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1、(10)申请公布号 CN 103202226 A (43)申请公布日 2013.07.17 CN 103202226 A *CN103202226A* (21)申请号 201310090101.8 (22)申请日 2013.03.20 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 湖北省农业科学院经济作物研究所 地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖瑶苑 特 1 号 (72)发明人 邓晓辉 邱正明 聂启军 朱凤娟 姚明华 戴照义 吴金平 郭凤领 李金泉 王飞 王运强 李宁 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 胡镇西 (54) 发明名称 白菜组培。
2、苗快速高效生根方法 (57) 摘要 本发明公开了一种白菜组培苗快速高效生根 方法， 它包含以下步骤 ：（1） 配制适宜的生根培养 基 ；（2） 接种 ；（3） 培养 ；（4） 炼苗移栽。本发明确 定了快速高效生根的培养基成分及其浓度， 该方 法通过选择合适的生根培养基， 建立了一种高效 的白菜组培苗的生根体系， 具有操作简单、 成本低 廉、 稳定高效， 大大提高组培苗的成活率等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103202226 A CN 1032。
3、02226 A *CN103202226A* 1/1 页 2 1. 一种白菜组培苗快速高效生根方法， 依次包括配制生根培养基、 接种、 培养和炼苗移 栽的过程， 其特征在于 ： （1） 配制生根培养基 ： 将常规 MS 培养基中的大量元素含量减半、 微量元素及其他成份 含量不变， 作为基本培养基 ； 向基本培养基中添加琼脂、 蔗糖、 萘乙酸、 吲哚乙酸和去离子 水， 混合配制成培养液 ； 然后将培养液倒入盛装有珍珠岩颗粒的培养瓶中， 使珍珠岩颗粒能 够被培养液完全浸透而无过剩溶液溢出 ； 再对其进行湿热灭菌处理， 自然冷却形成生根培 养基， 且在生根培养基中如下组份的质量体积比控制在琼脂 13。
4、g/L、 蔗糖 2830g/L、 萘乙 酸 0.050.15mg/L、 吲哚乙酸 0.010.05mg/L、 珍珠岩颗粒 80120g/L ； （2） 接种 ： 在培养瓶中的培养基上插出小洞， 将白菜组培苗切下的带有叶片的茎尖基部 放入小洞中， 用旁边的培养基填实茎尖基部空隙 ； （3） 培养 ： 将接种好的培养瓶放在培养室内进行生根培养 ； （4） 炼苗移栽 ： 生根培养 212 天后， 将培养瓶置于室内靠窗处， 于自然条件下炼苗， 使 白菜组培苗逐渐适应外部环境， 炼苗后将苗从瓶中取出用流水冲洗净根上的含糖培养基 质后定植。 2. 根据权利要求 1 所述的白菜组培苗快速高效生根方法， 其特。
5、征在于 ： 所述步骤 （1） 中， 选用珍珠岩颗粒的粒径为 35mm ； 控制湿热灭菌温度为 121、 时间为 15min。 3. 根据权利要求 1 所述的白菜组培苗快速高效生根方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中， 在培养瓶中的培养基上插出有 23 个小洞， 其大小恰好能放进白菜组培苗茎尖基部， 白 菜组培苗茎尖基部带有 23 片叶。 4. 根据权利要求 1 所述的白菜组培苗快速高效生根方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中， 生根培养的条件为温度 （252）、 光照强度 （2500150） Lx、 光照时间 （143） h。 5. 根据权利要求 1 所述的白菜组培苗快速高效生。
6、根方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （4） 中， 炼苗时间为不松膜炼苗 2d、 松膜炼苗 2d， 揭开封口膜炼苗 3d。 权 利 要 求 书 CN 103202226 A 2 1/5 页 3 白菜组培苗快速高效生根方法 技术领域 0001 本发明涉及白菜组培苗快速高效生根技术， 具体是指一种白菜组培苗快速高效生 根方法。 背景技术 0002 组织培养是扩繁速度较快的繁殖方法， 组培苗生根是组织培养的重要环节， 组培 苗生根数量和质量是直接关系到组培苗移栽成活的关键 ； 将组培苗从培养瓶中移出时， 组 培苗根部附着的含糖培养基质能否在不伤根的前提下快速高效与根系分离是组培苗用于 大量生产的重要条。
