技术领域
苝醌化合物在制备防冶牛、羊、驴、马等反刍动物病毒的饲料中的应用，本发明涉及采用苝醌化合物添加到饲料中用于制备防治反刍动物病毒的饲料。属于生物工程及农业技术领域。
背景技术
近年来，随着我国经济的发展和生活水平的提高，牛奶业和牛肉业成为畜牧业结构调整的亮点。同时羊业也是我国边疆和少数民族地区经济发展的支柱产业。
但随着养殖规模的不断扩大，也会带来大规模的流行病爆发，给养殖场造成巨大的损失。尤其是病毒性疾病具有传染性强和死亡率高的特点。如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、致细胞病变型牛腹泻-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、羊痘病毒(capripoxvirus)、马麻疹病毒(Epuine morbillivirus，EMV)等均是反刍动物养殖中的主要病毒性疾病的病源。
专利CN200810166154.2，CN03103300.8和CN200680051113.8等采用疫苗的方法进行病毒的防治，然而动物病毒不仅种类多，而且变异迅速，经常是防不胜防。金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦和扎那米韦等是常用抗病毒药，但其药物疗效并不确切，而且存在残留等问题。
专利CN200610072935.6报导金丝桃素是一种广谱的抗病毒化合物，对于口蹄疫等病毒有着较好的杀灭作用。金丝桃素是从中草药贯叶连翘中提取得到的一种菲并醌类(Phenanthroperylenequinone)化合物，其表现出了广谱的良好的病毒杀灭效果。然而金丝桃素化学性质不稳定，见光易分解，在实际应用中有相当一部分金丝桃素无法被有效利用。
我们研究发现苝醌(Perylenequinone)类化合物具有较好的广谱抗病毒的效果。苝醌化合物与金丝桃素相比，具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。因此本发明公开了一种苝醌化合物应用于反刍动物饲料的方法，从而有效地进行禽类病毒的防治。
发明内容
本发明的目的是将苝醌化合物应用于饲料中用于预防和治疗反刍动物病毒感染病。
本发明涉及到的相关特征如下：
1、苝醌化合物说明
本发明所指苝醌化合物为如下所示的三种母核为基本结构，并以此三种母核结构进行基团修饰的化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH3，OCH3，COCH3，CH(OH)CH3，CHO，OH，H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。
苝醌化合物母核
特别的如竹红菌素(竹红菌甲素Hypocrellin A、竹红菌乙素Hypocrellin B)、痂囊腔菌素(痂囊腔菌甲素Elsinochrome A、痂囊腔菌乙素Elsinochrome B、痂囊腔菌丙素Elsinochrome C、痂囊腔菌丁素Elsinochrome D)、弗来菌素(Phleichrome)、枝孢素(枝孢甲素Cladosporium A、枝孢乙素Cladosporium B、枝孢丙素Cladosporium C、枝孢丁素Cladosporium D)、卡弗他丁(Calphostin A、Calphostin B、Calphostin C、Calphostin D)、hypomycin A和hypomycin B、尾孢素(Cercosporin)、Scutiaquinone A和Scutiaquinone B等。它们的化学结构参见如下相关文献：
[1]Iida，T.，E.Kobayashi，M.Yoshida，and H.Sano(1989)Calphostins，novel and specific inhibitors of protein kinase C.II.Chemical structures.J.Antibiot.42：1475-1481.
[2]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，U.Weiss，and Batterha.Tj(1969)Pigmentsof Elsinoe species.Part II.Structure of elsinochromes A，B，and C.Journal of theChemical Society C-Organic.1219-1227.
[3]Lousberg，R.J.，C.A.Salemink，and U.Weiss(1970)Pigments of Elsinoespecies.Part V.The structure of elsinochrome D.Journal of the Chemical SocietyC-Organic.2159-2162.
[4]Diwu，Z.J.，and J.W.Lown(1990)Hypocrellins and their use inphotosensitization.Photochem.Photobiol.52：609-616.
[5]Liu，W.Z.，Y.X.Shen，X.F.Liu，Y.T.Chen，and J.L.Xie(2001)A newperylenequinone from Hypomyces sp.Chinese Chemical Letters.12：431-432.
