技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片 保存液及其保存方法和应用。
背景技术
用于分子生物学研究的植物材料大部分是从远离实验室的野外采集获得的，从野外到实验 室，植物材料的保存是一个关键的环节。在提取植物叶片DNA的研究中，常规方法多采用新 鲜或冷冻的材料，但这些常规方法对野外采集样品显然不适用。特别是在交通十分不便的地区， 对大量采集样品进行系统学研究造成极大的不便，同时植物叶片中富含酚类、糖类及其他的次 生代谢产物，这些物质很容易使新鲜的植物叶片发生褐变，采集的叶片如不采用适当的处理方 法，叶片褐化很快，从而严重影响植物基因组DNA的提取质量。有研究表明，用硅胶干燥保 存的野外标本的叶子可用于基因组DNA的提取。但研究发现，从硅胶脱水干燥的样品中提取 的DNA有不同程度的降解，其质量不如从鲜样中提取的。
植物表皮位于表皮细胞的外面，有沉积的角质层和蜡质组成。角质层实质为网状结构，在 形成过程中蜡质填充其间，这些填充在角质层网状结构内的腊层被称为内蜡质层；在角质层外 又形成只有蜡质成分的结构，为外蜡质层，外蜡质层一般会形成自我组装的蜡质晶体。植物表 皮蜡质一般由脂溶性的脂肪酸、烷烃、脂肪醇、醛类、酮类和酯类组成。在分子生物学的研究 中，植物表皮蜡质通常不能有效地去除，会影响到后续所提取的植物叶片DNA的纯度和质量。
因此，探索新鲜植物材料的常温保存方法对后续分子生物学研究具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片 保存液及其保存方法和应用。本发明提供的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保 存液能用于常温、长期保存禾本科植物叶片。
第一方面，本发明提供了一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液，包 括：
余量为水。
优选地，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。
第二方面，本发明提供了一种禾本科植物新鲜叶片的保存及基因组DNA的提取方法，包 括如下步骤：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将十二烷基硫酸钠(SDS)、乙醇、氯仿、NaAc、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌 20min；
(2)灭菌后，加入2％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，得到混合液，备用；
(3)将禾本科植物新鲜叶片剪切为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述禾本科植物新鲜叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存；
(6)取步骤(5)保存有禾本科植物新鲜叶片条块的保存液在65℃下加热3-5min，再采 用常规SDS法提取基因组DNA。
优选地，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新 鲜叶片保存液或第二方面所述的用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法 在禾本植物保存中的应用。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新 鲜叶片保存液或如第二方面所述的用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方 法在提取禾本科植物基因组DNA的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的保存液及其保存方法简单有效、成本低廉；
(2)本发明提供的保存液不含CTAB，对人体无害，适用于禾本科植物新鲜叶片的常温 保存，有效期长；
(3)本发明提供的保存液用于保存禾本科植物新鲜叶片，保存液所含的氯仿成分可以有 效溶解植物表皮的蜡质成分，破坏植物表皮结构，有利于保存液快速渗透细胞，还有利于后续 DNA提取过程中去除植物表皮蜡质成分，提高DNA纯度；
(4)本发明提供的保存液用于提取禾本科植物基因组DNA，所含多糖、多酚、蛋白质少， 能获得研究所需要的高质量的DNA。
附图说明
图1是本发明实施例提供的SDS法提取狗牙根叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明实施例提供的狗牙根叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图和聚丙烯酰氨凝胶 电泳检测狗牙根叶片SSR引物(SC49)PCR扩增产物图；
图3是本发明实施例提供的SDS法提取结缕草叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图4是本发明实施例提供的SDS法提取水稻叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图5是本发明实施例提供的SDS法提取柱花草叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例进行详细的描述。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法， 包括：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠)、乙醇、氯仿、EDTA、NaCl 用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌20min；
