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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610864024.0 (22)申请日 2016.09.29 (71)申请人 湖北大学 地址 430062 湖北省武汉市武昌区友谊大 道368号 申请人 武汉多倍体生物科技有限公司 (72)发明人 蔡得田 张献华 宋兆建 王维 刘育华 何玉池 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 丁齐旭 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 1/08(2006.01) A01H。
2、 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系的选 育方法 (57)摘要 本发明提出了一种多倍体水稻光温敏雄性 核不育系选育方法， 它包括： a、 确定具有光温敏 雄性核不育性和多倍体减数分裂稳定性(PMeS) 的水稻品系作为亲本； b、 二倍体光温敏雄性核不 育系与二倍体PMeS基因品系杂交； c、 杂种植株幼 穗培养加倍成杂种四倍体； d、 杂种四倍体与光温 敏雄性核不育系四倍体回交； e、 从回交后代中选 择出四倍体雄性不育株； f、 选择的四倍体雄性不 育株在低温短日照的可育期自交后再与另一亲 本复合杂交； g、 挑选四倍体雄性不育株自交系连 续自交8。
3、-9代； h、 检测连续自交后的后8-9代稳定 性； i、 确定稳定一致的四倍体水稻不育品系为多 倍体水稻光温敏雄性核不育系， 简称S-4x。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 106538372 A 2017.03.29 CN 106538372 A 1.一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系选育方法， 其特征在于培育过程为： a、 确定具有光温敏雄性核不育性和多倍体减数分裂稳定性PMeS特性的水稻品系作为 亲本； b、 二倍体光温敏不育系与二倍体PMeS品系杂交； c、 将b)步骤的二倍体杂种植株幼穗培养加倍成杂种四倍体； d、 将c)步骤的杂种四倍体与光温敏不育系四倍体回交； e、 。
4、从回交后代中选育出四倍体不育株； f、 选择的四倍体不育株在低温短日照的可育期自交， 自交后再与另一亲本复合杂交； g、 挑选杂交后的四倍体不育株自交系连续自交8-9代； h、 检测连续自交后的四倍体光温敏不育系的稳定性， 包括染色体数目4X48， 温光条 件下的育性转换； 检测与四倍体恢复系杂交的异配性和杂种优势； i、 确定稳定一致的四倍体水稻不育系为多倍体水稻光温敏雄性不育系， 简称S-4x。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106538372 A 2 一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系的选育方法 技术领域 0001 本发明涉及一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系的选育方法， 属于现。
5、代农业的作 物新品种选育技术领域。 背景技术 0002 杂种优势是生物界普遍存在的现象。 上世纪70年代以袁隆平为代表的科学家完成 的水稻三系(雄性不育系、 雄性不育保持系和雄性不育恢复系)杂交形成的三系杂交水稻被 称为第二次绿色革命， 为中国水稻生产起了重大推动作用。 此后的石明松(1983)发现的湖 北光敏感核不育系， 具有在不同日照长度下雄花育性存在可育与不育的不同表现。 这种在 长日高温下雄性不育、 短日低温下雄性可育的不育系， 称为光温敏雄性核不育系； 由于该不 育系具有不育和可育的两种特性， 可以一系两用， 所以该不育系与恢复系配制的杂种称为 两系杂种。 0003 但是， 目前全世。
6、界应用的水稻都是二倍体， 在世界粮食短缺危机形势下， 需要大幅 度增产， 才能解决饥饿问题。 而受有性生殖和二倍体性的限制， 水稻生产自上世纪80年代以 来长期在高产徘徊。 为此， 蔡得田、 袁隆平等(2001)提出 “利用远缘杂交和多倍体双重优势 选育超级稻” 的新战略， 确定多倍体水稻亚种间、 种间、 基因组间杂种优势利用三步战略， 把 解决多倍体水稻育种结实率低的瓶颈问题作为重中之重的问题来解决。 其后， 利用组织培 养和秋水仙素处理相结合高效率诱导形成多倍体水稻的专利技术和选育出 “多倍体减数分 裂稳定性PMeS” 高结实品系(PMeS多倍体减数分裂稳定性的英文缩写)， 突破了多倍体水。
