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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610930546.6 (22)申请日 2016.10.31 (71)申请人 湖南师范大学 地址 410000 湖南省长沙市岳麓区麓山路 36号 (72)发明人 刘少军 王余德 陶敏 覃钦博 罗凯坤 肖军 赵如榕 (74)专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务 所(普通合伙) 43213 代理人 杨斌 (51)Int.Cl. A01K 61/10(2017.01) (54)发明名称 锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 (57)摘要 本发明公开了一种锦鲤与团头鲂亚科间远 缘杂交。
2、的方法， 包括以下步骤： 以锦鲤为母本亲 鱼， 团头鲂为父本亲鱼， 在繁殖季节对所述母本 亲鱼和父本亲鱼进行人工催产， 再进行干法人工 授精， 将得到的受精卵在孵化槽中进行流水孵 化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代， 对所述杂交 后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤 鲫和二倍体鲫鱼。 本发明的锦鲤与团头鲂亚科间 远缘杂交的方法， 不仅整合了锦鲤与团头鲂的优 良性状， 丰富了市场鱼类品种， 而且为优良品种 的选育奠定了良好基础， 为后续的新型多倍体鱼 的选育提供了宝贵的资源， 在生物进化和鱼类遗 传育种具有重要的生物学意义。 权利要求书2页 说明书6页 附图8页 CN 106550909。
3、 A 2017.04.05 CN 106550909 A 1.一种锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 包括以下步骤： 以锦鲤为母本亲鱼， 团头 鲂为父本亲鱼， 在繁殖季节对所述母本亲鱼和父本亲鱼进行人工催产， 再进行干法人工授 精， 将得到的受精卵在孵化槽中进行流水孵化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代， 对所述杂交 后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫鱼。 2.根据权利要求1所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 具体包括 以下步骤： (1)在繁殖期前34个月挑选性成熟特征明显、 体征良好的雌性锦鲤和雄性团头鲂分 别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培。
4、育， 在繁殖前12个月以精饵饲养， 每 隔13天流水刺激一次； (2)在同年的5月中旬至6月上旬， 当水温稳定在20以上时， 为步骤(1)后得到的母本 亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产， 45h后再 为步骤(1)后得到的父本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产 剂进行催产， 注射完毕后按1:68的数量比将母本亲鱼和父本亲鱼放入同一产卵池中； (3)在步骤(2)后得到的母本亲鱼和父本亲鱼中， 挑选产卵顺利的母本亲鱼， 与产精量 大的父本亲鱼进行人工干法授精， 得到的授精卵置于水温为1920的孵化槽中进行流 水孵化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代。
5、鱼苗； (4)将步骤(3)后得到的杂交后代鱼苗置于孵化槽中继续培养24天， 待所述杂交后代 鱼苗出现腰点后将其转入预先培肥的池塘中饲养13天后泼洒豆浆， 对饲养后得到的杂交 后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫鱼。 3.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 (1)中， 体征良好表现为体型好、 体色鲜艳、 体质健壮和无病无伤； 所述注射时采用胸鳍基部 无鳞处腹腔一针注射法。 4.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 (2)中， 为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合。