[6]Yoshihara，T.，T.Shimanuki，T.Araki，and S.Sakamura(1975)Phleichrome，a new phytotoxic compound produced by Cladosporium phlei.Agric.Biol.Chem.39：1683-1684.
[7]Ayers，S.，D.L.Zink，K.Mohn，J.S.Powell，C.M.Brown，T.Murphy，R.Brand，S.Pretorius，D.Stevenson，D.Thompson，and S.B.Singh(2007)Scutiaquinones A and B，perylenequinones from the roots of Scutia myrtina withanthelmintic activity.Journal of Natural Products.70：425-427.
[8]Lousberg，R.J.，U.Weiss，C.A.Salemink，A.Arnone，L.Merlini，andG.Nasini(1971)The structure of cercosporin，a naturally occurring quinone.Journalof the Chemical Society D-Chemical Communications.1463-&.
[9]Arnone，A.，G.Assante，V.Dimodugno，L.Merlini，and G.Nasini(1988)Perylenequinones from cucumber seedlings infected with Cladosporiumcucumerinum.Phytochemistry.27：1675-1678.
2、苝醌化合物的来源
竹红菌素来源有：(1)天然的长于竹子上的竹黄菌(Shiraia bambusicola)子实体和竹红菌(Hypocrella bambusae)子实体；(2)根据专利CN200710132510.4和CN200910182255.3所述的方法采用竹黄菌进行液态发酵或固态发酵制得。
竹黄菌株可为：Shiraia sp.SUPER-H168保藏号为CCTCC NO：M 207104或其它可从菌种保藏机构购买到的Shiraia bambusicola菌株。
痂囊腔菌素可用Elsinoe fawcettu ATCC 38162或其它可从菌种保藏机构购买到的Elsinoe fawcettu菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
枝孢素可用Cladosporium cucumerinum.ATCC 11279或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cucumerinum菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
卡弗他丁可用Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium cladosporioides菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
尾孢素可用Cercospora kikuchii ATCC 42152或其它可从菌种保藏机构购买到的Cercospora kikuchiis菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
弗来菌素可用Cladosporium phlei ATCC 36193或其它可从菌种保藏机构购买到的Cladosporium phlei菌株通过固态发酵或液态发酵方法制得。
Scutiaquinone可从对刺藤属植物Scutia myrtina的根部采用乙醇提取得到。
以上所有菌种的固态发酵条件均可为：采用粮食为主要原料，并将其粉碎至50-80目，另添加以主要原料计的0.5％-2％葡萄糖、0.1％-0.5％KH2PO4、0.01％-0.08％MgSO4·7H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶1-1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接入5％-10％液体种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24-32℃，发酵过程控制湿度80％-90％，5-15天发酵结束。粮食原料可为：大米、小米、玉米、小麦、荞麦、高粱、黑米、豆粕、大豆、或赤豆。
以上所有菌种的液态发酵条件均可为：碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，土豆100-200g/L，磷酸氢二铵1-2g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸镁0.1-0.8g/L；121℃灭菌20min，灭菌冷却后接入菌种，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；碳源可为葡萄糖、果糖、蔗糖或可溶性淀粉。氮源可为无机铵盐(如NH4Cl)、无机硝酸盐(如NaNO3、NH4NO3)、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、或豆饼粉。
3.苝醌化合物在饲料中的添加方法
预防病毒的剂量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，将苝醌化合物拌入饲料中饲喂，在反刍动物的生长过程中始终添加。
对于感染病毒的反刍动物的治疗剂量为每天10μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，疗程为2至7天。
所述反刍动物病毒为口蹄疫病毒、致细胞病变型牛腹泻-粘膜病病毒、蓝舌病病毒、羊痘病毒、或马麻疹病毒等。