7、件。 0003 固化剂在培养基中起固定支撑作用， 植物组培传统上多以琼脂作为固化剂， 卡拉 胶因具有良好的凝固性且价格相对便宜、 配制出来的培养基比较透明、 使用方法简单等优 点， 也广泛应用于植物组织培养， 杜雪玲等 （2006） 研究发现进口植物凝胶 （phytagel） 是更 好的固化剂， 但价格昂贵。 0004 目前白菜组培苗的生根研究主要集中在激素种类组合筛选和浓度增减上， 对生根 培养基固化剂的筛选未见报导， 都是以琼脂、 卡那胶等作为固化剂。 以琼脂等作为白菜生根 培养基的固化剂时， 由于固体琼脂培养基很紧密地附着在组培苗根的表面， 很难用水洗净。 如不将根上附着的培养基洗净， 。
8、则因培养基中含有蔗糖或白糖， 很容易使根发霉腐烂， 降低 组培苗的成活率 ； 要洗净则又很容易损伤根系， 也降低组培苗的成活率， 且费工费时。生产 上迫切需要一种既能对外植体起到支撑作用， 利于生根， 又容易洗脱的生根培养基。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种白菜组培苗快速高效生根方法， 与目前通用的方法相 比， 避免了生根中分枝根不多、 附着在根上的培养基不易洗脱的弊端， 利用珍珠岩和少量琼 脂作为培养基中的固体支撑物， 生根质量好、 洗脱速度快， 价格便宜， 能节省大量人力物力 ； 且确定了生根培养基中适宜的琼脂浓度、 珍珠岩的用量， 以及激素的种类和浓度。 0006 为实现上述。
9、目的， 本发明提供的白菜组培苗快速高效生根方法， 依次包括配制生 根培养基、 接种、 培养和炼苗移栽的过程， 其特征在于 ： 0007 （1） 配制生根培养基 ： 将常规 MS 培养基中的大量元素含量减半、 微量元素及其他 成份含量不变， 作为基本培养基 ； 向基本培养基中添加琼脂、 蔗糖、 萘乙酸、 吲哚乙酸和去离 子水， 混合配制成培养液 ； 然后将培养液倒入盛装有珍珠岩颗粒的培养瓶中， 使珍珠岩颗粒 能够被培养液完全浸透而无过剩溶液溢出 ； 再对其进行湿热灭菌处理， 自然冷却形成生根 培养基， 且在生根培养基中如下组份的质量体积比控制在琼脂 13g/L、 蔗糖 2830g/L、 萘 乙酸。
10、 0.050.15mg/L、 吲哚乙酸 0.010.05mg/L、 珍珠岩颗粒 80120g/L ； 0008 （2） 接种 ： 在培养瓶中的培养基上插出小洞， 将白菜组培苗切下的带有叶片的茎尖 基部放入小洞中， 用旁边的培养基填实茎尖基部空隙 ； 0009 （3） 培养 ： 将接种好的培养瓶放在培养室内进行生根培养 ； 说 明 书 CN 103202226 A 3 2/5 页 4 0010 （4） 炼苗移栽 ： 生根培养 212 天后， 将培养瓶置于室内靠窗处， 于自然条件下炼 苗， 使白菜组培苗逐渐适应外部环境， 炼苗后将苗从瓶中取出 用流水冲洗净根上的含糖培 养基质后定植。 0011 作。
11、为优选方案， 所述步骤 （1） 中， 选用珍珠岩颗粒的粒径为 35mm ； 控制湿热灭菌 温度为 121、 时间为 15min。 0012 作为优选方案， 所述步骤 （2） 中， 在培养瓶中的培养基上插出 23 个小洞， 其大小 恰好能放进白菜组培苗茎尖基部， 白菜组培苗茎尖基部带有 23 片叶。 0013 作为优选方案， 所述步骤 （3） 中， 生根培养的条件为温度 （252）、 光照强度 （2500150） Lx、 光照时间 （143） h。 0014 作为优选方案， 所述步骤 （4） 中， 炼苗时间为不松膜炼苗 2d、 松膜炼苗 2d， 揭开封 口膜炼苗 3d。 0015 本发明的优点在。
12、于 ： 0016 其一， 按步骤进行生根的方法与传统生根培养基相比， 产生根的侧根数量多， 根的 质量较好。 0017 其二， 确定了用珍珠岩和适当浓度的琼脂相配合作为外植体的支撑物， 在移栽时 培养基容易从根上洗脱， 洗脱速度快， 不损伤根系， 提高了组培苗移栽成活率， 用珍珠岩代 替大部分琼脂， 清洗效率高， 节省了大量人力物力， 使培养成本降低。 具体实施方式 0018 以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。 0019 供试材料 ： 0020 供试的白菜为兔耳白白菜 （为普通的青梗菜， 市场有销售， 公众可轻易获得） 、 上海 青小白菜和红菜薹组培无根苗。 0021 生根培养基材。