6、催产剂 中， 黄体素释放激素类似物的量为710ug/kg， 绒毛膜促性腺激素的量为600800IU/kg； 为父本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂中， 黄体 素释放激素类似物的量为56ug/kg， 绒毛膜促性腺激素的量为300400IU/kg。 5.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 (2)中， 产卵池的水面面积为80cm290cm2。 6.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 (3)中， 人工干法授精的具体操作包括如下步骤： 将雌鱼和雄鱼放到同一个水池， 控制水温 在2426。
7、， 当雄鱼追尾雌鱼时立即将其打捞， 先将雌鱼鱼体握于手中， 左手握住鱼尾柄， 右手握在鱼的头下背脊处， 鱼腹部朝斜上方， 轻轻擦干鱼的体表， 然后轻压雌鱼腹部， 使卵 子流入干燥的瓷盆中， 用同样的方法将雄鱼的精液挤到所述卵子上面， 再用干燥的羽毛轻 轻搅动23min， 使之完成授精。 7.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 (4)中， 预先培肥的方法具体包括以下步骤： 在池塘中放入自来水曝光12天或放入井水不 需要曝光， 使池塘中水深7080cm， 然后分别加入200300ml绿藻和200300ml蓝藻。 8.根据权利要求2所述的锦鲤与团头鲂亚科间。
8、远缘杂交的方法， 其特征在于， 所述步骤 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106550909 A 2 (4)中， 泼洒豆浆的频率为12次/天。 9.根据权利要求18中任一项所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征在 于， 所述二倍体鲫鱼包括二倍体红鲫、 二倍体花鲫和二倍体全白花鲫。 10.根据权利要求18中任一项所述的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 其特征 在于， 所述检测筛分包括外形测量、 流式细胞DNA含量测定、 肾脏组织染色体倍性检测和血 细胞形态鉴定。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106550909 A 3 锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 技术领域。
9、 0001 本发明属于鱼类杂交领域， 尤其涉及鲤科鱼类中亚科间的远缘杂交领域， 具体涉 及一种锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法。 背景技术 0002 亲缘关系在种间或种间以上的杂交一般称为远缘杂交， 是鱼类性状改良常用的方 法。 远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法， 它可以整合整套外源基因， 从 而改变杂交后代基因的表达调控， 使得杂交后代可能在生长速度、 抗逆性、 抗病性以及肉质 等方面表现出杂种优势。 如红鲫与湘江野鲤的属间远缘杂交形成的杂交后代具有体型优 美、 生长速度快、 肉质鲜美、 抗病力强、 存活率高等优点； 锦鲤与团头鲂的亚科间远缘杂交形 成的杂交后代除具有鲫鲤杂交。
10、鱼以上优点外， 颜色美观， 体型优美， 在新型优良类品系培育 和遗传育种方面具有重要价值。 0003 如何利用和改进现有的生物技术和方法， 在现有鱼品种中挑选合适的亲本鱼进行 远缘杂交， 从而对其进行遗传改良以获得形状更为优良、 品种更加丰富和对遗传研究更有 意义的新型多倍体鱼， 就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。 0004 与普通鲤鱼相比， 锦鲤色彩斑斓， 鳞片和花纹颜色很明显， 体型比普通鲤鱼小， 鳍 条更为柔软， 具有很高的观赏价值， 但生命力明显弱于普通鲤鱼， 故购买价格远远比鲤鱼 贵。 自然条件下培育鲤鱼非常容易， 当水温到达18以上就可以进行繁殖孵化， 而锦鲤繁殖 一般。
11、在水温上升到21后开始大量产卵， 产卵时间从凌晨5点左右到中午为止， 期间如果水 温 突 然 急 剧 下降 ， 就 会 中 断 产 卵 ， 可 见 培 育 锦 鲤 对 水 温 要 求 十 分 严 格 。 锦 鲤 （cyprinuscarpiohaematopterus） 属于鲤形目， 鲤科、 鲤亚科的二倍体鱼 （2n=100） ， 团头鲂 （Megalobramaamblycephala， 2n=48） 属于鲤科、 鲌亚科中的二倍体鱼； 在遗传、 分类和体型 等生物学特征方面， 锦鲤和团头鲂之间都存在较大差异， 尤其是它们染色体数目差异较大， 鲤鱼染色体数目为100条， 团头鲂染色体数目为48。
12、条， 两者之间不成倍数关系且相差比较 大， 因此远缘杂交比较困难。 至今国内还没有锦鲤与团头鲂之间的报道。 探索一种锦鲤与团 头鲂之间杂交获得成功技术是具有实际应用价值的。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是， 克服以上背景技术中提到的不足和缺陷， 提供一 种受精率高， 后代性状优良， 体型美观， 对遗传育种具有重要意义的锦鲤与团头鲂亚科间远 缘杂交的方法。 0006 为解决上述技术问题， 本发明提出的技术方案为： 0007 一种锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 包括以下步骤： 以锦鲤为母本亲鱼， 团 头鲂为父本亲鱼， 在繁殖季节对所述母本亲鱼和父本亲鱼进行人工催产， 再进行干法。
