技术领域
本发明涉及畜牧业生产领域，特别涉及动物营养领域，更特别地涉及反 刍动物营养补充剂和添加剂的应用，确切地涉及用氢化油包封的硝酸盐和硫 酸盐的应用，用于减少瘤胃甲烷排放，缓释瘤胃中的活性化合物，使它们的 完整代谢最大化并减少动物中毒的风险。
背景技术
温室气体（GHG），主要是二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）和一氧化二 氮（N2O），可以吸收由地球表面发出的部分红外线辐射，该吸收可妨碍红外 线辐射向太空中消散。然而，该吸收过程对维持地球生命是必要的，因为该 过程可阻止过多的热量损失，保持地球温暖。
然而，GHG浓度的增加放大了该自然现象，从而引起了全球平均温度升 高，即为全球变暖过程。
考虑到未来几年工业化进程和世界人口呈现增加的趋势，农业部门已经 被迫在GHG排放方面变的更为有效率。
与二氧化碳半衰期（150年）和一氧化二氮半衰期（150年）相比，甲烷 的半衰期（10年）较短，所以甲烷减排在实现源于GHG减排的积极的短期 气候效应中发挥着至关重要的作用。
在巴西，由肠道发酵产生的甲烷约占人类活动产生的总CO2-eq（二氧化 碳当量）的12%。在这个数据中，瘤胃发酵产生的二氧化碳占90%。只考虑 农业部门，肠道发酵产生的二氧化碳占巴西农业CO2-eq排放量的53%。从全 球范围来看，由反刍动物产生的甲烷占人类活动产生的甲烷总量的22％左右。
甲烷是瘤胃中的微生物在发酵过程中自然产生的，瘤胃即反刍动物的第 一个胃-一个厌氧发酵腔室，里面共同生活着不同种类的微生物，如细菌、原 生动物、真菌、噬菌体等。虽然甲烷生成一直被认为是动物的能量损失，占 摄入的总能量的5-12％，但甲烷生成对于维持微生物作用是必不可少的。
甲烷是由产甲烷古菌（methanogenic Archaea）产生的，产甲烷古菌是消 耗CO2和H2作为产生能量的底物并产生甲烷作为终产物的一个微生物种群。 在瘤胃中，甲烷的产生对于保持低的氢分压（hydrogen pressure）是必要的， 而低氢压对于负责饲料降解的微生物发酵过程是必要的，饲料降解主要是纤 维素、半纤维素、淀粉、糖类、蛋白质、肽、氨基酸等。
瘤胃的种间氢转移（ruminal interspecies hydrogen transfer）被定义为古菌 消耗其他瘤胃微生物代谢活动所产生的氢气的过程。当氢不能以甲烷方式从 瘤胃中排出时，氢分压就会增加，从而整体抑制微生物发酵。
例如，奶牛每天产生约500L的CH4，大约相当于每天357g。巴西研究确 定，牧场的奶牛每天生产大约378-403g的甲烷。
一般来说，甲烷减排有两种方式：
a)刺激能够与甲烷生成竞争的代谢途径，例如利用产乙酸微生物、有机 酸（苹果酸、延胡索酸等）和氢受体（过氧化氢、硝酸盐、硫酸盐等）；
b)减少瘤胃产氢，例如使用离子载体（如莫能菌素钠）、精油和植物次 生化合物。
除了前面提到的技术，其他可能的减少瘤胃甲烷生成的策略有驱除原虫 （消除或减少原生动物），活酵母接种，通过免疫或疫苗接种以控制古菌数 量，和营养策略，诸如在日粮（diet）中补充脂肪和增加浓缩饲料（如谷物）。
到目前为止，所有甲烷减排技术都存在局限性。其中一些只有随着时间 推移而消失的短暂效果（如精油、单宁、莫能菌素、疫苗等），而另外一些 显示出易变的效果（如精油、单宁、皂甙、疫苗等）。此外，有些物质对动 物有毒（例如用于消除原生动物的化学物质，氯仿和高剂量的不受保护的和 现成的硝酸盐），由于成本高（如有机酸）或者被禁止使用（例如在欧洲地 区禁用诸如莫能菌素钠、盐霉素和拉沙里菌素钠的离子载体）而导致不可行 的物质。最后，一些技术处于初期，例如疫苗接种、免疫和产乙酸微生物内 含物。
与CO2相比，硝酸盐（NO3-）对H2有较高的亲和力，使硝酸盐-还原微生 物与产甲烷古菌竞争底物。硝酸盐还原成亚硝酸盐（式1）及亚硝酸盐进一步 还原为铵盐（式2），比CO2还原为甲烷（式3）能产生更多的能量。相对于 产甲烷古菌，这种更大的能量产生对利用硝酸盐的微生物提供了一个竞争优 势。
NO3-+2H+→H2O+NO2-(式1;ΔG0=-130kJ/mol氢)
NO2-+4H2→NH4++2H2O(式2;ΔG0=-124kJ/mol氢)
CO2+4H2→CH4+2H2O(式3;ΔG0=-16.9kJ/mol氢)
根据式1和式2，每摩尔硝酸盐还原为铵盐就能减少1摩尔甲烷的生成。 此外，与尿素类似，源于硝酸盐代谢产生的氨可作为微生物蛋白质合成的N 的来源。因此，存在一种利用硝酸盐作为非蛋白氮（NPN）同时作为抗产甲 烷剂的可能。其结果是，反刍动物日粮配方中通常用作NPN源的尿素或真正 的蛋白质来源（大豆粉、棉籽粕等）可被硝酸盐替代，将营养和抗-产甲烷的 潜能结合用于日粮中。
研究表明，当使用未受保护的（无涂层）硝酸盐来源时，瘤胃发酵产生 的甲烷减少了46.6％。
没有预先适应而饲喂硝酸盐-突然饲喂硝酸盐-对包括反刍动物在内的动 物来说是有毒性的，可引起一种名为高铁血红蛋白症的疾病。这种疾病在本 领域中是公认的，例如当动物摄取硝酸盐含量高的饮用水或饲喂来自温带气 候草料时，可观察得到，其体内积累高浓度的硝酸盐。
一旦被摄入，硝酸盐即被瘤胃微生物代谢成它的中间化合物亚硝酸盐（式 1）。通过第二个反应，亚硝酸盐继续被还原为铵盐（式2）。使亚硝酸盐形 成的第一个还原反应以快于消耗亚硝酸盐的反应的速度发生。其结果是产生 了瘤胃亚硝酸盐的积累，亚硝酸盐对动物来说是有毒化合物。亚硝酸盐很容 易被消化道壁吸收，进入血液循环，将亚铁（Fe2+）形式的血红蛋白转化成高 铁（Fe3+）形式。高铁血红蛋白不能将氧输送到组织中，导致缺氧症-O2匮乏 引起死亡。一般情况下，症状是快速的脉率和呼吸速率增加，随之而来的是 肌肉震颤和全身无力。由于缺氧，眼睛、嘴和鼻子的细胞膜颜色变暗，血液 也显示褐色或“巧克力”的色素沉着。极端情况下会发生死亡。长远来看， 这种疾病导致性能损失（牛奶产量、体重增加和羊毛产量都降低）。
已经证实，反刍动物逐渐适应硝酸盐可使硝酸盐还原微生物的活性提高， 主要有反刍月形单胞菌乳酸分解亚种（Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica）、小韦荣球菌（Veillonella parvula）、产琥珀酸沃廉菌（Wolinella succinogenes）和埃氏巨球型菌（Megasphaera elsdenii），从而降低亚硝酸盐 积累的风险。然而，动物对硝酸盐的适应给反刍动物生产系统带来了一些的 实用性和可操作性的问题。饮食习惯的改变使动物紧张，降低动物在此期间 的生产潜力。此外，由于操作者在准备动物饲料配给和饲喂动物期间引起的 失误和错误，适应阶段存在潜在的危险。
与硝酸盐相似，硫酸盐还原为氢硫酸（H2S）是一种吸收氢和减少瘤胃产 甲烷的替代方法（式4）。在瘤胃中，与产甲烷古菌类似，硫酸盐还原细菌利 用氢气来生长。因此，刺激硫酸盐利用微生物的生长是减少甲烷的一个策略， 从而增强了氢气消耗这一替代途径。
硫酸盐还原产生的能量（ΔG0=-152kJ）比甲烷生成产生的能量（ΔG0= -131kJ）高，使得这种替代的代谢途径可与甲烷生成竞争。
SO42-+4H2+2H+→H2S+4H2O(式4)
硫源的使用对将硝酸盐中毒的风险降至最低是特别重要的。硫被还原成 H2S，H2S可作为亚硝酸盐还原成铵盐反应中的氢供体。因此，亚硝酸盐积累 较少意味着中毒的风险较低。科学界广泛知晓，硫化合物能够减少硝酸盐中 毒的风险。
因此，人们意识到本领域中存在动物营养与可减少甲烷排放量而不会对 动物有害（如中毒的风险）的产品、应用和使用方便、不需要高投资或复杂 的流程之间的差距。
基于这一点以及对产品不断开发的思考，提出了如下创新，因其具有新 颖性和创造性，现要求对其进行保护。因此，提出了一种包封的、颗粒形式 的营养添加剂，从而使硝酸盐和硫酸盐缓释，并提出了其组成上的各种变形。
由于甲烷减排的原因，使用硝酸盐和硫酸盐来加工本发明的颗粒或它们 的各种变形，以及添加剂，或类似组合物，使用能够降低释放速率并使这些 这些盐在瘤胃环境中溶解的植物油对其进行涂覆/包封，目的是避免动物中毒 和促进瘤胃中硝酸盐和硫酸盐的完整代谢。