(2)灭菌后，加入2％的PVP，得到混合液，备用；
(3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存30天。
实施例2
本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法， 包括：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠)、乙醇、NaAc、EDTA、NaCl 用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌20min；
(2)灭菌后，加入2％的PVP，得到混合液，备用；
(3)将新鲜狗牙根叶片剪切为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存30天。
实施例3
本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法， 包括：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠)、乙醇、氯仿、NaAc、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌 20min；
(2)灭菌后，加入2％的PVP，得到混合液，备用；
(3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存30天。
实施例4
本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法， 包括：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠)、乙醇、氯仿、NaAc、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌 20min；
(2)灭菌后，加入2％的PVP，得到混合液，备用；
(3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存30天。
实施例5
本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存的方法， 包括：
(1)配制含有如下成分的保存液：
余量为水；
按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠)、乙醇、氯仿、NaAc、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH＝8.0，定容，然后置于灭菌瓶中在121℃、0.1Mpa灭菌 20min；
(2)灭菌后，加入2％的PVP，得到混合液，备用；
(3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0.5cm2的条块；
(4)使用前，向(2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2％，制得保存液；
(5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在(4)中的保存液中，常温保存30天。
实施例6
采用SDS法对经过实施例1-3所提供的保存液保存30天后的狗牙根叶片、经过冰箱冷冻 保存30天后的狗牙根叶片、以及新鲜的狗牙根叶片(嫩叶)进行DNA提取，包括如下步骤：
(1)经过实施例1和3所提供的保存液保存30天后的狗牙根叶片实验组：常温保存30 天后，将实施例1和3提供的保存有新鲜狗牙根叶片条块的保存液在65℃下加热30s，然后移 入2ml离心管中(分别按次序标记为1、3)，实施例2提供的保存液保存30天后的狗牙根叶 片则不做热处理，编号为2。
(2)经过冰箱冷冻保存30天后的狗牙根叶片对照组：在-80℃条件下，冷冻保存30天后， 称取狗牙根叶片0.2g放入液氮预冷过的研钵中，加入液氮至浆状，移入2ml离心管中(标记 为4)。
(3)新鲜狗牙根叶片对照组：称取新鲜的狗牙根叶片0.2g放入液氮预冷过的研钵中，加 入液氮至浆状，移入2ml离心管中(标记为5)。
(4)分别往1-5号离心管中加入65℃预热的800μl的SDS提取液，振荡混匀后，在65℃ 水浴30min。
(5)65℃水浴30min后，加入200μl5M的醋酸钠溶液，混匀后水浴20-30min，不时震 动以免成团。
(6)加入体积比为24:1的氯仿-异戊醇800μl，充分混匀，在室温下，10000r/min离心 5min。
(7)将上清液转移至另一2ml的离心管中，加入-20℃预冷的0.6-1.0倍体积的异丙醇， 缓慢混匀，使DNA呈线团状沉淀析出。
(8)10000r/min离心3min，弃去上清液，加入70％的乙醇洗涤，吹干。
(9)加入适量TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH＝8.0)溶解，加入1/10 体积的RNaseA(10mg/ml)，37℃条件下恒温1h，出去RNA；并置于-20℃冰箱中保存备用。
(10)采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测(6)中狗牙根叶片所提取的DNA 的纯度。
(11)采用狗牙根SSR引物SC49对步骤(9)中狗牙根叶片基因组DNA的可靠性进行PCR 验证，SSR引物SC49序列为上游：5’-CAAGGACCACATCACCATCA-3’，下游：5’- CGGCCATTGATTATCTGTGA-3’。