(1)对于天然竹黄菌或竹红菌子实体来源的苝醌化合物：根据反刍动物的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的竹黄菌或竹红菌子实体粉碎至40-60目，然后均匀混入反刍动物的日常饲料的精料中。
(2)对于固态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据反刍动物的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入反刍动物的日常饲料的精料中。
(3)对于液态发酵得到的苝醌化合物：待发酵结束后，离心去除液体得到菌丝体等固形物，50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据反刍动物的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入反刍动物的日常饲料的精料中。
(4)对于固态发酵或液态发酵产物：可在发酵产物中加入1倍重量的乙醇，过滤去固形物，将苝醌化合物萃取做成粗提物，50-60℃烘干，然后粉碎至40-60目，根据反刍动物的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的粉碎物均匀混入反刍动物的日常饲料的精料中。
(5)对于植物Scutia myrtina：Scutiaquinone主要存在于根部，根据反刍动物的体重和苝醌化合物需求量，取一定量的Scutia myrtina根，首先用乙醇将Scutiaquinone从根部萃取出来(乙醇∶根＝1∶0.5-1∶3，重量比)，过滤去除根茎，50-60℃真空浓缩去除酒精并烘干，再将其粉碎至40-60目，然后根据需求量均匀混入反刍动物的日常饲料的精料中。
(6)这些苝醌化合物可以通过制备色谱纯化为单体，混入反刍动物的日常饲料的精料中。制备纯化的条件如先前发表的文献所述。Xiao-Hui Lianga，Yu-JieCai，Xiang-Ru Liao，Kang Wu，Lei Wang，Da-Bing Zhang and Qiang Meng(2009).Isolation and identification of a new hypocrellin A-producing strain Shiraia spSUPER-H168.Microbiological Research 164(1)：9-17.
(6)不同来源的苝醌化合物可以根据实际情况按任意比例混合使用。
本发明的有益效果：本发明涉及采用苝醌化合物添加到反刍动物饲料中制备用于防治反刍动物病毒的饲料，如口蹄疫病毒、致细胞病变型牛腹泻-粘膜病病毒、蓝舌病病毒、羊痘病毒、马麻疹病毒等。苝醌化合物包括：竹红菌素、痂囊腔菌素、弗来菌素、枝孢素、卡弗他丁、尾孢素等，苝醌化合物具有提取方便、稳定性好、口服无明显副作用和代谢快等一系列优点。制备预防反刍动物病毒的饲料中的剂量为每天1-10μmol苝醌化合物/kg体重，制备治疗反刍动物病毒的饲料中的剂量为10μmol-100μmol苝醌化合物/kg体重，防治病毒的效果非常显著，同时苝醌化合物可通过现代生物技术生产得到，可产生良好的经济和社会效益。
具体实施方式
实施例1：苝醌化合物体外抗病毒实验
(1)体外抗病毒实验用细胞的准备
以BHK-21细胞(幼仓鼠肾传代细胞，Baby hamster kidney cells)研究苝醌化合物对口蹄疫病毒(FMDV)的作用。生长培养基：将购得的MEM(modified eaglemedium)培养基，另加入NaHCO32.0g/L，2％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素。将BHK-21细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用MEM生长培养基稀释成1×106细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
以Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，Verda Reno)研究苝醌化合物对蓝舌病毒(BTV)的作用。生长培养基：将购得的MEM培养基，另加入110mg/L丙酮酸钠，300mg/L L-谷氨酰胺，200mg/L NaHCO310％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素。将Vero细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用MEM生长培养基稀释成1×106细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
以BTC细胞(犊牛睾丸细胞，Bovine testicular cells)研究苝醌化合物对致细胞病变型牛腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的作用。生长培养基：DMEM(Dulbecco′smodified eagle medium)，含4500mg/L D-葡萄糖、300mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，5％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素)。将BTC细胞用0.25％的胰酶消化后，吹打使细胞分散，用DMEM生长培养基稀释成1×106细胞/mL，加至96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长成单层细胞后，进行体外抗病毒试验。
(2)体外抗病毒实验用病毒半数组织培养感染剂量(Tissue culture infectivedose，TCID50)的测定