同样地，除了采用植物油涂覆之外，可以使用其他与动物营养学相容、 显示出与上述油在促进物质控释方面具有相同或类似属性的材料。一些可在 瘤胃中可降解或不可降解的天然材料是适合的，如纤维素和羧基纤维素基乳 剂（例如加入了碳酸钙、植物油、蔗糖和黄原胶），含有与聚乙烯醇混合的 淀粉和其它多糖的涂层，以及含有木质素/木素磺酸盐或壳聚糖生物聚合物的 涂层。可选地，涂层也可以由在瘤胃中降解或不能降解的合成聚合物组成， 如羧乙烯聚合物，聚丙烯酸（丙烯酸树脂、聚乙烯等），海藻酸盐，聚羟基 脂肪酸酯，聚羟基辛酸酯，聚羟基丁酸酯（可降解塑料（Biopols）），聚己 内酯，聚乳酸，缩二脲与尿烷和桐油（tungue oil）的溶液，异氰酸酯与醇酸 树脂（alkydic resins）、蓖麻油和过氧化物的混合物，硬脂酰胺与石蜡、硬脂 酸镁的混合物，其他树脂（聚氨酯、聚烯烃、聚酯、聚环氧化物、聚硅酮、 聚偏二氯乙烯等，及其混合物），烷基和环烷基胺，来自石油的石蜡和蜡。
用于包封的油脂中，这里提到有大豆油、蓖麻油、棕榈油、腰果壳油或 腰果壳液、棉子油、亚麻仁油、花生油、巴巴苏油、葵花子油、椰子油、菜 籽油、小麦油、大米油、玉米油、可可油、红花油和蜡（来自植物源或动物 源），如巴西棕榈蜡、玉米蜡、蓖麻蜡和蜂蜡。在熔点、可塑性、蜡状特性 以及抗冲击性和耐磨性方面，为了带来诸如功能性脂肪酸所提供的优点，这 里并不排除只使用一种脂肪源，也不排除使用两个或两个以上的脂肪源的组 合。
相关技术分析
专利WO010921利用可与甲烷生成竞争的试剂，在摄入饲料正常发酵期 间，通过氢原子减少反刍动物肠道甲烷生成。本发明提供了一种产品，其含 有基于硝酸盐的化合物和基于硫酸盐的化合物的组合物，可选地含有用于还 原亚硝酸盐的益生菌微生物，并提供了使用这些组合物减少反刍动物肠道甲 烷生成的方法。这种方法没有考虑硝酸盐和硫酸盐用于瘤胃缓慢释放的保护、 涂覆和包封，与本发明的目的不相关。
专利US6231895涉及为反刍动物提供含有一定水平的非蛋白氮（NPN） 的营养补充剂，可实现在瘤胃培养条件下可控制的和安全的释放氨。换句话 说，该发明提供了一种含有控制释放非蛋白氮的反刍动物营养补充剂，所述 非蛋白氮含有由涂层包封的尿素颗粒，所述涂层由可被瘤胃降解的聚合物制 成。该发明由于没有涉及基于硝酸盐和硫酸盐的补充剂而与本发明的目的不 相关。
WO03068256涉及用于瘤胃发酵效率改进的方法和组合物，提高日粮淀 粉利用效率，避免瘤胃中乳酸浓度有害增加或瘤胃pH值下降，以及促进瘤胃 微生物效益增长。该发明的方法和组合物还包括补充酵母、缓冲剂、离子载 体或其它刺激生长和生产力的试剂。但该发明并未涉及任何基于油脂的涂层， 从而与本发明的目的不相关。
专利PI0608919描述了一个用于制造释放装置的结构元件，所述装置用于 由向反刍动物给予密实材料组成的瘤胃内活性剂，所述活性剂包括铁、石墨 和可选择性加入的铜粉的混合物，以铁、铜和石墨的总重量计，混合物中， 石墨含量为2-7％（重量），铜含量为0-5%（重量），铁含量为88-98%（重 量）。可以结合各种结构元件，以实现一个释放装置的结构统一。该专利描 述了一种用于组合物在瘤胃中缓慢释放的装置，没有涉及组合物中硝酸盐的 使用和包封方法，因此与本发明的目的不相关。
专利PI0305047涉及一种主要由巴巴苏坚果淀粉原料组成的反刍动物口 粮，该组合物含有尿素、硫、巴巴苏淀粉和巴巴苏粉的混合物，其比例分别 为30％-60％，1.5％-3.0％，20％-30％和20％-30％。化合物的制备方法包括 巴巴苏坚果的选择、去壳、清洗淀粉类原料、研磨淀粉类原料、制备产品和 热处理。该化合物中，巴巴苏淀粉以胶状涂布以保护NPN，阻止其溶解在水 中。该发明还提供了瘤胃中氨的缓慢释放，因而增加了瘤胃微生物在微生物 蛋白质合成过程中对NPN的利用率。该化合物产品N：S为10:1，除了给反 刍动物提供蛋白质外，还可提供来自淀粉的能量。使用该产品中毒的风险低， 使用量小，可在幼畜补饲系统（creep-feeding system）中喂牛犊。该专利文件 涉及基于淀粉和非硝酸物质的组合物，与本发明的目的不相关。
专利PI9201217提出了一种缓释胶囊，适合于由动物食道引入瘤胃中，在 瘤胃内存在较长时期使胶囊内的生物活性组合物连续释放。该胶囊为长形管 状体，生物活性组合物在管道中，管道末端连接一个端盖，另一末端为分配 器。分配器的末端开口，将组合物释放到瘤胃中。该发明涉及一种胶囊，用 于缓慢而逐步地释放生物活性组合物，没有涉及任何硝酸盐，因此与本发明 的目的不相关。
专利CA2725380描述了一种方法，该方法包括：用于反刍动物饲料的分 配器，以及一种或多种营养补充剂，分配器连接一个位于动物头附近的气体 分析器。该方法通过读取识别RFID耳标来确定是否有特定的反刍动物接近饲 槽（分配器），并释放营养补充剂以减少甲烷。该方法包括一个气体分析仪， 用于确定二氧化碳和甲烷的水平，还包括一个数据处理器，用于在接下来的 喂养中改变下料饲料的种类和量，以控制产量和实现所需的动物表现。该发 明涉及一种喂养设备，与本发明的目的不相关。
专利WO2010071222涉及一种反刍动物瘤胃甲烷排放的抑制剂。确切地 说，是一种以过氧化氢为活性化合物的反刍动物甲烷排放的抑制剂。其创新 之处在于用过氧化物减缓甲烷生成，与本发明的目的不相关。
专利WO2006040537涉及抑制反刍动物甲烷产生和/或改善肉和/或牛奶 产量和质量。特别是，该发明涉及包封的有机酸，特别是富马酸的使用。该 发明还涉及一种反刍动物饲料组合物，通过使用包封的脂肪酸，特别是富马 酸，以用于减少反刍动物甲烷生成。或者，这些用途和组合物也可导致体重 增加和/或牛奶产量增加。该发明涉及包封的有机酸，没有提及硝酸盐，与本 发明不相关。
专利JP2003088301涉及一种组合物，通过口腔给药向反刍动物提供至少 一种选自乳杆菌属（Lactobacillus）的菌株、酵母和低聚糖，从而抑制甲烷生 成且不会使瘤胃环境恶化，其中，所述选自乳杆菌属的菌株是从自然发酵的 绵羊奶衍生产品中获得的。加入硝酸盐可提高对甲烷的抑制效果，乳杆菌和 酵母包括属于毛孢子菌属（Trichosporon）、念珠菌属（Candida）、明串珠菌 属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）的至少一种微生物，且特别地， 低聚糖优选是低聚半乳糖。该发明涉及奶衍生产品用于抑制甲烷生成，没有 提及包封的硝酸盐，与本发明不相关。
专利GB1445560涉及一种组合饲料，补充物，液体饲料补充剂，缓释微 丸，青贮饲料，干草或谷物，其含有异丁醛以及己二酸、戊二酸和丁二酸、 乙酸、甲醛、硫酸或三氧杂环己烷的混合物，用于抑制瘤胃中甲烷生成。使 用这种微丸日粮可以包括大麦、小麦、花生、磨拉石、盐、石灰石、磷酸氢 钙。该发明只涉及动物日粮，与本发明的目的不相关。
发明内容
考虑到本领域的差距，作为一项创新，本发明提供了一种由硝酸盐和硫 酸盐组成的颗粒状的包封营养添加剂，及其组合物。
由于甲烷减排的原因，使用硝酸盐和硫酸盐，并结合添加剂或类似的组 合物来加工本发明的颗粒或它们的其他形式，用氢化植物油重新获得/包封， 用于降低瘤胃环境中硝酸盐和硫酸盐的逐渐释放/溶解，目的是避免动物中毒 和促进瘤胃中硝酸盐和硫酸盐的完整代谢。
同样地，除了可以采用植物油涂覆，还可以使用任何其他与动物营养相 容、显示出与上述油在促进物质控释方面具有相同或类似属性的涂层材料。 一些在瘤胃中可降解或不可降解的天然材料是有用的，如纤维素和羧基纤维 素基乳剂（例如加入碳酸钙、蔗糖、植物油和黄原胶），含有与聚乙烯醇混 合的淀粉和其它多糖的涂层，以及基于木质素/木素磺酸盐或壳聚糖生物聚合 物的涂层。
另外，涂层也可以由在瘤胃中可降解或不可降解的合成聚合物组成，如 羧乙烯聚合物，聚丙烯酸（丙烯酸树脂、聚乙烯等），海藻酸盐，聚羟基脂 肪酸酯，聚羟基辛酸酯，聚羟基丁酸酯（生物降解塑料（Biopols）），聚己 内酯，聚乳酸，缩二脲与尿烷和桐油的溶液，异氰酸酯与醇酸树脂、蓖麻油 和过氧化物的混合物，硬脂酰胺与石蜡、硬脂酸镁的混合物，其他树脂（聚 氨酯、聚烯烃、聚酯、聚环氧化物、聚硅酮、聚偏二氯乙烯等，以及它们的 混合物），烷基胺和环烷基胺，来自石油的石蜡和蜡。除了硝酸盐和硫酸盐 可促进抗甲烷生成，包封还可大大减少硝酸盐中毒的风险，保护动物福利和 健康，从而最大限度地减少中毒损失的风险。在实践中，当使用未包封硝酸 盐时，中毒是有可能发生的。
