗氧化作用， 能抑制铁诱 导的脂质过氧化过程所产生。
17、的硫代巴比妥酸和丙二醛的生成。另外， 牛乳铁蛋白能降解酵 母中的转运 RNA， 具有核糖果核酸酶的活性， 且能抑制超氧离子的形成。所有这些都可降 低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏， 达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的 目的。乳铁蛋白调节机体免疫反应， 对抗体生成 T 细胞成熟、 淋巴细胞中自然杀伤细胞比 例都具有调节作用 ； 乳铁蛋白还具有调节胃肠道铁的吸收 ； 能同多种抗生素和抗病毒药物 协同作用， 减少药物用量 ； 降低抗生素或抗病真菌制剂对人体肝， 肾功能的损害 ； 同时， 增 强体内微生物对药物的敏感性 (KANYSHKOVA T 等 .Eur J Biochem， 2003。
18、， 270 ： 3353-3361 ； MCCANN K B 等 .JAppl Mcrobiol， 2003， 95(5) ： 1026-1033 ； VAN DER STRAFE B.Antiviral Research， 2001， 52(3) ： 225-239 ； 曹阳等 . 食品科学， 2002， 13(12) ： 132-138 ； SEBASTIEN F 等 .MolecularImmunology， 2003， 40 ： 395-405)。 0010 M.Uzza 等 (Journal of Food Science， Volume 72， Issue 3， Page E109。
19、-E114， Apr 2007)和Wenyi Wang等(Comprehensive Reviews in Food Science and FoodSafety， Volume 4， Issue 4， Page 63-78， Oct 2005) 研究表明， 氨基葡萄糖、 硫酸软骨素、 肌酸、 大豆 异黄酮、 乳铁蛋白可稳定地存在于脱脂牛奶体系中， 牛奶不仅能够携带这些营养物质进入 体内， 还能够促进这些骨关节营养因子的营养和保健作用。目前国内外已经出现了一些具 有保健功能的乳制品， 有些申请了专利。其中申请号为 JP2005080604 的专利公开了在牛奶 中添加 80 90的 N- 乙酰基。
20、葡萄糖和 10 20低聚糖 ； 我国申请号为 200610037550.6 的专利公开了在牛奶中添加了共轭亚油酸或共轭亚油酸衍生物的发明。 这两项专利均是在 牛奶中添加某种活性成分， 利用牛奶作为载体， 实现功能因子的保健作用。 发明内容 0011 本发明的目的是提供一种骨关节强化奶， 本发明中含有骨关节营养因子。 0012 本发明目的通过以下技术方案实现 ： 0013 本发明一种骨关节强化奶， 是指在脱脂牛奶中含有氨基葡萄糖硫酸盐， 大豆异黄 酮， 肌酸， 硫酸软骨素， 乳铁蛋白。 0014 上述骨关节强化奶， 每 100ml 脱脂牛奶中含有氨基葡萄糖硫酸盐 600 800mg， 大 豆异黄。
21、酮100150mg， 肌酸700850mg， 硫酸软骨素600650mg， 乳铁蛋白250300mg。 0015 上述骨关节强化奶， 所述的氨基葡萄糖硫酸盐优选为 650 700mg ； 所述的的大 豆异黄酮优选为 120 130mg ； 所述的肌酸优选为 750 800mg ； 所述的硫酸软骨素优选为 610 630mg ； 所述的乳铁蛋白优选为 270 280mg。 0016 一种固态奶， 以上述骨关节强化奶为原料制成。 0017 一种液态奶， 以上述骨关节强化奶为原料制成。 0018 一种骨关节强化奶的生产方法， 是将脱脂奶消毒灭菌处理， 然后在密闭条件下， 按 照比例分别加入氨基葡萄糖。
22、硫酸钠、 大豆异黄酮、 肌酸、 硫酸软骨素、 乳铁蛋白， 经过超声波 均质混匀后， 再进行低温消毒制得。 0019 上述生产方法中， 所述的比例为每 10L 脱脂牛奶中， 加入氨基葡萄糖硫酸钠 6 10g、 大豆异黄酮 15 20g、 肌酸 90 100g、 硫酸软骨素 50 80g、 乳铁蛋白 30 40g。 0020 本发明所采用的氨基葡萄糖硫酸盐及其他 4 种骨关节营养因子均可以采用市售 说 明 书 CN 101156630 B4/6 页 6 产品， 如武汉合中化工制造有限公司生产的氨基葡萄糖硫酸钠、 北京华清美恒公司生产的 大豆异黄酮、 武汉远城科技发展有限公司生产的肌酸、 上海阿敏生。