13、人工 授精， 将得到的受精卵在孵化槽中进行流水孵化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代， 对所述杂 交后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫鱼。 孵化槽是一种新型的孵 说 明 书 1/6 页 4 CN 106550909 A 4 化装置， 相比于静水孵化具有以下优点： 1） 有源源不断的新鲜水源补充， 与空气接触面积 大， 极大满足了鱼苗孵化的需氧量； 2） 鱼苗孵化出膜后卵膜便于及时清除， 保证了孵化良好 水质， 同时节省了大量劳力； 3） 孵化槽孵化并开口的幼苗活性更强， 培育出来的幼苗捕食能 力较强。 0008 上述的方法， 优选的， 具体包括以下步骤： 0009 （1） 。
14、在繁殖期前34个月挑选性成熟特征明显、 体征良好的雌性锦鲤和雄性团头 鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育， 在繁殖前12个月以精饵饲 养， 每隔13天流水刺激一次； 0010 （2） 在同年的5月中旬至6月上旬， 当水温稳定在20以上时， 为步骤 （1） 后得到的 母本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产， 45h 后再为步骤 （1） 后得到的父本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合 催产剂进行催产， 注射完毕后按1:68的数量比将母本亲鱼和父本亲鱼放入同一产卵池 中； 0011 （3） 在步骤 （2） 后得到的母本亲鱼和父本亲鱼中。
15、， 挑选产卵顺利的母本亲鱼， 与产 精量大的父本亲鱼进行人工干法授精， 得到的授精卵置于水温为1920的孵化槽中进 行流水孵化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代鱼苗； 0012 （4） 将步骤 （3） 后得到的杂交后代鱼苗置于孵化槽中继续培养24天， 待所述杂交 后代鱼苗出现腰点后将其转入预先培肥的池塘中饲养13天后泼洒豆浆， 对饲养后得到的 杂交后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫鱼。 0013 为了解决锦鲤和团头鲂之间远缘杂交困难的问题， 本发明采用人工催产的方式， 同时考虑到锦鲤的生命力弱较且对水温的敏感性较高， 本发明选用黄体素释放激素类似物 与绒毛膜促性腺激素作为混。
16、合催产剂， 以合适的剂量注入亲鱼体内进行催产， 孵化率明显 增高， 这样对于筛选各种杂交品种后代提供了数量上的最大可能； 然后采用人工干法授受 精， 23分钟后， 将完成受精的受精卵均匀地到入孵化槽进行孵化。 0014 优选的， 所述步骤 （1） 中， 体征良好表现为体型好、 体色鲜艳、 体质健壮和无病无 伤； 所述注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法。 0015 优选的， 所述步骤 （2） 中， 为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜 促性腺激素的混合催产剂中， 黄体素释放激素类似物的量为710ug/kg， 绒毛膜促性腺激 素的量为600800IU/kg； 为父本亲鱼注射的所述黄。
17、体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺 激素的混合催产剂中， 黄体素释放激素类似物的量为56ug/kg， 绒毛膜促性腺激素的量为 300400IU/kg。 黄体素释放激素类似物促进亲鱼发情和产卵， 而绒毛膜促性腺激素具有促 进亲鱼排卵和促性腺发育的双重作用， 通过大量试验证明， 上述注射剂量能使亲鱼的产精 量和产卵量达到最大， 同时对于亲鱼的伤害达到最小， 且便于对时间的把控， 通常情况下， 傍晚18:0020:00进行药物注射， 次日上午8:009:00可进行鱼苗生产。 0016 优选的， 所述步骤 （2） 中， 产卵池的水面面积为80cm290cm2。 0017 所述步骤 （3） 中， 人工干法。
18、授精的具体操作包括如下步骤： 将雌鱼和雄鱼放到同一 个水池， 控制水温在2426， 当雄鱼追尾雌鱼时立即将其打捞， 先将雌鱼鱼体握于手中， 左手握住鱼尾柄， 右手握在鱼的头下背脊处， 鱼腹部朝斜上方， 轻轻擦干鱼的体表， 然后轻 压雌鱼腹部， 使卵子流入干燥的瓷盆中， 用同样的方法将雄鱼的精液挤到所述卵子上面， 再 说 明 书 2/6 页 5 CN 106550909 A 5 用干燥的羽毛轻轻搅动23min， 使之完成授精。 0018 优选的， 所述步骤 （4） 中， 预先培肥的方法具体包括以下步骤： 在池塘中放入自来 水曝光12天或放入井水不需要曝光， 使池塘中水深7080cm， 然后分别加。