此外，需要强调的是，在与瘤胃液保留时间（约6至24小时）相匹配的 时间间隔中，包封过程能够释放活性化合物硝酸盐和硫酸盐，从而使这些盐 在瘤胃中完全溶解。
实践中，包封在以下几种情况可带来优势：动物饲养人或从事动物饲养 的人造成的管理上的频繁失误。由于缺乏注意，动物可能会摄入大量的硝酸 盐。日粮的劣质制备、配料称重过程中的失误及它们不适当的混合是本领域 常见的情况，可能会导致动物摄入高水平的硝酸盐。因此，当非适应动物摄 入大量硝酸盐时，包封硝酸盐和硫酸盐可保护动物。总之，包封可确保动物 在硝酸盐过量情况下的安全。
涂覆的硝酸盐和硫酸盐的另一个优势是“饲槽安全”或“饲槽防护”， 这是畜牧部分常用的术语。如果下雨了，并且在露天饲槽中提供了未涂覆的 硝酸盐，那么硝酸盐会快速溶解，因为该盐极易溶解于水中。这种含有高硝 酸盐浓度的水增加了中毒的风险，因为一旦被摄入就可能导致动物中毒和死 亡。因此，涂覆工艺大大延缓了硝酸盐和硫酸盐的溶解，可使动物在上述情 况下保持安全。
涂覆工艺也消除了动物逐渐适应硝酸盐的必要性，实际条件下该适应过 程需要4周左右才能达到适合甲烷减排所需的剂量。对硝酸盐的适应阶段也 会引起管理上的问题，增加了日粮制备和饲喂动物期间所消耗的时间，也使 得整个过程更加复杂，反过来又增加了操作失误的机会。因此，包封的明显 优势是，简化了动物饲喂，并允许直接使用推荐剂量的硝酸盐和硫酸盐而对 动物没有危害。
涂层可使瘤胃缓慢和渐进地释放硝酸盐和硫酸盐，也保证了瘤胃环境中 完整的代谢。这就避免了硝酸盐及其中间化合物-亚硝酸盐-被瘤胃壁吸收，从 而降低它们在血液循环中的浓度。
因此，包封可使硝酸盐完全还原成氨，从而提高甲烷减排的效率。需要 强调的是，如果硝酸盐和/或亚硝酸盐被瘤胃壁吸收，就不会消耗氢，从而降 低了甲烷减排的效率。
此外，包封可减少或消除血液中的硝酸盐和/或亚硝酸盐的循环，避免其 排于尿液或牛奶中。硝酸盐量很大时是地表水和地下水的污染源。虽然正常 情况下牛奶中存在硝酸盐，但高浓度的硝酸盐可能会有潜在的危险，尤其是 一旦被新生儿和儿童摄入，会引起称为高铁血红蛋白症的疾病。
硝酸盐和硫酸盐涂层的另外一个优势是瘤胃中NPN的缓慢释放。氮的逐 步释放可使碳水化合物降解和微生物蛋白质合成同步进行，使NPN适当和完 全氨基化。与此同时，硝酸盐替代传统氮源（如尿素）作为氮源使用，显示 出微生物蛋白质合成最大化的优势，因为硝酸盐还原提供给微生物生长的能 量大于甲烷生成产生的能量。微生物蛋白质合成最大化对动物性能改进是至 关重要的，因为微生物蛋白质是反刍动物营养学中最重要的和最好的蛋白质 来源。除氮外，含有涂覆的硝酸盐和硫酸盐的组合物还可给动物提供硫、钙 和镁。
该产品由硝酸盐，用于涂覆的油和油脂，硫酸盐，和其它添加剂组成， 硝酸盐优选40％-97％，更优选60％-85％；油或油脂涂层优选1％-40％，更 优选3％-20％；硫酸盐优选0%-50％，更优选5％-40％;其它添加剂优选 0%-20％，更优选0.1％-10％。
优选地，可使用硝酸钙和硫酸镁。另外，可以使用类似的盐或不同的硝 酸盐和硫酸盐的组合替代上述盐。
使用的硝酸盐和硫酸盐必须能充分溶于瘤胃液中，被动物接受，从而使 其生理上合适。盐不能含有重金属或有潜在致毒量的其它矿物，同时要符合 监管机构对用于饲养动物的产品提出的要求。一般来说，硝酸盐和硫酸盐为 无机盐。
硝酸钙优选为十水合硝酸铵钙复盐[5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O]，但并不排 除使用其它的盐，如四水合硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]，无水硝酸钙[Ca(NO3)2]， 硝酸镁[Mg(NO3)2·6H2O]，硝酸钠[NaNO3]，硝酸钾[KNO3]，硝酸铵[NH4NO3]， 尿素硝酸钙[Ca(NO3)2·4CO(NH2)2]，硫酸铵和硝酸铵复盐[(NH4)2SO4·3(NH4NO3) 或(NH4)2SO4·2(NH4NO3)]，以及上述盐的其它含结晶水或不含结晶水形式。已 经证明，未涂覆/未受保护的硝酸钙、硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵可减少反刍动 物甲烷排放。
同样地，这里不排除使用硝酸盐混合物，目的在于添加新的属性，或甚 至提高最终产品的减排效果。
优选地，硫酸镁是一水合硫酸镁或无水硫酸镁（MgSO4·1H2O或MgSO4）， 但是不排除使用七水硫酸镁（MgSO4·7H2O），硫酸钠（无水Na2SO4， Na2SO4·7H2O或Na2SO4·10H2O），硫酸铵（(NH4)2SO4），硫酸钾（K2SO4）， 硫酸钙（CaSO4或2CaSO4·1H2O），硫酸锌（无水ZnSO4或ZnSO4·7H2O）， 硫酸亚铁（FeSO4·1H2O，FeSO4·4H2O，FeSO4·5H2O，或FeSO4·7H2O），硫酸 锰（无水MnSO4或MnSO4·4H2O），硫酸铜（无水CuSO4或CuSO4·5H2O）， 以及未提及的上述盐的含有不同数目结晶水或不含结晶水的其它形式。已经 证明硫酸钠和硫酸铜，以及硫酸镁对减少亚硝酸盐在瘤胃中积累和使中毒风 险最小化的效果。
同样地，这里不排除使用硫酸盐或其潜在替代物的混合物，旨在包含其 他属性，或甚至提高最终产品的减排效果。
同样地，在替代硫酸盐时，也不排除使用元素硫，以及硫化物（如 Na2S·9H2O，CaS，ZnS，K2S）和亚硫酸盐（如Na2SO3，K2SO3，CaSO3，MgSO3）。
无论是在体外还是体内，硫化物和亚硫酸盐对减少亚硝酸盐在瘤胃中积 累和最小化中毒风险的效果已经得到证明。最后，也考虑到使用过硫酸盐 （SO2-5）、硫代硫酸盐（S2O2-3）、次硫酸盐（SO2-2）。也可包含L-半胱氨 酸（无水L-半胱氨酸、L-半胱氨酸一水合物和L-半胱氨酸盐酸盐 （chloridrates）），即含氨基酸的硫中的一种，其在减少瘤胃亚硝酸盐积累并 因此在使反刍动物对硝酸盐和/或亚硝酸盐中毒最小化中具有众所周知的性 质。这里不排除使用含有抑制硝酸还原酶特性的金属，如已被证明的钨酸钠 （Na2WO4）。
制剂中的添加剂优选能够将性能聚合到最终产品中，而不会对动物有害， 如天然或人工合成的芳香剂及香料（如谷氨酸一钠、糖精、蔗糖、右旋糖、 葡萄糖、番石榴香精、香草等），抗氧化剂（如维生素C，β-胡萝卜素，BHT- 二叔丁基对甲酚，BHA-丁基羟基苯甲醚），酸味剂（柠檬酸，乙酸，酒石酸， 富马酸，苹果酸），乳化剂/稳定剂（如卵磷脂、黄原胶（xathans）、树胶、 聚山梨醇酯、丙二醇、单硬脂酸酯、单-二-甘油酯等），及增味剂。
重要的是还需要考虑加入抗润湿剂和抗结块剂，用以在储存期间使颗粒 保持干燥，如碳酸钙、淀粉、微晶纤维素、磷酸三钙、二氧化硅/硅酸盐、滑 石粉、高岭土、硬脂酸钙等。
同时，也可包括其它的营养添加剂，目的是使最终组合物具有新的性能， 如大量矿物质，微量矿物质，维生素（如维生素A、维生素B1、维生素B2、 维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B9、维生素B12、 维生素C、维生素D、维生素E、维生素K），精油（香芹酚、丁香酚、百里 酚、肉桂醛、辣椒素、柠檬烯等），有机酸（乳酸、苹果酸、富马酸、天冬 氨酸等），脂肪酸（如CLA-共轭亚油酸；肉豆蔻酸；漆树酸；中链脂肪酸- 癸酸、辛酸、己酸、月桂酸；以及ω-6和ω-3脂肪酸，如α-亚麻酸-ALA；二 十碳五烯酸-EPA；二十二碳六烯酸-DHA；等），氨基酸（主要是诸如半胱氨 酸和蛋氨酸的含硫氨基酸，但还包括组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等），酶（纤维素酶、半纤维素酶、淀 粉酶、果胶酶、木糖酶、β-葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶、其他葡聚糖酶等）， 缓冲剂和碱化剂（碳酸氢钠、碳酸氢三钠、碳酸钙、氧化镁等），酵母（毛 孢子菌属、假丝酵母属、明串珠菌属、乳球菌属、乳酒假丝酵母、酿酒酵母 等），真菌（如米曲霉（Aspergillus oryzeae）和黑曲霉），益生菌和其他活 的微生物（乳酸菌，主要是具有硝酸盐/亚硝酸盐还原活性的微生物，如反刍 月形单胞菌、小韦荣球菌、产琥珀酸沃廉菌、埃氏巨球型菌、丙酸杆菌、大 肠杆菌W3110，和肠道细菌、棒状杆菌型细菌、枯草芽孢杆菌、嗜甲基菌属 和放线菌属）。