7、稻 结实率低的瓶颈问题， 从而带来多倍体水稻育种的快速发展。 大批多倍体水稻材料已经构 成， 一批多倍体水稻常规品系正进入品种区试阶段。 0004 如果能充分利用多倍体杂种优势， 选育多倍体水稻不育系、 多倍体水稻恢复系和 配制多倍体杂种， 将会使水稻生产推向新阶段， 对于保障世界粮食安全将具有极其重要的 作用。 发明内容： 0005 本发明的目的是提出一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系选育方法， 它是充分利 用多倍体杂种优势， 选育多倍体水稻不育系。 0006 本发明是这样实现的。 一种多倍体水稻光温敏雄性核不育系选育方法， 它包括： 0007 a)、 确定具有光温敏雄性核不育性和多倍体减数分。
8、裂稳定性PMeS的水稻品系作为 亲本(PMeS多倍体减数分裂稳定性的英文缩写)。 比如典型的光温敏雄性核不育系培矮64S 是一种籼型光温敏核不育系， HN58S是粳型光温敏核不育系， 它们具有短日低温条件下可 育， 而长日高温下不育的育性转换特性， 而HD9802S是另一种籼型光温敏核不育系， 它除了 受光照长短影响外， 温度起更重要作用， 它们可作为杂交亲本； PMeS-1(Sg99012)、 PMeS-2 (HN2026)及其衍生系的对应二倍体系具有多倍体减数分裂稳定性(PMeS)特性， 可以作为杂 交的另一亲本； 说 明 书 1/4 页 3 CN 106538372 A 3 0008 b。
9、)、 二倍体光温敏雄性不育系与二倍体PMeS品系杂交。 即利用二倍体培矮64S等不 育系与PMeS-2HN2026-2X、 PMeS-1Sg99012-2X或其衍生品系杂交为二倍体杂种。 0009 c)、 将b)步骤的二倍体杂种植株幼穗培养加倍成杂种四倍体。 即采取培矮64S X HN2026-2X或HD9802S X HN2026-2X或它们与Sg99012-2X杂交的杂种植株处于幼穗分化的 二次枝梗减数分裂期的幼穗进行组织培养， 形成旺盛生长的愈伤组织； 再将愈伤组织转 入加倍培养液中培养而后分化成杂种四倍体。 0010 d)将c)步骤的杂种四倍体与光温敏雄性核不育系四倍体回交。 即利用上。
10、述已加倍 获得的杂种植株， 待其开花时去雄与光温敏雄性核不育系四倍体， 如PA64S-4X或HD9802S- 4X进行回交得到回交一代杂种。 0011 e)从回交后代中选择出四倍体雄性不育株。 由于水稻光温敏雄性核不育是隐性基 因控制的， 因此在回交一代杂种中还存在有可育植株， 而且还要根据育种目标挑选雄性不 育与形态性状好的植株。 0012 f)选择的四倍体雄性不育株在低温短日照的可育期自交。 将在夏季确定的不育株 稻蔸移至海南或人工气候箱中使其处于低温短日状态恢复育性而自交结实； 从这些植株中 选择低温短日结实性的植株， 自交后再与另一亲本杂交， 说明该植株中不仅含有核不育性， 而且含有P。
11、MeS基因的高结实性。 0013 g)挑选四倍体雄性不育自交系连续自交8-9代。 如f)步骤所进行的那样挑选不育 株， 带稻蔸至海南繁种连续自交8-9代。 0014 h)检测连续自交后的四倍体光温敏雄性核不育系的稳定性， 包括染色体数目(4X 48)， 花药不育的形态特征、 花粉育性、 柱头性状， 光温条件下的育性转换及与四倍体恢复 系杂交的异配性和杂种优势。 四倍体水稻一般具有茎秆粗壮、 叶色浓绿的形态特征， 取根尖 染色体观察确定4X48为四倍体(附图1)； 四倍体雄性不育系的花药虽然比二倍体不育系 的花药长大许多， 但仍然是乳白色、 箭头状(附图2)， 在0.05KI-I染色后显微镜观察。
12、， 四倍 体不育株在可育期花粉圆大、 黑色， 而在不育期则花粉畸形， 染色呈浅黄色或极浅的灰黑色 (附图3)； 挑选不育株的花朵内雌蕊柱头较发达、 具有40左右单边外露率及具明显的不同 温光条件下的育性转换特性， 而且一旦进入不育期则不育性稳定不返回可育的特点直达25 天以上； 而在可育的短日低温下具有40以上的结实率。 此外， 该不育株与具有恢复性的四 倍体恢复系测交容易获得杂交种子、 其杂种种植后具有比父、 母亲本更强的杂种优势。 0015 i)确定稳定一致的四倍体水稻不育品系为多倍体水稻光温敏雄性核不育系， 经过 h)步骤的多项检测和比较后， 挑选出的形态特征稳定一致、 不育性稳定(不育。