19、入200300ml 绿藻和200300ml蓝藻。 0019 优选的， 所述步骤 （4） 中， 泼洒豆浆的频率为12次/天。 0020 优选的， 所述二倍体鲫鱼包括二倍体红鲫、 二倍体花鲫和二倍体全白花鲫。 0021 优选的， 所述检测筛分包括外形测量、 流式细胞DNA含量测定、 肾脏组织染色体倍 性检测和血细胞形态鉴定。 0022 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 0023 1、 本发明的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 解决了锦鲤和团头鲂之间远缘 杂交困难的问题， 本发明采用人工催产的方式， 同时考虑到锦鲤的生命力弱较且对水温的 敏感性较高， 本发明选用黄体素释放激素类似物与绒毛膜促。
20、性腺激素作为混合催产剂， 以 合适的剂量注入亲鱼体内进行催产， 孵化率明显增高， 这样对于筛选各种杂交品种后代提 供了数量上的最大可能， 不仅整合了锦鲤与团头鲂的优良性状， 丰富了市场鱼类品种， 而且 为优良品种的选育奠定了良好基础， 为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源， 在 生物进化和鱼类遗传育种具有重要的生物学意义。 0024 2、 本发明的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 在后代中获得了二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫鱼， 还出现了雌核发育锦鲤， 这些鱼的生长速度快， 观赏价值非常 高， 如二倍体鲫鱼的颜色非常鲜艳， 色彩斑斓， 体型非常标致， 且出现了明显的变异现象， 尤 。
21、其是二倍体鲫鱼类型中的花鲫的头部出现了明显的红色斑点， 这种鱼非常少见， 在花鸟市 场和展览会上成为一道亮丽的风景线， 是目前其它远缘杂交不具备的特点， 市场价值极高。 而且这些鱼具有极强的抗逆性 （杂交的优势） ， 能作为其它杂交组合的亲本， 具有一定的经 济价值， 值得推广。 0025 3、 本发明的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交， 为鲫鱼的起源提供了一个有力的证 据， 也为大规模获得红鲫和花鲫提供了一种实验手段， 丰富了其它杂交组合的一个亲本来 源， 这种杂交组合获得的鲤鲫， 是一种存在明显变异的后代 （一边有口须） ， 说明这种远缘杂 交为产生变异品种提供了一个可靠的方法； 且锦鲤与团头鲂。
22、这种杂交组合得到的后代， 再 与其它鱼进行杂交， 获得的后代食用价值有所提高， 比如用锦鲤与团头鲂杂交得到的红鲫， 与白鲫杂交获得的后代， 在食用价值上就会有优势出现。 0026 4、 本发明采用的孵化槽是一种新型的孵化装置， 相比于静水孵化具有以下优点： 1） 有源源不断的新鲜水源补充， 与空气接触面积大， 极大满足了鱼苗孵化的需氧量； 2） 鱼苗 孵化出膜后卵膜便于及时清除， 保证了孵化良好水质， 同时节省了大量劳力； 3） 孵化槽孵化 并开口的幼苗活性更强， 培育出来的幼苗捕食能力较强。 附图说明 0027 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术。
23、描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图是本发明 的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据 这些附图获得其他的附图。 说 明 书 3/6 页 6 CN 106550909 A 6 0028 图1为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体红鲫的外形图。 0029 图2为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体花鲫的外形图。 0030 图3为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体全白花鲫外形图。 0031 图4为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体鲤鲫外形图。 0032 图5为锦鲤 （） 与团头。