该组合物还包含低聚半乳糖（galactoligosaccharides）和/或乳酸链球菌素， 已知具有减少亚硝酸盐积累和亚硝酸盐中毒风险的物质。最后，其他潜在可 用的添加剂为通常在反刍动物营养中使用的抗生素（离子载体-莫能菌素钠、 盐霉素、拉沙里菌素、甲基盐霉素-其他抗生素，如维吉霉素、卑霉素、杆菌 肽、黄霉素，泰乐菌素），具有抗菌性的天然物质（蜂胶、β-酸、α-酸、其 他啤酒花-源的酸（hop-derived acids）、腰果酚、腰果二酚、单宁、皂苷）， 驱虫剂和抗球虫剂（anticcocidials）/球虫抑制药（coccidiostats）。
颗粒优选用植物油涂覆，可使硝酸盐和硫酸盐在瘤胃环境中缓慢和逐渐 地释放/溶解，从而避免动物中毒和实现其在瘤胃中最大限度地完整代谢。
涂层本身具有疏水性，可使硝酸盐/硫酸盐缓慢和逐渐地溶解。颗粒的涂 层可使硝酸盐/硫酸盐释放和还原反应同步进行，避免瘤胃中积累硝酸盐/亚硝 酸盐，从而减少了动物中毒的风险。硝酸盐的逐步释放可使亚硝酸盐还原成 铵盐的速率与硝酸盐还原成亚硝酸盐的速率接近，从而避免瘤胃中积累亚硝 酸盐。另一个优势是，用用于包封的油脂是可生物降解的。脂质被小肠消化， 作为补充脂肪，从而可提供更多的能量。
涂覆时，最终产品的颗粒直径为1.5mm-12mm。硝酸盐/硫酸盐释放速率 范围是每小时1％-30％，更优选每小时5％-25％。最终产品的密度范围0.85 g/cm3-1.15g/cm3，更优选0.90g/cm3-1.10g/cm3。
该产品适用于所有反刍动物，无论是家养的还是野生的物种。例如，牛、 绵羊、山羊、水牛、鹿科动物、骆驼科动物、长颈鹿科动物、羚羊、北美野 牛和牦牛。然而，出于便利性和重要性考虑，这里描述的技术主要适用于家 畜，如牛、绵羊、山羊和羚羊。
这些动物的功能性瘤胃是必要的，但是前反刍动物（pre-ruminant animals），例如新出生的小牛和羔羊，还不能使用功能性瘤胃。此外，该产 品可适用于饲养场的动物以及在草地上放牧的动物。
饲喂时期是不定的，从动物具备功能性瘤胃时起，直到屠宰的那一刻都 要不断饲喂。该产品对甲烷减排具有长期的效果，不会由于长时间的使用而 失去功效。
该产品用于饲料中（由动物自发摄入），如全混合日粮（TMR，动物所 需所有成分的混合物，如粗饲料/草料、浓缩液/谷物杂粮、矿物质补充剂、维 生素补充剂和添加剂），蛋白质补充剂，能量补充剂，蛋白质/能量补充剂， 或矿物质补充剂。一般来说，这些补充剂用于牧场反刍动物，摄入补充量可 高可低，优选高摄入量。高摄入补充量和低摄入补充量是专业人员针对饲料 混合物使用的术语，高摄入量为2g-4g/kg体重，低摄入量为0g-g/kg体重。
除了混合在日粮或补充剂中，硝酸盐和硫酸盐组合物颗粒还可以放在表 面被饲喂，这意味着颗粒可以分散在置于饲槽中的日粮上。只要动物表现出 喜好，也可以考虑分开饲喂。
该产品可在饲喂动物时混入日粮或补充剂中。同样地，该产品可以由饲 料公司和饲料加工厂混入日粮或补充剂，以这种方式可存储很长一段时间。 由于其具有良好的耐磨性，混合过程可以手动和/或使用搅拌机。
涂层可抑制硝酸盐的高吸水性。未包封的硝酸盐与空气和热接触，能吸 收空气中水分而迅速溶解。因此，包封可使产品与日粮或补充剂预混合，从 而延长产品存储期而不会损失最终产品的质量。
此外，含有硝酸盐和硫酸盐的包封的产品可以更均匀的混合。硝酸盐一 般以颗粒形式存在，而硫酸盐是一种粉盐。粒度和密度变化可引起在运输和 储存期间与充分的同质化和颗粒分离相关的问题。含有硝酸盐和硫酸盐的包 封产品作为单个颗粒具有使这些问题最小化的优点。
具体实施方式
实施例1
为了证明本发明的效果，进行了体外试验以测量包封的和未包封的硝酸 盐的释放，旨在证明两种油脂包封方法与未包封硝酸盐比较的效果。所用材 料是十水合硝酸铵钙。
这项试验使用如下三种处理：
（1）空白组：未包封硝酸钙；
（2）样品1（Prototype1）：包封硝酸钙；
（3）样品2（Prototype2）：包封硝酸钙。
每个处理重复三次。在每个1L的烧瓶中，将2.482g十水合硝酸铵钙加 入到500ml蒸馏水中。样品的量相当于2.482g纯硝酸铵钙。
在强制循环培养器中，39℃和100rpm下，进行培养。在下述处理时间点 采样：0min、5min、10min、15min和30min，1h、2h、4h、8h、16h、 24h和48h。每次采样5ml。
根据如下方法分析水溶解的硝酸盐：用苯酚二磺酸进行比色法，随后用 氢氧化钠进行碱化。
试验结果如图1（见附件1）所示，显示出与未包封的硝酸盐相比，包封 的硝酸盐溶解较慢。这表明，用油脂包封是有效的，可使硝酸盐在水介质中 缓慢而渐进释放。因此，对硝酸盐颗粒进行涂覆带来了减少动物中毒风险的 优势。
实施例2
该实验的目的是评估两种包封（缓释）的硝酸盐对动物生长、甲烷生成、 瘤胃和血液成分、消化率、氮平衡、微生物N生产、胴体和肉质性状的影响。
该实验在巴西圣保罗州皮拉西卡巴的圣保罗大学农业核能中心的动物营 养实验室（Laboratory of Animal Nutrition,Centre for Nuclear Energy in Agriculture,University ofPaulo,Piracicaba,SP,Brazil）中进行。所有动物 遵循国内环境伦理委员会（Internal Commission for Environment Ethics）和该 机构的动物实验部建议的指南进行处理。
材料和方法
该试验进行了85天，其中，饮食适应21天（从2011年4月27日至2011 年5月17日），生长评估64天（从2011年5月18日至2011年7月20日）。 生长评估期后进行5天消化率试验，与最后一次甲烷测量同时进行。
试验设计和处理。按照6个区和3个处理的随机完全区组设计对18只圣 伊内斯公羊羔（初始体重27.06公斤）进行分配。在实验开始时根据体重（BW） 和年龄进行分区。对动物采用如下日粮处理：空白组-日粮干物质（DM）中 含有1.5％的尿素作为非蛋白氮（NPN）源；NO3enc-日粮干物质（DM）中含 有4.51％的包封硝酸盐用以代替尿素；NO3+CNSLenc-日粮干物质（DM）中 含有4.51％的包封硝酸盐+腰果壳液用以代替尿素。
圈养和饲喂。羊羔被圈养在各个室内围栏中，内设混凝土地板、饲槽和 水杯。实验开始时，给动物驱虫，接种疫苗，并补充注射维生素A、维生素D 和维生素E。
随机给动物饲喂符合NRC（2007）建议的60:40浓缩液:草料的日粮（全 混合日粮）。该组合物和实验日粮的化学分析示于表1。每天喂动物两次（上 午和下午），并随时补充饮用水。
表1：实验日粮的配料和化学组分（％，以干物质为基础）
其中：
——十水合硝酸铵钙（5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O）-83.33%干物质；116.63% CP，以干物质为基础；75.77%NO3-（离子）以干物质为基础。
——七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）-48.78%干物质；20%Mg，以干物质为基 础；26.67%S，以干物质为基础；80%SO42-以干物质为基础。
——包封的产品：86.17%干物质；93.63%CP，以干物质为基础；17.84%Ca 以干物质为基础；61.15%NO3-（离子），以干物质为基础。含有CNSL的包 封产品含有2.96%的CNSL，以干物质为基础。
——尿素-281.25%CP，以干物质为基础。
——CNSL-腰果壳液。
根据前述干物质采食量（DMI）来计算提供给动物的饲料的量，并在需 要时作出调整，以使被拒绝的饲料不超过每日摄入量的10％。每天记录剩余 饲料以确定每日DMI，所剩饲料不会再次提供给动物。每两周，在16小时的 禁食之后，对动物进行称重。
数据收集和分析
使用六个开路循环呼吸室（open-circuit respiration chambers）来评估甲烷 产生（阿卜杜拉等人，2011年）（Abdalla et al.,2011）。18只动物（6个区） 被分为三组，每组（2个区）6只，每组连续两天被放置在室内。甲烷测量重 复3次（实验期的初期、中期和末期），以评估对甲烷排放的持久效果。