细胞长成单层后，接种10-2-10-1稀释度的病毒液(0.1mL/孔)，每个稀释度接种8孔，于5％CO2培养箱中37℃培养120h，每天观察细胞病变(CEP)情况，根据Reed-Muench公式计算病毒的TCID50(Reed，L.J.；Muench，H.(1938).A simplemethod of estimating fifty percent endpoints.The American Journal of Hygiene 27：493-497.)。
(3)MTT染色法计算细胞存活率
MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)进行细胞染色(终浓度0.5g/L)检测细胞存活和生长。用酶标仪测定490nm处的吸光度值(OD)，按下列公式计算细胞成活率：细胞存活率(％)＝[加苝醌组OD/正常细胞组OD]×100％。
(4)苝醌化合物对细胞的毒性试验
用DMSO将Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome分别配制成0.01、0.1、02、0.4mmol/mL，分别加入到长成的BHK-21、Vero及BTC细胞中，并以不含加苝醌化合物的BHK-21、Vero及BTC细胞作对照，每一个测试3瓶，在37℃，5％CO2培养箱培养120小时，这些培养在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，测定细胞存活率。
实验结果发现，所有测试细胞的存活率均在99.6％左右，因此在上述浓度下苝醌化合物对细胞无明显细胞毒作用。
(5)苝醌化合物对病毒的直接灭活作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒的直接灭活作用。100TCID50病毒液中加入苝醌化合物(溶解在DMSO[Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜]中)，使苝醌化合物在病毒液中浓度的分别达到0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L，在37℃，5％CO2培养箱中培养1h后，感染上述培养好的对应细胞。倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的FMDV、BTV和BVDV病毒对照组的细胞存活率分别为8.4％、8.0和8.1％。加苝醌化合物的细胞存活率如表1所示。
表1：细胞存活率(％)
(6)苝醌化合物对病毒侵入细胞的阻断作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒侵入细胞的阻断作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，将苝醌化合物以0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L浓度(溶解在DMSO中)，分别加到细胞培养板上，0.1mL/孔，每个尝试度重复3孔。37℃作用4h，弃去液体，每孔加入100TCID50病毒液0.1mL，另设细胞对照和病毒对照。5％CO2，培养箱37℃培养120h。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的光剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，用倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％、细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析，并计算出细胞存率。
不加苝醌化合物的FMDV、BTV和BVDV病毒对照组的细胞存活率分别为9.3％、9.0和9.5％。加苝醌化合物的细胞存活率如表2所示。
表2：细胞存活率(％)
(7)苝醌化合物对病毒增殖的抑制作用
测定苝醌化合物Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B、Cladosporium A、Elsinochrome A、Scutiaquinone A、Cercosporin及Phleichrome对病毒增殖的抑制作用。取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100TCID50的病毒液，100μL/孔，置37℃，5％CO2培养箱中吸附4h。弃去病毒液，分别加入不同浓度为0.05、0.1、0.2、0.4mmol/L的苝醌化合物(溶解在DMSO中)，0.1mL/孔，每个浓度重复3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照。5％CO2培养箱37℃培养。这些实验分别在暗室(无光照)和有光照条件下进行平行实验，所用光源为波长在470-590nm的荧光灯，总的照射进入的剂量为9KJ(用光度计测定)。细胞培养过程中，倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达75％-100％细胞对照正常时，用MTT染色法进行结果分析。
不加苝醌化合物的FMDV、BTV和BVDV病毒对照组的细胞存活率均为8.4％左右。加苝醌化合物的细胞存活率如表3所示。
表3：细胞存活率(％)
(8)结论
由以上实验可以知道，苝醌化合物对于测试用反刍动物病毒均有杀灭作用，是广谱的抗病毒化合物。其中Calphostin C、Hypocrellin A、Hypocrellin B及Elsinochrome A的效果最好，其它苝醌化合物稍弱。另外在光照条件下，抗病毒效果也优于无光的条件，这主要是由于苝醌化合物在光照下会产生超氧离子等产物，其光敏氧化产物可以增强抗病毒能力。
实施例2：固态发酵竹红菌素添加于饲料中的抗羊FMDV实验
实验中羊的基础日粮配方为：