13、料 ： 琼脂、 蔗糖、 1/2MS、 珍珠岩 （粒度 3 5mm） 、 萘乙酸、 吲哚乙酸、 去 离子水。 0022 1/2MS 培养基就是大量元素母液减半， MS 是我们常用的基本培养基， 其无机盐与 离子的浓度较高， 是较为稳定的平衡培养液， 但是硝酸盐含量较高， 被广泛的用于器官、 花 药、 细胞核原生质体培养。而 1/2MS 是将 MS 的大量元素减半其他不变而配置的培养基， 这 主要是降低无机盐浓度， 作用和 MS 大致相同， 只是适合不同植物不同要求而已。 0023 萘乙酸 0024 英文通用名1-naphthlcetic acid， 其他名称 a-萘乙酸。 萘乙酸毒性对人畜低毒。。
14、 大鼠急性口服 LD50 为 1000-5900mg/kg， 对皮肤和粘膜有刺激作用。 0025 萘乙酸是广谱型植物生长调节剂， 能促进细胞分裂与扩大， 诱导不定根形成， 增加 坐果， 防止落果， 改变雌、 雄花比率等。 可经叶片、 树枝的嫩表皮、 种子进入到植株内， 随营养 流输导到全株。 适用于谷类作物， 增加分蘖， 提高成穗率和千粒重 ； 棉花减少蕾铃脱落， 增桃 增重， 提高质量。果树促开花， 防落果、 催熟增产。瓜果类蔬菜防止落花， 形成小籽果实 ； 促 进扦插枝条生根等。萘乙酸在植物组培中很是常用， 用于诱导细胞分裂和根的分化。 0026 吲哚乙酸 0027 又名吲哚 -3- 乙酸。
15、， 英文通用名 indole-3-acetic acid， 是一种能调节植物生长 说 明 书 CN 103202226 A 4 3/5 页 5 和发育的植物激素。 0028 吲哚乙酸是一种有机物。 纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末。 遇光后变成玫瑰色。 熔点 165-166（168-170） 。易溶于无水乙醇、 醋酸乙酯、 二氯乙烷， 可溶于乙醚和丙酮， 不溶于苯、 甲苯、 汽油及氯仿。不溶于水， 其水溶液能被紫外光分解， 但对可见光稳定。其钠 盐、 钾盐比酸本身稳定， 极易溶于水。易脱羧成 3- 甲基吲哚 （粪臭素） 。在组织培养中， 被用 于诱导细胞的分裂和根的分化。 0029 实施例一 ：。
16、 0030 无根组培苗为上海青白菜组培芽苗。以将 MS 培养基的大量元素减半的培养基为 基本培养基， 添加 ： 琼脂 1g/L、 蔗糖 28g/L、 珍珠岩 （粒度 3mm） 80g/L、 萘乙酸 0.05mg/L、 吲哚 乙酸 0.01mg/L、 去离子水。先在培养瓶中加入 4g 洗净凉干的珍珠岩， 然后添加 50ml 培养 液， 121湿热灭菌 15 分钟， 自然冷却备用。 0031 先用镊子在培养瓶中的培养基上插出 3 个小洞， 大小以放进外植体茎尖基部为 宜， 将 3 个带有 2 片叶的茎尖基部放入小洞中， 用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然 后将接种好的玻璃瓶放在培养室进行生根培。
17、养， 培养条件为 ： 温度 25、 光照强度 2500Lx、 光照时间 14 小时。培养 21 天后统计根的数量和质量。一级根数目为直接着生在组培苗基 部的根的数量， 二级根为一级根上长出根， 三级根为二级根上着生的根， 以根白色、 根粗短 且多为好， 多、 细为较好， 颜色发暗、 少、 细且长的为差。 0032 生根培养后组培苗的一级根、 二三级根数目分别为 3.05 和 42.25 条 / 株， 根质量 好。组培苗根上的含糖培养基清洗速度为 1.0 株 / 分钟， 移栽成活率为 99%。 0033 实施例二 ： 0034 无根组培苗为免耳白小白菜组培芽苗。以将 MS 培养基的大量元素减半的。