在生长周期结束时5天内，进行消化率评估，同时进行最后一次甲烷测 量。动物被放置在新陈代谢板条箱中，该板条箱被设计为可便于分离和收集 粪便和尿液。板条箱配备有饲槽和水杯，并且板条箱被放置在阴凉开放式谷 仓中。
消化期结束后宰杀所有的动物。需要评价的胴体特性有热胴体重（HCW） 和热胴体产量（在屠宰时获得的），冷胴体重，冷胴体产量，冷却后收缩， 第12肋骨处皮下脂肪厚度，肋部眼肌面积（rib-eye area）（在2℃冷却24小 时后获得）。在称重后和收集数据之前，将冷冻胴体分成对称的两个部分， 在第12和第13肋骨之间固定，露出背最长肌（LM）。第12肋脂肪厚度用 外卡钳测量，精确至毫米。暴露的肋眼区放在醋酸纸上，用求积仪测定其面 积，精确至平方厘米。羔羊肉（背最长肌）中硝酸盐和亚硝酸盐由巴西圣保 罗州坎皮纳斯市“食品科技学会”（ITAL）的“肉类科技中心”测定（巴西， 2005a,b）。
甲烷浓度采用配备有型号为Shincarbon ST100/120的微填充柱（外径 1.5875mm，内径1.0mm，长1m；参考编号：19809；贝尔丰特，宾夕法尼亚 州，美国（Resteck,Bellefonte,PA,USA））的气相色谱仪（GC，日本岛津公 司，2014年，东京，日本）（GC,Shimadzu2014,Tokyo,Japan）测定。柱温、 进样器温度和火焰离子化检测器温度分别为60℃、200℃和240℃。载气为10 ml/min的氦气。甲烷浓度用纯甲烷绘制的分析曲线通过外定标法测定（怀 特·马丁斯普莱克斯工业气体公司，奥萨斯科，圣保罗，巴西；甲烷纯度为 995ml/L）（White Martins PRAXAIR Gases Industriais Inc.,Osasco,SP,Brazil; 995ML/L purity）。
每两周，早上饲喂后3小时收集瘤胃液。使用口腔探针收集瘤胃液，等 份试样（aliquots）储存于-20℃，不加防腐剂。根据修改的制造商条件（惠普， 1998年）（Hewlett Packard,1998）采用配备有型号为HP-FFAP的毛细管柱 （19091F-112；外径0.320mm，内径0.50μm，长25m，J＆W安捷伦科技公司， 帕洛阿尔托，加利福尼亚州，欧盟协会（J＆W Agilent Technologies Inc.,Palo Alto,CA,EUA））的气相色谱仪（GC HP7890A，自动注射器HP7683B，安 捷伦科技公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国（Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA））测定短链脂肪酸（SCFA）。用20:1的分流比31.35ml/min 的H2流量（9.20磅/平方英寸）（9.20psi）注射1μL的试样。注射器和FID 温度保持在260℃。烘箱加热斜率为：80℃（1min），120℃（20℃/min，3min）， 205℃（10℃/min，2min），总分析时间为16.5min。1.35ml/min的氢气作 为载气。探测器氢、合成空气、氮气流量（补给）分别保持在40ml/min、400ml/min 和40ml/min。
每两周早上饲喂后6小时采集血液样本到4ml的BD真空采血管 （K2-EDTA，BD，富兰克林湖，新泽西州，美国）（K2-EDTA,BD,Franklin Lakes, NJ,USA）。采血后30分钟内根据佐藤等人（Sato et al.）（2005年）的方法 分析高铁血红蛋白（MetHb）。
结果与讨论
表2显示了干物质摄入量、生长和甲烷产量数据。最终体重、干物质摄 入量、平均日增重（ADG）和饲料转化效率没有受到硝酸盐包封类型的影响。 李等人（Li et al.）（新闻报道）（in press）、范·齐德维尔德等人，（2010 年）（van Zijderveld et al.,2010）和韦音等人（2010）（Huyen et al.,(2010)） 也没有观察到生长差异。
表2：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊的 性能和甲烷产量的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
——Treat.=处理
——BW=体重
——BW0.75=代谢体重
——DMI=干物质摄入量
当用包封的硝酸或包封的硝酸盐+CNSL取代尿素时，甲烷产量（以L/d、 L/kg BW0.75和L/kg DMI表示）降低。加入包封的硝酸盐后再加入CNSL并没 有对甲烷产量产生任何益处。与对照组相比，NO3enc和NO3+CNSLenc的甲烷 排放平均减少了32.3％（以L/kg DMI表示）。其他人也得到了类似的结果， 减少了45％（范·齐德维尔德等人，2010年）（van Zijderveld et al.,2010）， 减少了23％（诺兰等人，2010年）（Nolan et al.,2010），减少了35％（李等 人，新闻报道）(Li et al.,in press)，减少了27％（霍尔索夫等人，新闻报道） (Hulshof et al.,in press)。
表3显示了瘤胃成分数据。与对照组相比，硝酸盐-饲喂处理组的总短链 脂肪酸（SCFA）和醋酸浓度增加。与NO3enc相比，NO3+CNSLenc显示了较高 浓度的总SCFA和醋酸。NO3+CNSLenc显示出高于对照组的丙酸盐和丁酸盐 浓度，而NO3enc的结果处于中间。
这些结果与瘤胃中由硝酸盐还原提供给微生物生长更大的能量一致，可 以支持更大的微生物活动。据我们所知，这一假说一直没有在体内证实，但 已经在体外条件得到证实（郭等人，2009年）（Guo et al.,2009）。其他人得 到了不同的结果，可能是因为投料后瘤胃收集时间不同。李等人（新闻报道） （Li et al.(in press)）和范·齐德维尔德等人（2010年）（van Zijderveld et al., 2010）没有观察到短链脂肪酸浓度的变化，但瘤胃液收集分别是在投料前和 最后一次投料后约24小时进行。一般情况下，体外研究显示出一定的效果一 致性，当硝酸盐用作非蛋白氮源时，醋酸盐增加，丁酸盐减少（郭等人，2009； 周等人，新闻报道）（Guo et al.,2009;Zhou et al.,in press）。
表3：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊的 瘤胃成分的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
——Treat.=处理
——上午投料3小时后收集瘤胃样品
硝酸盐喂养的动物比对照组的氨浓度低。产生这一结果是由于尿素在瘤 胃中迅速水解产生氨。然而，硝酸盐在瘤胃中被还原成亚硝酸盐，接着被还 原成氨。由于瘤胃液在喂饲3小时后收集，所以此时在硝酸盐喂养的羔羊的 瘤胃中观察到较低的氨浓度是合理的。根据上述理由，包封的硝酸盐组和包 封的硝酸盐+腰果壳液组的亚硝酸盐浓度高于对照组。然而，在处理组之间， 硝酸盐浓度没有差异，这是由于硝酸盐进入瘤胃环境时被快速还原成亚硝酸 盐。尽管如此，还需要提到，硝酸盐喂养的动物中亚硝酸盐的浓度与对照组 相比不是很高。这表明包封的硝酸盐对硝酸盐在瘤胃中缓慢释放是有效的， 同时，适应后的瘤胃能够有效地代谢硝酸盐。加入硝酸盐也可减少原生动物 数，这与瘤胃中氨浓度和甲烷产量较低一致。
表4显示血液成分数据。NO3enc组和NO3+CNSLenc组的红血细胞浓度增 加。这可能是由于硝酸盐喂养促使氧运输缺乏，从而引起动物新陈代谢适应。 然而，高铁血红蛋白并没有受到两种类型包封硝酸盐的影响。这表明，包封 对延迟硝酸盐在瘤胃中释放是有效的，而且适应后的瘤胃促进硝酸盐还原成 氨。与对照组相比，NO3enc组和NO3+CNSLenc组具有的类似平均日增重（ADG） 和饲料转化效率，这支持了上述观点。
表4：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊血 液成分的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