精饲料配方：玉米46％，麸皮20％，棉粕或菜粕30％，石粉1％，磷酸氢钙1％，食盐1％，预混料1％(可为每kg饲料提供维生素A 1200IU，维生素D 32500IU，维生素E 30IU，维生素K 3mg，核黄素4mg，烟酸40mg，泛酸15mg，氯化胆碱400mg。叶酸700g，硫胺素VB 1.5mg，维生素B 3mg，生物素100g，Zn 80mg，Mn 20mg，Fe 83mg，Cu 25mg)，粒径1-2毫米。最终羊的日粮中：禾本科干草占45％，青贮玉米23％，精料32％。
采用固态发酵法生产竹红菌素，玉米为主要原料，另添加以玉米重量计的2％葡萄糖、0.2％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O。加水拌料湿，料水比控制在1∶0.7，121℃灭菌45-60min，冷却后接10％液体竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵过程控制湿度90％，发酵10天结束。60℃烘干去除水份，测定其中竹红菌甲素占8.4％，竹红菌乙素占1.3％。其它苝醌化合物总量占0.4％。
平均体重10公斤的断奶羔羊40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头羊。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物54.1mg，这样使羊的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组3：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物270.3mg，这样使羊的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组4：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的竹红菌素固态发酵物540mg，这样使羊的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加固态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素固态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有羊连续吃添加了含有竹红菌素的饲料10天后，用1mL的1×106TCID50/mL FMDV病毒培养液对所有组的所有羊进行注射攻毒，然后每日测定每头羊体温变化，观察每头羊临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：所有羊攻毒2天后出现口腔黏膜、齿龈、唇部、舌部及趾间等发生水泡或糜烂症状，并逐渐症状严重，所有羊体温升高到40℃左右。至14天共有8只羊死亡，另外2只症状逐渐减轻并恢复正常。
试验组2：2头羊于攻毒后第2天以后体温开始升高到40℃，持续5天，并出现口腔和趾间发生水泡症状，5天后症状逐渐恢复正常。其它羊观察21天仍健活。
试验组3：所有羊观察21天均健活。
试验组4：所有羊观察21天均健活。
由此实验看出竹红菌素对于羊起到了非常好的保护作用。
实施例3：液态发酵竹红菌素添加于饲料中的抗牛BVDV病毒实验
实验基础日粮：玉米48％、麸皮14％、棉籽饼35％、石粉1.0％、骨粉0.5％、食盐1.0％、碳酸氢钠0.5％。
采用液态发酵法生产竹红菌素，每升培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨50g，土豆200g，(NH4)2HPO42g，KH2PO42g，MgSO40.5g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体竹黄菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度30℃，发酵72h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中竹红菌甲素占8.1％，竹红菌乙素占1.3％，其它苝醌化合物总量占0.2％。
平均体重100kg断奶体况良好的小牛40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头小牛。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：实验用牛一天食量大约是3kg，根据其体重在其3kg基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物568.8mg，这样使牛的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据牛的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组3：实验用牛一天食量大约是3kg，根据其体重在其3kg基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物2.8g，这样使牛的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据牛的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组4：实验用牛一天食量大约是3kg，根据其体重在其3kg基础日粮中均匀混入烘干粉碎的烘干液态发酵物5.7g，这样使牛的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据牛的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了竹红菌素液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有牛连续吃添加了竹红菌素的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/mL BVDV病毒培养液对所有组的所有牛进行注射攻毒，然后每日测定每头牛体温变化，观察每头牛临床症状，观察14天。观察结果如下：