23、物技术公司生产的硫酸 软骨素、 北京嘉康源科技发展有限公司生产的乳铁蛋白。 0021 大多数情况下， 营养制品的生物活性成分的降解限制了乳制品饮料的贮存期限 ； 少数情况则由于营养制品中的成分与牛奶相互作用而决定贮存期限， 如乳蛋白的凝集和沉 淀。 大豆异黄酮和硫酸软骨素在所有的热处理条件下， 性状基本不变 ； 在室温或者低于室温 条件下贮存， 性状也不发生改变。 浓缩奶中的氨基葡萄糖硫酸钠经过普通巴氏消毒， 仍可稳 定存在， 但如果温度在100或以上温度， 会使乳蛋白不稳定。 乳铁蛋白在低温巴氏消毒时， 性状稳定， 但是超高温处理会发生变性。 肌酸在巴氏消毒处理后比较稳定， 最大损失量小于 。
24、5。所有五种骨关节营养因子均可以添加到脱脂奶中， 制成骨关节强化奶。 0022 为了保证有更好的保健作用， 本发明所使用的添加骨关节营养因子的基质为适应 老年人健康需要含脂肪较少的脱脂牛奶， 添加的骨关节营养因子的浓度依照片剂膳食补充 剂中常用剂量或者根据每日 ( 大豆异黄酮和乳铁蛋白 ) 或双日 ( 氨基葡萄糖、 硫酸软骨素 和肌酸 ) 消耗量确定。 0023 本发明的优点和有益效果 ： (1) 本发明含有五种营养因子， 有效成分含量高， 为防 治骨关节疾病提供了一种有效手段 ； (2) 本发明以脱脂牛奶作为载体， 食用方便， 尤其适于 老年人应用 ； (3) 本发明采用直接添加方法生产， 。
25、采用超声波进行均质， 工艺简单 ； (4) 本发 明生产成本低、 产品质量易于控制。 具体实施方式 0024 下面通过实施例对本发明作进一步解释， 但是不对本发明构成任何限制。 0025 以下实施例中鲜奶按照 GB6914-86(生鲜牛乳收购标准 ) 采收， 营养成分按照 GB5408.1-1999( 巴氏杀菌乳 )和GB5408.2-1999( 灭菌乳 )标准化， 脱脂鲜奶当中的营养 成分为 ： 蛋白质2.9， 脂肪0.5， 非脂乳固体8.1。 相关指标按照GB5409-85( 牛 乳检验方法 ) 进行检验。 0026 实施例中所应用到的五种骨关节营养因子均为食品级， 其中氨基葡萄糖硫酸钠购。
26、 于武汉合中化工制造有限公司， 大豆异黄酮购于北京华清美恒公司、 肌酸购于武汉远城科 技发展有限公司、 硫酸软骨素购于上海阿敏生物技术公司、 乳铁蛋白购于北京嘉康源科技 发展有限公司。 0027 实施例 1 0028 将 10L 脱脂奶进行巴氏灭菌处理， 然后在密闭条件下， 分别加入氨基葡萄糖硫酸 钠 6.25g、 大豆异黄酮 12.0g、 肌酸 72.0g、 硫酸软骨素 50g 和乳铁蛋白 26g， 搅拌混匀， 再进 行 76低温消毒， 冷却、 罐装。 0029 为控制五种骨关节营养因子在骨关节强化奶中的含量， 可通过如下方法检测其含 量， 从而对其进行质量控制 ： 0030 (1). 大豆。
27、异黄酮 ： 反相高效液相色谱法。分别取 2 ml 骨关节强化奶样品， 50l 5， 7， 4-三羟(基)黄酮(内标准)和3ml乙腈加到15ml带盖子的离心管中， 涡旋振荡器 震摇 15min， 10保存过夜。取出 2.1ml 上层预冷的液体转移到另一个离心管中， 加热到室 温， 然后转移2.0ml到蒸发球中， 在40恒温通氮气蒸发干燥。 干燥样品用2.4ml 50的乙 说 明 书 CN 101156630 B5/6 页 7 腈溶液溶解， 过滤 (0.22m)， 取 10l 注入反相高效液相色谱仪进行分析。高效液相色谱 条件 ： 紫外线分光光度检测器、 填充柱为 C18(YMC-ODSAM 25。
28、0mm3mm)， 并同时配有 C18 保 护柱(AJ0-7597)， 柱温40。 HPLC数据资料的分析采用改良Griffith and Collison方法。 用两种溶剂进行梯度洗脱， 流速 0.8mL/min ： (A) 乙酸乙腈水 0.1 9.95 89.95， (B) 乙酸乙腈水 0.1 89.95 9.95。HPLC 程序包括 ： 均衡 -1.0 柱体积含 B 洗脱 剂为 0， 梯度洗脱 -6.3 倍柱体积含 B 洗脱剂 0到 31.5， 洗脱 -4 倍柱体积的 100 B 洗 脱剂洗脱。 0031 如下方法制定大豆甙元的标准曲线 ： 贮备液 -5.3mg 5， 4 - 三羟 ( 基。