18、培养基 为基本培养基， 添加 ： 琼脂 2.0g/L、 蔗糖 29g/L、 珍珠岩 （粒度 4mm） 100g/L、 萘乙酸 0.1mg/L、 吲哚乙酸0.03mg/L、 去离子水。 先在培养瓶中加入5g洗净凉干的珍珠岩， 然后添加50ml培 养液， 121湿热灭菌 15 分钟， 自然冷却备用。 0035 先用镊子在培养基上插出2个小洞， 大小以放进外植体茎尖基部为宜， 将2个带有 3 片叶的茎尖基部放入小洞中， 用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然后将接种好的 玻璃瓶放在培养室进行生根培养， 培养条件为 ： 温度25、 光照强度2500Lx、 光照时间14小 时。培养 22 天后统计根的数。
19、量和质量。一级根数目为直接着生在组培苗基部的根的数量， 二级根为一级根上长出根， 三级根为二级根上生的根， 以根白色、 根粗短且多为好， 多、 细为 较好， 颜色发暗、 少、 细且长的为差。 0036 生根培养后组培苗的一级根、 二三级根数目分别为 3.58 和 43.78 条 / 株， 一级根 粗壮， 二级、 三级根多。组培苗根上的含糖培养基清洗速度为 1.2 株 / 分钟， 移栽成活率为 99.2%。 0037 实施例三 ： 0038 无根组培苗为红菜薹组培芽苗。以将 MS 培养基的大量元素减半的培养基为基本 培养基， 添加 ： 琼脂 3.0g/L、 蔗糖 30.0g/L、 珍珠岩 （粒度。
20、 5mm） 120g/L、 萘乙酸 0.15mg/L、 吲 哚乙酸0.05mg/L、 去离子水。 先在培养瓶中加入6g洗净凉干的珍珠岩， 然后添加50ml培养 液， 121湿热灭菌 15 分钟， 自然冷却备用。 0039 先用镊子在培养基上插出3个小洞， 大小以放进外植体茎尖基部为宜， 将3个带有 说 明 书 CN 103202226 A 5 4/5 页 6 2 片叶的茎尖基部放入小洞中， 用周边的培养基填实茎尖基部空隙即可。然后将接种好的 玻璃瓶放在培养室进行生根培养， 培养条件为 ： 温度25、 光照强度2500Lx、 光照时间14小 时。培养 23 天后统计根的数量和质量。一级根数目为直。
21、接着生在组培苗基部的根的数量， 二级根为一级根上长出根， 三级根为二级根上生的根， 以根白色、 根粗短且多为好， 多、 细为 较好， 颜色发暗、 少、 细且长的为差。以纯琼脂作为固化剂的普通培养基 （MS 培养基 + 琼脂 7.5g/L、 蔗糖 27/L、 萘乙酸 0.03mg/L） 为对照。 0040 数据处理 ： 0041 所有数据均采用 SPSS11.5（LSD， p0.05） 进行统计分析处理。 0042 结果与分析 ： 0043 不同培养基对生根数量和质量的影响 0044 表一、 不同生根培养基生根数量和质量统计表 0045 0046 注 ： 同一列小写字母表示 0.05 水平的差异。
22、， 字母相同者差异不显著。 0047 表一显示， 用纯琼脂作为固化剂的生根培养基的一级根、 二、 三级根数目分别为 2.15 和 23.6 条 / 株， 而用本发明的培养基分别为 3.05 和 41.62 条 / 株， 显著高于前者， 而 且后者根质量为好等次。 0048 不同生根培养基培养的试管苗的培养基清洗速度和成活率 0049 表二、 不同生根培养基的试管苗培养基清洗速度和成活率统计表 0050 0051 注 ： 同一列小写字母表示 0.05 水平的差异， 字母相同者差异不显著。 0052 表二显示， 用纯琼脂作为固化剂的普通培养基培养的试管苗根上的含糖培养基清 说 明 书 CN 103。
23、202226 A 6 5/5 页 7 洗速度为 0.3 株 / 分钟， 成活率为 85%， 而用本发明的培养基培养的分别为 1.4 株 / 分钟和 97.8%， 显著高于前者。 0053 结论 ： 0054 研究结果表明， 用纯琼脂作为固化剂的普通培养基培养试管苗生根的数量和质 量、 根上含糖培养基清洗速度和定植成活率与本发明的培养基培养的存在显著差异， 后者 显著好于前者。含糖培养基清洗速度提高使该方法成本大为降低， 而且试管苗成活率提高 了 12.8%， 这为白菜组培技术在生产上大规模应用打下了坚实的基础。 0055 3 个实施例表明， 用本生根培养基培养的组培苗根的数量和质量、 根上含糖培养基 清洗速度和定植成活率都很高。含糖培养基清洗速度提高节约了大量劳动力， 在现在劳动 力成本快速增长的情况下特别有意义， 另外用珍珠岩代替部分琼脂也降低了培养基成本， 使组培苗生产成本大为降低， 而且组培苗成活率得到了提高， 这为白菜组培技术在生产上 大规模应用打下了坚实的基础。 说 明 书 CN 103202226 A 7 。