24、鲂 （ ） 杂交后代中二倍体锦鲤外形图。 0033 图6为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体红鲫的流式细胞图。 0034 图7为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体花鲫的流式细胞图。 0035 图8为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体鲤鲫的流式细胞图。 0036 图9为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体锦鲤流式细胞图。 0037 图10为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体红鲫血细胞图。 0038 图11为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体花鲫鲫血细胞图。 0039 图12为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体鲤鲫血。
25、细胞图。 0040 图13为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体锦鲤血细胞图。 0041 图14为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体红鲫染色体图。 0042 图15为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体花鲫染色体图。 0043 图16为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体鲤鲫染色体图。 0044 图17为锦鲤 （） 与团头鲂 （ ） 杂交后代中二倍体锦鲤染色体图。 具体实施方式 0045 为了便于理解本发明， 下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全 面、 细致地描述， 但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。 0046 除非另有定义， 下文。
26、中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相 同。 本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的， 并不是旨在限制本发明的 保护范围。 0047 除非另有特别说明， 本发明中用到的各种原材料、 试剂、 仪器和设备等均可通过市 场购买得到或者可通过现有方法制备得到。 0048 实施例： 0049 一种本发明的锦鲤与团头鲂亚科间远缘杂交的方法， 包括以下步骤： 0050 （1） 在繁殖期前34个月， 挑选性成熟特征明显、 体征良好、 体色鲜艳、 体质健壮且 发育良好的雌性锦鲤和雄性团头鲂分别作为远缘杂交的母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培 育， 在繁殖前12个月以精饵饲养， 每隔13天流水。
27、刺激一次， 以促进亲鱼性腺发育成熟； 0051 （2） 在同年的5月中旬至6月上旬， 当水温稳定在20以上时， 为步骤 （1） 后得到的 母本亲鱼注射黄体素释放激素类似物 （LRH-A） 与绒毛膜促性腺激素 （HCG） 的混合催产剂进 行催产， LRH-A的用量为710ug/kg， HCG的用量为600800IU/kg； 4h后再为步骤 （1） 后得到 的父本亲鱼注射黄体素释放激素类似物 （LRH-A） 与绒毛膜促性腺激素 （HCG） 的混合催产剂 进行催产， LRH-A的用量为56ug/kg， HCG的用量为300400IU/kg， 注射完毕后按1:68的 数量比将母本亲鱼和父本亲鱼放入水面。
28、面积为80cm290cm2的同一产卵池中， 然后视水情 及时向池中冲水， 直到所述母本亲鱼和父本亲鱼开始顺利产卵和产精； 0052 （3） 在步骤 （2） 后得到的母本亲鱼和父本亲鱼中， 挑选产卵顺利的母本亲鱼， 与产 说 明 书 4/6 页 7 CN 106550909 A 7 精量大的父本亲鱼放到同一个水池， 控制水温在2426， 注意观察水面的情况， 当雄鱼追 尾雌鱼时立即将其打捞， 先将雌鱼鱼体握于手中， 左手握住鱼尾柄， 右手握在鱼的头下背脊 处， 鱼腹部朝斜上方 （优选与水平面成45 角） ， 轻轻擦干鱼的体表， 然后轻压雌鱼腹部， 使卵 子流入干燥的瓷盆中， 用同样的方法将雄鱼的。
29、精液挤到所述卵子上面， 再用干燥的羽毛轻 轻搅动23min， 使之完成授精， 得到的授精卵迅速倒入事先准备的水温为1920的孵 化环道中进行流水孵化， 得到锦鲤和团头鲂的杂交后代鱼苗； 0053 （4） 将步骤 （3） 后得到的杂交后代鱼苗置于孵化槽中继续培养24天， 待所述杂交 后代鱼苗出现腰点后将其转入预先培肥的池塘中饲养， 13天后泼洒豆浆， 直到鱼苗长到 能正常摄食； 采用外形测量、 流式细胞DNA含量测定、 肾脏组织染色体倍性检测和血细胞形 态鉴定， 对饲养后得到的杂交后代进行检测筛分， 得到二倍体锦鲤、 二倍体鲤鲫和二倍体鲫 鱼。 0054 将上述得到的杂交后代饲养34个月后， 随。