29、 ) 异黄酮， 5.0mg 大豆黄酮， 7.0mg 大豆黄素， 50mg 染料木甙， 50.2mg 大豆黄甙和 11.0mg 山梨醇溶于 50g DMSO。工作液将 3.04g 贮备液和 500l 5， 7， 4 - 三羟 ( 基 ) 黄酮溶于 50的乙腈， 定容到 25mL。然后再用 50的乙腈 1 1、 1 3、 1 7、 and 1 21 进行稀释。当趋势线 趋于零时， 标准曲线的决定系数R20.998。 萃取效率的检测 ： 用去离子水中溶解的1.2mg/ ml 大豆异黄酮的溶液， 吸取上述溶液 2ml 加到 50ml 含有 3ml 乙腈的 5， 7， 4 - 三羟 ( 基 ) 黄酮液体。
30、中， 然后取2mL， 加0.4ml水， 混合均匀， 注入HPLC。 后者与一种非加热的含1.2mg/ ml 大豆异黄酮的骨关节强化奶比较， 萃取方法与上述方法相同。 0032 (2). 硫酸软骨素 ： 将 10L 磷酸盐缓冲溶液 (Chromadex)， 20L 软骨素酶 ABC 溶 液 (10 units/mL ； Sigma-Aldrich) 和 10L 浓缩的乳制品样品在 1.5mL 的 Eppendorf 管中 混合， 37孵育3h， 以充分降解硫酸软骨素成双糖(Di-0S， Di-4S and Di-6S)。 加入150L 乙腈， 涡旋振荡 10s， 加入 310L 醋酸盐缓冲液 (。
31、pH 5.0)， 涡旋振荡 10s， PVDF 注射器式 滤器过滤 (13 mmdia， 0.22m ； Millex， Millepore)。将 30L 滤液注入到带有 2504.6mm NH2柱的高效液相色谱系统中(Primesphere， Phenomenex)。 HPLC条件 ： 等度洗脱液3070 乙腈醋酸盐缓冲液 (pH 5.0)， 室温 1.5mL/min， 240nm 波长 UV 检测。校正曲线使用 5 个已 知浓度的双糖软骨素 (Chromadex) 商业混合物制定。最低的线性拟合曲线的决定系数 R2 0.97。萃取效率通过 5mg/mL 软骨素制品 Optaflex 水溶液。
32、制剂， 按上述方法进行酶的消 化， 试剂的添加， 将结果与新配制的 5mg/mL 的软骨素牛奶溶液比较。 0033 (3). 氨基葡萄糖 ： 加入 4 倍体积的甲醇沉淀乳蛋白质， 室温静止 1 h， 1000g 离心 10 分钟。采用改良的高效液相色谱分析方法分析。1.5mL Eppendorf 管中加入 50L 上清 夜， 50L 内标物 (0.2mg/mL D-(+) 氨基半乳糖盐酸化物 )， 400L 水， 500L 磷酸盐缓冲 溶液 (pH8.0)， 200L 5对异硫氰酸盐甲醇溶液混合在一起。盖上盖子， 涡旋振荡 10s， 12500rpm 离心 5 分钟， 0.22m 滤膜 (13。
33、mm ； Millex， Millepore) 过滤。30L 注入到 HPLC 系统， 固定相为增效 4u 融合 RP 柱 (Phenomenex， 2504.6mm)。HPLC 条件 ： 乙酸甲醇水 为 0.5 50 49.5 混合溶液以 1.8mL/min 的速率等速度洗脱， 40洗脱 16 分钟， 然后用 80乙腈洗脱 (20流动相 )， 接着再用流动相平衡 7 分钟， 240nm 波长下检测。标准曲线 的绘制 ： 贮备液 25.0mg 葡萄糖胺标准品溶于 25mL 水， 然后用水将贮备液稀释到 25， 50， 75， 100g/mL。标准溶液的分析方法同上所述。 0034 (4). 肌。