——Treat.=处理
——Packed cell volume：=红细胞压积
——上午投料6小时后收集血液样品
血液中硝酸盐不会受到日粮影响，但当喂饲硝酸盐时，亚硝酸盐浓度增 加。发生这种情况是因为N-氧化物主要是以亚硝酸盐的形式被吸收。值得注 意的是，即使血液中亚硝酸盐浓度较高，血液高铁血红蛋白也没有增加。不 同的处理对血浆中的总蛋白、白蛋白和尿素并没有影响。
表5和表6显示了消化率和N-平衡数据。用硝酸盐替代尿素可影响所有 的消化率或N-平衡变量。这些结果表明，硝酸盐可与尿素产生相似的生长速 率，这与本实验中测得的平均日增重和饲料转化效率一致。
表5：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊日 粮消化率的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
——DM=干物质
——OM=有机物质
——CP=粗蛋白质
——NDF=中性洗涤纤维
——ADF=酸性洗涤纤维
——EE=醚提取物
尿中硝酸盐不受NO3enc和NO3+CNSLenc影响，但硝酸盐饲喂处理组的亚 硝酸盐浓度有所增加。这个结果与饲喂硝酸盐后所观察到的血液亚硝酸盐浓 度较大的结果一致。另一方面，当饲喂硝酸盐作为非蛋白氮源时，尿中尿素 含量减少。因此，氮以尿素形式的排泄降低，以亚硝酸盐形式的排泄增加。 尽管如此，不同处理组的N的利用效率没有差别。
表6：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊N 平衡的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
表7显示了微生物生产数据。不同处理组的微生物N供应和微生物生产 效率没有差异。
表7：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊中 嘌呤衍生物的影响和微生物N合成的评估
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——MN=微生物氮
——DOMI=摄入的可消化有机物质
——DOMR=被瘤胃发酵的可消化有机物质
——SEM=平均标准误差
最后，所有的胴体特性、胴体成分以及肉类特性不受饲喂硝酸盐的影响 （表8和表9）。特别地，所有处理组中，羔羊肉中的硝酸钠在检测限以下， 同时所有处理中没有观察到任何残余的亚硝酸钠。因此，当用包封的硝酸盐 饲喂羊羔时，不会使肉中积累硝酸盐或亚硝酸盐。
表8：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊酮 体和肉类特性的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——肋部眼肌面积=背最长区面积，眼肌面积
——冷（热）胴体产量=冷却（热）胴体加工品
——肉中硝酸盐和亚硝酸盐以硝酸钠和亚硝酸钠形式表示。硝酸钠的分析测 量限为<6.155mg/kg鲜肉。
——SEM=平均标准误差
表9：包封的硝酸盐和包封的硝酸盐+腰果壳液对圣伊内斯饲养场羔羊中 第12肋成分的影响
其中：
——NO3enc=包封的硝酸盐
——NO3+CNSLenc=包封的硝酸盐+腰果壳液
——SEM=平均标准误差
参考文献
阿卜杜拉,A.L.，鲁瓦蒂尼,H.，萨拉姆,S.M.A.，布埃诺,I.C.S.，蔡,S.M.，菲 盖拉,A.V.O.用于减少肠道甲烷生成的营养策略的微生物多样性研究、体外 评价及体内量化.热带动物健康和生产，2011(44)：1-12.
（Abdalla,A.L.;Louvandini,H.;Sallam,S.M.A.;Bueno,I.C.S.;Tsai,S.M.; Figueira,A.V.O.In vitro evaluation,in vivo quantification and microbial diversity studies of nuttritional strtegies for reducing enteric methane production.Tropical Animal Health and Production,v.44,p.1-12,2011.）
[理化食品分析方法]，第四版.卫生部卫生监督局，巴西利亚，巴西.517-522 页（硝酸钠方法，284/IV）.
（Brasil.Ministério da Saúde.deSanitária.Métodos físico-químicos para análise de alimentos.4 ed.Brasília,p.517-522(Método Nitrato de sódio,284/IV).）
[理化食品分析方法]，第四版.卫生部卫生监督局，巴西利亚，巴西.515-517 页（硝酸钠方法，283/IV）.
（Brasil.Ministério da Saúde.deSanitária.Métodos físico-químicos para análise de alimentos.4 ed.Brasília,p.515-517(Método Nitrito de sódio,283/IV).）
郭,W.S.，沙佛,D.M.，郭,X.X.，任,L.P.，孟,Q.X..使用硝态氮作为唯一日粮 氮源用于体外抑制瘤胃甲烷生成和提高微生物氮合成.亚洲-澳大利亚动物科 学杂志，2009(22)，4：542–549.
（Guo,W.S.,Schaefer,D.M.,Guo,X.X.,Ren,L.P.,Meng,Q.X.Use of nitrate-nitrogen as a sole dietary nitrogen source to inhibit ruminal methanogenesis and to improve microbial nitrogen synthesis in vitro.Asian-Australian Journal of Animal Science,v.22,n.4,p.542–549,2009.）
惠普公司.使用HP-FFAP和HP-INNOWAX柱分离饱和酸、不饱和酸和脂肪 酸甲酯.使用说明书，1998：228-398.网址： http://www.chem.agilent.com/Library/applications/59663971.pdf。
（HEWLETT PACKARD.The separation of saturated and unsaturated acids and FAMEs using HP-FFAP and HP-INNOWax columns.Application note228-398. 1998.Available in: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/59663971.pdf.）
霍尔索夫,R.B.A.，伯恩特,A.，格里茨,W.J.J.，迪杰斯特拉,J.，范·齐德维尔 德,S.M.，纽博尔德,J.R.，博多克,H.B..日粮硝酸盐补充剂可减少饲喂甘蔗为 主的肉牛甲烷排放.动物科学杂志，出版中.（doi： http://jas.fass.org/content/early/2012/01/27/jas.2011-4209）。
（Hulshof,R.B.A.;Berndt,A.;Gerrits,W.J.J.;Dijkstra,J.;van Zijderveld,S.M.; Newbold,J.R.;Perdok,H.B.Dietary nitrate supplementation reduces methane emission in beef cattle fed sugarcane based diets.Journal of Animal Science,in press(doi:http://jas.fass.org/content/early/2012/01/27/jas.2011-4209).）
阮,N.A.，曲,T.H.，董,N.K.，普勒斯顿,T.R..硝酸钙作为非蛋白氮源对饲喂甘 蔗、辅以木薯叶的山羊生长性能和甲烷排放的影响.畜牧生产、气候变化和资 源枯竭会议.（T.R.普勒斯顿，B.奥格尔主编）（帕克斯，老挝），2010.