30、即抽样检测各杂交后代的生物形状相 关指标， 并分别与母本锦鲤和父本团头鲂进行比较， 结果如表1所示： 0055 表1： 锦鲤、 团头鲂及杂交后代的可数性状比较 （单位： 片或条） 0056 0057 由表1可知： 五种杂交后代鱼在外形上 （侧线鳞， 背鳍条， 胸鳍条， 腹鳍条， 臀鳍条） 基本不完全同于母本锦鲤和父本团头鲂 （如图1-5） ， 说明杂交后代鱼存在形态变异的特点。 在侧线上鳞和侧线下鳞方面， 杂交后代都遗传了母本的性状。 以普通红鲫为参照， 用流式细 胞仪测定二倍体鲫鱼型中的红鲫和花鲫， 二倍体鲤鲫和二倍体锦鲤 （如图6-9） ， 其DNA的平 均含量分别为96.47、 99.5。
31、7、 101.60和103.44， 从而说明上述杂交后代都为二倍体鱼。 为了 鉴定细胞核的形态差异， 我们制备了这四种鱼的血涂片 （如图10-13， 标尺10um） ， 通过比较 发现二倍体红鲫和二倍体花鲫血细胞细胞核大小一致， 二倍体鲤鲫和二倍体锦鲤血细胞细 胞核大小差不多， 比二倍体红鲫和二倍体花鲫细胞核稍小。 再用肾脏组织细胞制片法对雌 性锦鲤和雄性团头鲂的杂交后代体细胞染色体数目进行检测 （如图14-17， 标尺3um)， 通过 计数发现5种杂交鱼后代的染色体数目都为100条， 从而证明上述杂交后代都是二倍体。 0058 流式细胞DNA含量测定的操作步骤为： 用经肝素润湿的一次性注射器。
32、从鱼尾静脉 血管采血约0.1mL， 注入装有0.8%生理盐水的微量离心管 （Eppendorf管） 中， 在血液和生理 盐水混合液中加入500 L细胞核提取液DAPI-A （nuclei extraction solution， 德国Partec Gmbh提供） ， 处理时间1012min； 样品经过20 m尼龙滤器 （德国Partec GmbH提供） 过滤； DNA 说 明 书 5/6 页 8 CN 106550909 A 8 染色液 （DAPI-B， 德国Partec GmbH提供） 静置于暗处染色样品约10min， 然后上机检测。 0059 血细胞形态鉴定的操作步骤为： 1） 用碘酒棉签。
33、擦拭鱼尾静脉部位， 用一次性注射 器取0.1ml （或采用移液枪取15 l） 血液， 轻推一滴于干净载玻片一端， 使血滴附于玻片面 上； 2） 以一只手拿该载玻片的两端， 迅速用另一只手拿住另一载玻片的一端， 在滴有血液的 载玻片上由前向后接触血滴， 使两载玻片约成45 角， 轻轻移动， 使血滴成一直线， 然后由前 向后推为一均匀的薄片； 3） 涂片在空气中干燥后置于染色架上， 滴加瑞氏染色液， 使涂片被 染色液覆盖； 4） 染色6分钟后， 于载玻片背面用蒸馏水均匀缓慢冲洗， 见涂片呈粉红色后， 自 然晾干， 最后镜检。 0060 肾脏组织染色体倍性检测的操作步骤为： 在20水温下培育实验鱼2。
34、3天后， 对 实验鱼注射PHA 13次， 每次剂量为28 g/g体重， 间隔时间为1224小时， 在解剖取材前 26小时， 注射秋水仙素， 剂量为24 g/g体重； 取出肾组织， 在生理盐水下剪碎肾组织， 0.075mol/LKCL低渗处理， 在20温度下低渗45分钟左右； 用卡诺氏固定液 （冰醋酸： 甲醇= 1:3） 固定肾组织13次； 在冰冻载玻片上滴片； 姬姆萨 （Giemsa） 染液染色55分钟， 细水流冲 洗载玻片背面去除染液， 风干后镜检、 拍照。 0061 本发明方法获得了三种类型的杂交鱼： 二倍体鲫鱼 （二倍体红鲫， 二倍体花鲫， 二 倍体全白花鲫） ， 二倍体鲤鲫， 二倍体锦。
35、鲤。 上述杂交后代颜色非常美观， 体型非常标志， 且 出现了明显的变异现象， 比如花鲫的头部出现了明显的红色斑点， 鲤鲫出现了半边口须， 这 些杂交后代生长速度快， 观赏价值极高， 拥有良好的市场前景。 本发明的锦鲤与团头鲂亚科 间远缘杂交的方法， 不仅整合了锦鲤与团头鲂的优良性状， 丰富了市场鱼类品种， 而且为优 良品种的选育奠定了良好基础， 为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源， 在生物 进化和鱼类遗传育种具有重要的生物学意义。 说 明 书 6/6 页 9 CN 106550909 A 9 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/8 页 10 CN 106550909 A 10 图。
36、4 图5 说 明 书 附 图 2/8 页 11 CN 106550909 A 11 图6 图7 说 明 书 附 图 3/8 页 12 CN 106550909 A 12 图8 图9 说 明 书 附 图 4/8 页 13 CN 106550909 A 13 图10 图11 说 明 书 附 图 5/8 页 14 CN 106550909 A 14 图12 图13 说 明 书 附 图 6/8 页 15 CN 106550909 A 15 图14 图15 说 明 书 附 图 7/8 页 16 CN 106550909 A 16 图16 图17 说 明 书 附 图 8/8 页 17 CN 106550909 A 17 。