34、酸 ： 用 960L 去离子水稀释 40L 肌酸浓缩乳制品。肌酸的 HPLC 分析方 法采用 Dash and Shawney(2002) 的方法。将 800L 稀释的样品转移到 15mL 离心管中， 加 入 1.0mL 浓度为 0.3mg/mL 4-(2- 氨乙基 ) 氨苯磺胺甲醇溶液 ( 内标物 )， 3.2mL 甲醇， 室温 静止1 h， 1000g离心10分钟。 取上清液1000L， 在45用N2抽干， 干燥物质用1000L 说 明 书 CN 101156630 B6/6 页 8 流动相溶解， 0.22m 滤膜过滤 (13mm， Millex)， 将 30L 滤液注入到 HPLC。HP。
35、LC 操作程 序应用 C18 柱 (Betabasic， Thermo， U.S.A.)， 并配有 18 保护柱 (AJ0-7597， Phenomenex)。 HPLC 条件 ： 流动相 0.045M 磷酸铵以 1.2mL/min 速率等度洗脱， 205nm 波长紫外检测。将浓 度分别为 10， 20， 50 and 100g/mL 肌酸和肌酸酐外标物 30L 注入到 HPLC， 绘制标准曲 线。将新鲜的未加热的浓缩奶中提取的肌酸量与同一浓度的肌酸水溶液比较， 计算萃取效 率。 0035 (5).乳铁蛋白 ： 使用Single Radial Immunodifusion(SRID)试剂盒(C。
36、ardiotech Services， Louisville， Ky.， U.S.A.) 定量分析乳制品饮料中的乳铁蛋白的含量。不用萃 取， 该试剂盒具有特异定量分析牛乳中乳铁蛋白的作用。乳铁蛋白的浓缩奶样品用去离子 水 1 2 稀释， 以符合试剂盒的浓度检测范围 (250 到 1000g/mL)。准确地将 5L 稀释的 样品移入免疫双扩散凝胶板的样品孔中， 盖上板盖， 放入干燥器中， 37孵育 48 h。乳铁蛋 白在凝胶中浸润扩散， 与乳铁蛋白抗体反应， 形成一清晰的晕圈， 晕圈大小与乳铁蛋白的浓 度相关。 根据Sigma-Aldrich说明书调整标准品的浓度， 绘制乳铁蛋白的浓度标准曲线。。
37、 根 据标准曲线计算样品中乳铁蛋白的含量。 标准溶液的浓度分别为250， 500， 750and1000g/ mL。 晕圈直径大小测量的准确与否是乳铁蛋白含量测定关键的一步。 因此， 将孵育的凝胶板 放在扫描仪 (HP Scanjet) 进行图像扫描， 使用画笔软件在最高倍下对扫描图像进行分析。 根据晕圈直径像素的多少确定直径的长度。 0036 按照上述方法测定， 得每 100ml 脱脂奶当中含有大豆异黄酮 115mg， 硫酸软骨素 483mg， 氨基葡萄糖硫酸钠 598mg， 乳铁蛋白 248mg， 肌酸 699mg。 0037 实施例 2 0038 将 10L 脱脂奶进行巴氏灭菌处理， 然。
38、后在密闭条件下， 分别加入氨基葡萄糖硫酸 钠 6.25g、 大豆异黄酮 12.0g、 肌酸 72.0g、 硫酸软骨素 50g 和乳铁蛋白 26g， 搅拌混匀， 再经 过 71低温消毒后， 冷却、 罐装。 0039 按照实施例 1 所述方法测定， 每 100ml 脱脂奶当中含有大豆异黄酮 119mg， 硫酸软 骨素 281mg， 氨基葡萄糖硫酸钠 615mg， 乳铁蛋白 261mg， 肌酸 719mg。与实施例 1 相比， 说明 不同低温消毒的温度不同， 其产品中各有效成分的浓度不同。 0040 实施例 3 0041 将脱脂奶 10L 进行巴氏灭菌处理， 然后在密闭条件下， 加入氨基葡萄糖硫酸钠。
39、 8.25g、 大豆异黄酮15.6g、 肌酸93.6g、 硫酸软骨素65g和乳铁蛋白33.8g， 搅拌， 超声波均质 混匀， 再经过 76低温消毒后， 冷却、 罐装。 0042 按照实施例 1 所述方法测定， 每 100ml 脱脂奶当中含有大豆异黄酮 122mg， 硫酸软 骨素 610mg， 氨基葡萄糖硫酸钠 631mg， 乳铁蛋白 266mg， 肌酸 731mg。 0043 实施例 4 0044 将脱脂牛奶 10L 进行巴氏灭菌处理， 然后在密闭条件下， 加入氨基葡萄糖硫酸钠 8.25g、 大豆异黄酮15.6g、 肌酸93.6g、 硫酸软骨素65g和乳铁蛋白33.8g， 搅拌， 超声波均质 混匀， 再经过 71低温消毒， 冷却、 罐装。 0045 按照实施例 1 所述方法测定， 每 100ml 脱脂奶当中含有大豆异黄酮 139mg， 硫酸软 骨素 627mg， 氨基葡萄糖硫酸钠 781mg， 乳铁蛋白 292mg， 肌酸 843mg。 说 明 书 。