（Hguyen,N.A.;Khuc,T.H.,Duong,N.K.,Preston,T.R.Effect of calcium nitrate as NPN source on growth performance and methane emissions of goats fed sugar cane supplemented with cassava foliage.In‘Mekarn conference on livestock production,climate change and resource depletion’.(Eds.T.R.Preston,B.Ogle) (Pakes,Laos),2010.）
李,L.，戴维斯,J.，诺兰,J.，赫加蒂,H..对日粮中含有尿素或硝酸盐作为氮源 的羊的瘤胃发酵模式和甲烷排放的初步调查.动物生产科学，出版中（doi： http://dx.doi.org/10.1071/AN11254）.
（Li,L.;Davis,J.;Nolan,J.;Hegarty,H.An initial investigation on rumen fermentation pattern and methane emission of sheep offered diets containing urea or nitrate as the nitrogen source.Animal Production Science,in press(doi: http://dx.doi.org/10.1071/AN11254).）
美国国家研究委员会.小反刍动物的营养需求：绵羊、山羊、鹿、新世界骆驼. 华盛顿，美国国家学术出版社，2007：292.
（NATIONAL RESEARCH COUNCIL.Nutrient requirements of small ruminants:sheep,goats,cervids,and new world camelids.Washington: National Academic Press,2007.292p.）
诺兰,V.，赫加蒂,R.S.，戈德温,I.R.，伍德盖特,R..日粮硝酸盐对羊的发酵、 甲烷生产和消化动力学的影响.动物生产科学，2010(50)，8：801-806
（Nolan,V.;Hegarty,R.S.;Godwin,I.R.;Woodgate,R.Effects of dietary nitrate on fermentation,methane production and digesta kinetics in sheep.Animal Production Science,v.50,n.8,p.801-806,2010.）
萨托,K..高铁血红蛋白.人体药物与毒物-实用分析手册（铃木修和渡边加奈 子主编）。施普林格出版社，柏林海德堡，2005：655-657.
（Sato,K.Methemoglobin.In:Drugs and Poisons in Humans-A Handbook of Practical Analysis(Eds.Osamu Suzuki and Kanako Watanabe).Springer-Verlag Berlin Heidelberg,p.655-657,2005.）
范·齐德维尔德,S.M.，格里茨,W.J.J.，阿帕加拉蒂,J.A.，华顿,J.R.，迪杰斯 特拉,J.，伦格,R.A.，博多克,H.B..硝酸盐和硫酸盐：减缓羊瘤胃甲烷生产的 另一有效的氢汇.日粮科学杂志.2010(93)：5856-5866.
（van Zijderveld,S.M.;Gerrits,W.J.J.;Apajalahti,J.A.;Newbold,J.R.;Dijkstra, J.;Leng,R.A.;Perdok,H.B.Nitrate and sulfate:Effective alternative hydrogen sinks for mitigation of ruminal methane production in sheep.Journal of Dairy Science,v.93,p.5856-5866,2010.）
周,Z.，余,Z.，孟,Q..硝酸盐对体外瘤胃培养中甲烷生产、发酵和微生物种 群的影响.生物资源科技，出版中。（doi：10.1016/j.biortech.2011.10.013）
（Zhou,Z.;Yu,Z.;Meng,Q.Effects of nitrate on methane production, fermentation,and microbial populations in in vitro ruminal cultures.Bioresource Technology,in press.(doi:10.1016/j.biortech.2011.10.013).）
实施例3
该实验的目的是评估未包封和包封（缓释）类型的硝酸盐和硫酸盐对内 洛尔阉牛（Nellore beef steers）急性中毒（高铁血红蛋白血症）的影响。
该实验由位于巴西戈亚斯州戈亚尼亚市的戈亚斯州联邦大学兽医和动物 科学学院动物生产部的实验饲育场设施部进行。遵循同一机构的国内伦理委 员会建议的指南，对所有动物使用相同的方法。
材料和方法
试验设计和处理。装有瘤胃插管的五头内洛尔阉牛（5岁，平均体重450 公斤）被分配在一个5×5拉丁方设计中。该实验历时70天，分为5期，每 期14天。
对动物采用如下五种日粮处理：空白组-不添加硝酸盐或硫酸盐；NE123 （未包封）-饲喂123g/d的硝酸盐（NO3-）+16.5g/d的硫酸盐（SO42-），相当 于195g/d的十水合硝酸铵钙和24g/d的一水合硫酸镁。这相当于日粮干物质 （DM）中含有1.82％硝酸铵钙和0.23％硫酸镁；NE246（未包封）-饲喂246g/d 的硝酸盐（NO3-）+33g/d的硫酸（SO42-），相当于390g/d的十水合硝酸铵钙 和48g/d的一水合硫酸镁。这相当于日粮干物质（DM）中含有3.64％硝酸铵 钙和0.47％硫酸镁；E123（包封）-饲喂123g/d的硝酸盐（NO3-）+16.5g/d 的硫酸盐（SO42-）作为单一的包封产品，对应于266g/d的最终产品。这相当 于日粮干物质中含有2.58％的最终的包封产品；E246（包封）-饲喂246g/d的 硝酸盐（NO3-）+33g/d的硫酸盐（SO42-）作为单一的包封产品，相当于532g/d 的最终产品。这相当于日粮干物质中含有5.16％的最终的包封产品。
圈养和饲喂。将各只阉牛单独地养在户外的、带饲槽和自动水杯的圈内。 实验开始时，给动物驱虫，接种疫苗，并补充注射维生素A、维生素D和维 生素E。
随机给动物饲喂50:50浓缩液：牧草的日粮（全混合日粮），该日粮根据 与饲料（瓦拉达雷斯·菲利欧等人，2010年）（Valadares Filho et al.,2010） 近似的化学成分制成。该组合物和实验日粮的化学分析示于表1。每日上午饲 喂动物一次，并随时补充饮用水。
数据收集与分析
在每一期，前12天每天早晨08:00给动物饲喂空白日粮。第13天，根据 所设的处理，通过瘤胃插管给动物灌入（inoculate）未包封的硝酸盐/硫酸盐 或包封的硝酸盐/硫酸盐。
早晨饲喂后的0、3、6、9和12小时进行上述灌入，如表2和表3所示。 实验开始之前估算了平均总采食量和采食量模式（每个时间间隔内摄取率）， 根据饲喂后的时间来确定灌入量。平均采食量为16kg/d（如喂养），0-3小时 内估计采食率为31.3％，3-6小时为21％，6-9小时为21％，9-12小时为13.3％， 12-24小时为13.3％。
第13天早晨饲喂后的0、3、6、9、12、18、24和30小时，从颈静脉采 集用于高铁血红蛋白测定的血液样本。根据赫格斯等人（Hegesh et al.）（1970）， 使用分光光度计进行高铁血红蛋白分析。
第13天早晨饲喂后的0、6、12、18、24和30小时，从颈静脉采集用于 血像（hemogram）、生化分析（肝酶、葡萄糖、尿素和胆红素）和血气分析 （hemogasometry）（酸碱平衡）的血液样本。通过微量血细胞比容法，使用 含有EDTA的真空采血管，对采集的血液进行血像分析。用无添加剂的真空 采血管采集用于生化分析的血液样本。
第13天早晨饲喂后的0、3、6、9、12、18、24和30小时进行体检（心 脏速率、呼吸速率、体温）以及测量瘤胃的pH值。根据雷多斯蒂斯等人 （Radostits et al.）（2007年）进行体检。整个灌入期间动物由两名经验丰富 的兽医仔细监测。如果呈现视觉可见的中毒迹象、明确的褐色粘膜，那么在 刚刚进行的血液分析的基础上，用100ml4％的亚甲基蓝静脉注射剂治疗处于 危险状态的动物。
表1：实验日粮的成分和计算出的化学组分
其中：
——氮源：十水合硝酸铵钙（5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O），以干物质为基础， 83.33%DM，116.63%CP，75.77%NO3-。