PCR扩增体系为(20μl):Mg2+(1.0mmol·L-1MgCl2)1.5μl，10×PCRBuffer2μl，0.2mmol·L-1dNTPs0.3μl，Taq酶(5U·μl-1)0.2μl，0.4μmmol·L-1引物3μl，模板DNA3μl，ddH2O10μl。 PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环36次， 72℃延伸7min，4℃保存。
实验结果
(1)采用紫外分光光度计法检测狗牙根叶片基因组DNA的纯度，基因组DNA的 A260/A280和A260/A230的比值，并对其进行比较，结果如表1所示，其中，1、2、3、4、5 分别为来自五种不同的狗牙根叶片所提取的基因组DNA(1：实施例1所提供的保存液保存的 狗牙根叶片；2：实施例2所提供的保存液保存的狗牙根叶片；3：实施例3所提供的保存液保 存的狗牙根叶片；4：冰箱冷冻保存的狗牙根叶片；5：新鲜狗牙根叶片)。从表1中可知，五 种叶片所提取的基因组DNA的A260/A280都接近1.8；经过实施例1-3(表1组1、3)、冰箱 冷冻保存的叶片(表1组4)和新鲜叶片(表1组5)提供的保存液保存的叶片所提取的基因 组DNA的A260/A230都接近2.0，说明这些方法保存的叶片的基因组DNA纯度较高；而经过 实施例1提供的保存液保存的叶片的A260/A230小于2(表1组2)，说明实施例2提供的无 氯仿保存液保存的狗牙根叶片所提取的DNA比值浓度偏低。
表1SDS法提取狗牙根叶片基因组DNA紫外分光光度计检测结果
(2)各组琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示(M为DNAMarker，TakaraDL2000bp)，其中， 1、2、3、4、5分别为来自五种不同的狗牙根叶片所提取的基因组DNA(1：实施例1所提供 的保存液保存的狗牙根叶片；2：实施例2所提供的保存液保存的狗牙根叶片；3：实施例3 所提供的保存液保存的狗牙根叶片；4：冰箱冷冻保存的狗牙根叶片；5：新鲜狗牙根叶片)。
由图1可知，相比实施例3(泳道3)，经过实施例1和2提供的保存液保存的狗牙根叶片 所提取的DNA条带(即泳道1和2)较为模糊，有较多降解，其中实施例1保存液中没有乙 醇成分的DNA条带降解最明显。
而相比保存液中添加了氯仿成分的实施例1和3(泳道1和3)，保存液中没有添加了氯仿 成分的实施例2、以及新鲜采集的叶片、经冰箱-80℃保存的叶片的DNA点样孔处的亮点较为 明显(泳道2、4和5)，DNA可能含有蛋白或糖类杂质；说明叶片保存时氯仿的存在可以提 高DNA纯度，降低蛋白或糖类等杂质。
(3)此外，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施例3及6(1)-(9)的步骤，对 不同狗牙根种质叶片进行保存、以及DNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测叶片所提取的 DNA的纯度，采用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测不同狗牙根种质SSR引物(SC49)PCR扩增产物 图。
实验结果如图2所示(图2中，A和B中泳道1-12分别对应编号为1-12的不同叶片材 料。)图2-A为狗牙根叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1-12分别为不同种质的 狗牙根叶片所提取的基因组DNA。图2-B是聚丙烯酰氨凝胶电泳检测12份不同种质的狗牙根 SSR引物(SC49)PCR扩增产物图。由图2可知，经过实施例3提供的保存液保存的狗牙根 叶片所提取的DNA能用于SSR引物扩增检测。
实施例7
为了进一步说明本发明的技术效果，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施例6(1) -(9)的步骤，对结缕草和水稻进行保存、以及DNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测结缕 草叶片和水稻叶片所提取的DNA的纯度。
实验结果
(1)对结缕草叶片所提取的DNA采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外下成像结 果如图3所示，其中，1、2、3分别为不同结缕草种质叶片所提取的基因组DNA。
(2)对水稻叶片所提取的DNA采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外下成像结果 如图4所示，其中，1、2、3分别为不同水稻种质叶片所提取的基因组DNA。
由图3和图4可知，经过实施例3提供的保存液保存的结缕草叶片和水稻叶片所提取的 DNA条带(参见泳道5)较为清晰，基本无降解，纯度较高。
实施例8
为了进一步说明本发明的技术效果，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施例6的步 骤对柱花草叶片进行保存、以及DNA提取、分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，泳道1-4为不同柱花草种质样品。由图5可知，保存30 天后的柱花草叶片DNA有明显降解，所提取的DNA浓度较低；所提取的DNA的蛋白含量、 糖、多酚类杂质含量偏高。说明对于多酚、多糖含量高的植物，需进一步摸索保存液的配方、 保存时间及保存条件，改进配方以期。
本发明的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液及其保存方法用于禾本科 植物样品保存，不限于本发明实施例中的狗牙根、结缕草、水稻叶片。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加 以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。