13、率100， 不育 度99.5)、 可育期结实率高(40)、 异配性好， 杂种优势强的雄性不育系， 称为四倍体水 稻光温敏雄性核不育系， 简称S-4x。 0016 本发明的优点是： 将二倍体光敏核不育性由二倍体变成多倍体， 经过与具有减数 分裂稳定性PMeS品系杂交而克服多倍体水稻结实率低的瓶颈问题， 从而获得光温敏不育和 可育期高结实的多倍体不育系， 用于多倍体水稻杂种选育。 附图说明 0017 图1多倍体水稻不育系根尖染色体(2n4x48)； 0018 图2二倍体不育系与四倍体不育系的花器比较， 说 明 书 2/4 页 4 CN 106538372 A 4 0019 其中左边为二倍体花器， 。
14、左边为二倍体花器； 0020 图3多倍体水稻光温敏雄性不育系花粉育性， 0021 其中A.不育期； B.育性转换期； C.可育期； 0022 图4多倍体水稻光温敏雄性不育系植株。 具体实施方式 0023 下面以实施例多倍体水稻光(温)敏雄性核不育系-WS006-4x的选育过程对本发 明作进一步说明。 0024 1.多倍体水稻不育系WS006-4x选育程序说明如下： 0025 1.1多倍体水稻不育系WS006选育程序图 0026 0027 (其中S为光温敏雄性核不育系的简写) 0028 1.2、 选育程序说明a.确定具有光温敏雄性核不育性的PA64S和多倍体减数分裂稳 定性(PMeS)的水稻品系。
15、HN2026作为亲本； b.二倍体光温敏雄性不育系与二倍体PMeS品系杂 交， 即利用二倍体不育系PA64S与HN2026-2X杂交； c.F1杂种植株幼穗培养加倍成杂种四倍 体。 即采取PA64SHN2026-2X杂交的杂种植株处于幼穗分化的二次枝梗减数分裂期的幼 穗进行组织培养， 形成旺盛生长的愈伤组织,再将愈伤组织转入加倍培养液中培养而后分 化成四倍体杂种； d.杂种四倍体与光温敏雄性核不育系四倍体回交。 即利用上述已加倍获 得的杂种植株， 待其开花时去雄与光温敏雄性核不育系四倍体， 如PA64S-4X进行回交得到 回交一代杂种(BC1F1)； e.从回交后代中选择出四倍体雄性核不育株(。
16、S株,武汉)； f.为确定 选择的四倍体雄性核不育株在低温短日照的可育期育性， 将在夏季确定的不育株稻蔸移至 海南使其处于低温短日状态恢复育性而自交结实， 得到BC1F2,； g.再与另一四倍体水稻品系 A175-4X复合杂交而得到RCF1， 经自交后得RCF2(简写F2)， h.从中挑选S株自交成F3， 雄性不 育株系再自交得到F4， 如此连续自交8代， 即在武汉进行挑选不育株， 带稻蔸至海南繁种连 续自交8代； i.检测四倍体光温敏雄性核不育系的稳定性， 包括染色体数目(4X48)， 花药 不育的形态特征、 花粉育性、 柱头性状， 光温条件下的育性转换及与四倍体恢复系杂交的异 配性和杂种优。
17、势。 该四倍体水稻具有茎秆粗壮、 叶色浓绿的形态特征且整齐一致(附图4)， 取根尖染色体观察确定4X48为四倍体(附图1)； 四倍体雄性不育系的花药虽然比二倍体 不育系的花药长大许多， 但仍然是乳白色、 箭头状(附图2)， 在0.05KI-I染色后显微镜观 察， 四倍体不育株在可育期花粉圆大、 黑色， 而在不育期则花粉畸形， 染色呈浅黄色或极浅 的灰黑色(附图3)。 选育不育株的花朵内雌蕊柱头较发达、 具有40左右单边外露率及具明 显的不同温光条件下的育性转换特性， 而且不育性稳定不返回可育期直达25天以上； 而在 可育的短日低温下具有40以上的结实率。 此外， 该不育株与具有恢复性的四倍体恢。
18、复系 测交容易获得杂交种子(异交率35-45)、 其杂种种植后具有比父、 母亲本更强的杂种优 势。 J.确定该稳定一致的四倍体水稻不育品系为多倍体水稻光温敏雄性核不育系。 经过h. 的多项检测和比较后， 选育出的形态特征稳定一致、 不育性稳定(不育率100， 不育度 说 明 书 3/4 页 5 CN 106538372 A 5 99.5)、 可育期结实率高(40)、 异配性好， 所配杂种优势强的雄性不育系， 将该四倍体 水稻光温敏雄性核不育系， 简称为WS006-4x。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106538372 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 106538372 A 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 106538372 A 8 。