——硫源：一水合硫酸镁（MgSO4·1H2O），以干物质为基础，86.96%DM， 80%SO42-。
——含有十水合硝酸铵钙和一水合硫酸镁的包封产品，以干物质为基础， 86.70%DM，81.56%CP，52.97%NO3-，7.296%SO42-。
——NDF：中性洗涤纤维（neutral detergent fiber）
——TDN：总可消化养分（total digestible nutrients）
表2：根据喂饲后的时间，通过瘤胃插管灌入硝酸盐和硫酸盐的方案（g， 饲喂基础的用盐量）
其中：
——硝酸盐：十水合硝酸铵钙（5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O），以干物质为基 础，83.33%DM，116.63%CP，75.77%NO3-。
——硫酸盐：一水合硫酸镁（MgSO4·1H2O），以干物质为基础，86.96%DM， 80%SO42-。
——含有十水合硝酸铵钙和一水合硫酸镁的包封产品，以干物质为基础， 86.70%DM，81.56%CP，52.97%NO3-，7.296%SO42-。
表3：根据喂饲后的时间，通过瘤胃插管灌入硝酸根离子（NO3-）和硫酸 根离子（SO42-）的方案（干物质，g）
其中：
——硝酸盐：十水合硝酸铵钙（5Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O），以干物质为基 础，83.33%DM，116.63%CP，75.77%NO3-。
——硫酸盐：一水合硫酸镁（MgSO4·1H2O），以干物质为基础，86.96%DM， 80%SO42-。
——含有十水合硝酸铵钙和一水合硫酸镁的包封产品，以干物质为基础， 86.70%DM，81.56%CP，52.97%NO3-，7.296%SO42-。
结果与讨论
血像和高铁血红蛋白的数据列于表4。246g未包封或包封的硝酸盐可短 期内（灌入开始至30小时）增加血液中高铁血红蛋白浓度。然而，包封可有 效减少高铁血红蛋白血症的风险，因为高铁血红蛋白浓度维持在可耐受的水 平（至多30%），而未包封硝酸盐峰值高达50%。
表4：通过瘤胃插管灌入纯的或包封的硝酸盐/硫酸盐的内洛尔阉牛的血 像和高铁血红蛋白浓度
其中：红细胞压积（Packed cell volume）=血细胞压积（Hematocrit）
对于NE246和E246，高铁血红蛋白峰值出现在灌入开始后18小时或最 后一剂硝酸盐灌入后6小时。随着时间的推移，NE246和E246的高铁血红蛋 白浓度会非常相似，但观察到NE246有较高的水平。这强调了硝酸盐包封可 有效减少硝酸盐在瘤胃中释放，从而减少了急性中毒的风险。（图2附件二）
在五个分期的二期中，由于出现清晰的视觉中毒迹象，灌入246g/d纯硝 酸盐的动物需要用解毒剂（每450公斤体重使用4％的亚甲基蓝100ml）治疗， 一头是在接种开始后9小时，另一头是在18小时。还需要考虑，将这两头被 治疗的动物的数据排除统计分析（第一头的12小时和30小时的数据，第二 头的12、18、24和30小时的数据）。出于这个原因，如果动物没有用解毒 剂治疗，NE246的高铁血红蛋白浓度就会更大。然而，这个决定对动物可能 是非常危险的，不会被国内伦理委员会接受。相反，五个分期中，饲喂246g 包封的硝酸盐的动物中没有动物需要接受治疗。
高铁血红蛋白在反刍动物中出现，是由于短时间内瘤胃壁吸收较多的亚 硝酸盐。亚硝酸盐在瘤胃中积累是因为不适应的瘤胃微生物不能完全将硝酸 盐还原成氨。在血液中，亚硝酸盐将血红蛋白的亚铁离子（Fe2+）转变为三价 铁离子（Fe3+）。当这种情况发生时，血红蛋白（现在命名为高铁血红蛋白） 无法将氧输送到组织（科伯恩等人，2010）（Cockburn et al.,2010）。这就产 生了亚硝酸盐中毒的一般缺氧症状，严重情况下可能是致命的。
与对照组相比，同时饲喂123/16g包封的和未包封的硝酸盐/硫酸盐的动 物没有表现出高铁血红蛋白浓度增加。这些结果表明，达到这种水平的硝酸 盐，瘤胃硝酸盐还原为氨和/或血液中高铁血红蛋白还原酶（将血液中高铁血 红蛋白转变为血红蛋白）可避免中毒问题。然而，还需要提到的是，本实验 硝酸灌入只模拟一天的硝酸盐摄入量，不可能推测第二天硝酸盐灌入引起的 累积效应。
NE246血红蛋白浓度最大。据报道，动物高铁血红蛋白浓度升高增加了 血红蛋白（Hb）浓度，这是一种生理反应以弥补减少的血液输送氧的能力（温 特和霍坎森，1964年）（Winter and Hokanson,1964）。NE246有更多的红细 胞也支持了这一观点。
血糖、肝酶和胆红素水平列于表5。NE246的血糖浓度和AST最大。AST 是一种酶，指示肝脏、心脏和肾脏出现急性炎症，从而也指示灌入纯硝酸盐/ 硫酸盐引起中毒症状。
GGT、肌酐、碱性磷酸酶、肌酐激酶和胆红素均不受处理的影响。
表5：通过瘤胃插管灌入纯的或包封的硝酸盐/硫酸盐的内洛尔阉牛的血 糖、肝酶和胆红素浓度
其中：
——GGT：γ谷氨酰转移酶（Gamma Glutamyl Transferase）
——AST：天冬氨酸转移酶（Aspartate transaminase）
心率、呼吸速率和血液温度没有受到硝酸盐灌入的影响（表6）。所有硝 酸盐处理组的瘤胃pH值增加，原因是硝酸钙的缓冲能力。
表6：通过瘤胃插管灌入纯的或包封的硝酸盐/硫酸盐的内洛尔阉牛的心 率、呼吸速率、血液温度和瘤胃pH
表7：通过瘤胃插管灌入纯的或包封的硝酸盐/硫酸盐的内洛尔阉牛的血 气分析
其中：
——pO2：O2分压。
——pCO2：CO2分压。
——iCa：离子钙。
参考文献
科伯恩,A.，布兰比拉,G.，费尔南德斯,M-L.，阿塞拉,D.，波答加纳迪,L.R.， 柯特瑞,B.，范·派特葛汉姆,C.，多恩,J.L..饲料中的亚硝酸盐：从动物健康 到人体健康.毒理学与应用药理学，2010年新闻报道.
（Cockburn,A.;Brambilla,G.;Fernández,M-L.;Arcella,D.;Bordajandi,L.R.; Cottrill,B.;van Peteghem,C.;Dorne,J.L.Nitrite in feed:From Animal health to human health.Toxicology and Applied Pharmacology,in press,2010.）
赫格斯,E.，格吕纳,R.N.，科恩,S.，波什科斯盖,R.，舒瓦尔,H.I..一种测定 血液中高铁血红蛋白的灵敏微量测定法.临床化学学报，1970(30)：679-682. （Hegesh,E.;Gruener,R.N.;Cohen,S.;Bochkovsky,R.;Shuval,H.I.A sensitive micromethod for the determination of methemoglobin in blood.Clinica Chimica Acta,v.30,p.679-682,1970.）
国家研究委员会.肉牛的营养需求，华盛顿，美国国家科学院出版社，1996 年第7版，第241页.
（National Research Council.Nutrient Requirements of Beef Cattle.7th Revised Edition.Washington,National Academy Press,1996,241p.）
多斯蒂斯O.M.，盖伊C.C.，布拉德,D.C.，辛奇克里夫,K.W..兽医学：一 本关于牛、马、绵羊、猪和山羊疾病的教科书，第10版，W.B.桑德斯出版 公司，费城.2007：724-725
（Radostits O.M.;Gay C.C.;Blood,D.C.;Hinchcliff,K.W.Veterinary Medicine:A textbook of the diseases of cattle,horses,sheep,pigs,and goats. 10th ed.W.B.Saunders,Philadelphia,2007,p.724-725.）
瓦拉达雷斯·菲利欧等人.巴西牛的食物成分表.第3版，维索萨联邦大学. 2010：502页.
（Valadares Filho et al.Tabelas brasileiras dede alimentos para bovinos.3a ed.UFV,2010,502p.）
温特,A.J.，J.F.霍坎森.长期喂饲硝酸盐、亚硝酸盐或羟胺对怀孕的小乳牛 的影响.美国兽医研究杂志，1964（25）：353–361.
（Winter,A.J.,and J.F.Hokanson.Effects of long-term feeding of nitrate,nitrite, or hydroxylamine on pregnant dairy heifers.American Journal of Veterinary Ressearch,v.25,p.353–361,1964.）
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