试验组1：所有牛于3天后体温轻微升高，粪便变稀变软。随后第6天粪便中出现血液和粘液，上颚有浅青溃疡斑。观察期内始终有类似症状。
试验组2：所有牛体温和临床症状均无明显变化，观察14天均健活。
试验组3：所有牛体温和临床症状均无明显变化，观察14天均健活。
试验组4：所有牛体温和临床症状均无明显变化，观察14天均健活。
由此实验看出竹红菌素对于牛起到了非常好的保护作用。
实施例4：液态发酵卡弗他丁添加于饲料中的抗羊BTV病毒实验
实验基础日粮与实施例2相同。
采用液态发酵法生产卡弗他丁，每升培养基组成为：葡萄糖5g，酵母膏5g，土豆100g，(NH4)2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.1g/L，121℃灭菌20min，冷却后接10％液体Cladosporium cladosporioides CGMCC 34593菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度28℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，其中Calphostin A占0.029％，Calphostin B占0.025％，Calphostin C占0.85％，Calphostin D占0.02％，Calphostin I占0.01％。
平均体重10公斤的断奶羔羊40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头羊。饲喂方式为自由采食及饮水。实验按如下分为四组：
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物0.8g，这样使羊的每日摄入量约为1μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组3：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物4.0g，这样使羊的每日摄入量约为5μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组4：实验用羊的一天食量大约是300g精料和相应比例的干草及青贮玉米。根据其体重在其300g精料中均匀混入烘干粉碎的卡弗他丁液态发酵物8.0g，这样使羊的每日摄入量约为10μmol/kg。以后逐日根据羊的食量和体重增加液态发酵物混入量。整个实验过程均吃添加了卡弗他丁液态发酵物的饲料。
试验组2、3、4所有羊连续吃添加了含有卡弗他丁的饲料7天后，用1mL的1×106TCID50/mL BTV病毒培养液对所有组的所有羊进行注射攻毒，然后每日测定每头羊体温变化，观察每头羊临床症状，记录死亡数，观察21天。观察结果如下：
试验组1：攻毒3天后所有羊体温升高达40～42℃，精神萎顿，流涎，口腔黏膜和舌头充血，舌头发绀。7天时死亡2只羊，第8天死亡2只羊。其它羊未死亡，有2只于第10天恢复正常，另有3只于第12天恢复正常，1只于第14天恢复正常。
试验组2：所有羊观察21天均健活。
试验组3：所有羊观察21天均健活。
试验组4：所有羊观察21天均健活。
由此实验看出卡弗他丁对于羊起到了非常好的保护作用。
实施例5：液态发酵的痂囊腔菌素冶疗牛FMDV感染。
平均体重100kg断奶体况良好的小牛40头，根据体重相近、公母各半、随机分组的原则分为4个组，每组10个重复，每个重复1头小牛。饲喂方式为自由采食及饮水。
采用液态发酵法生产痂囊腔菌素，每升培养基组成为：葡萄糖25g，牛肉膏25g，土豆100g，(NH4)2HPO41.5g，KH2PO41.5g，MgSO40.8g/L，121℃灭菌20min，冷却后接5％液体Elsinoe fawcettii ATCC 38162菌种子。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度24℃，发酵96h结束。离心去除发酵液得到菌丝体，60℃烘干，测定其中Elsinochrome A占0.012％，Elsinochrome B占0.021％，Elsinochrome C占0.034％，Elsinochrome D占0.05％。用与菌丝等重量的酒精，萃取菌丝体，然后60℃烘干去除酒精，得到痂囊腔菌素粗提物，其中痂囊腔菌素总含量为11.7％，各种痂囊腔菌素比例未变，以此得到的痂囊腔菌素用于小牛的抗病毒治疗。
用1mL的1×106TCID50/ml FMDV病毒培养液对所有组的所有小牛注射攻毒。3天内集中全群发病，测试体温达41℃，在牛的唇内面、齿龈、舌面和颊丫粘膜上发生蚕豆至核桃大的水泡。将痂囊腔菌素与少量基础日粮混合后，当小牛饥饿时首先喂食添加痂囊腔菌素的饲料，若无进食能力则进行灌服。
试验组1：空白对照组，整个实验过程仅饲喂基础日粮。
试验组2：将干燥后的酒精提取物4.7g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使小牛的每日摄入量约为10μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素的饲料3天。
试验组3：将干燥后的酒精提取物23.3g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服。这样使小牛的每日摄入量约为50μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素的饲料3天。
试验组4：将干燥后的酒精提取物46.6g与50g基础日粮均匀混合，一次性喂服，这样使小牛的每日摄入量约为100μmol/kg。连续吃含有痂囊腔菌素饲料3天。
观察每头小牛临床症状，观察21天。观察结果如下：
试验组1：攻毒后，8天左右有3头小牛自愈，10天左右有4头小牛死亡，14左右有3头小牛自愈。
试验组2：开始治疗后，3天左右所有小牛症状消失，5天康复。
试验组3：开始治疗后，3天左右所有小牛症状消失，5天康复。
试验组4：开始治疗后，3天左右年有小牛症状消失，5天康复。
由此实验看出痂囊腔菌素对于小牛感染病毒有非常好的治疗作用。
上述实施例1-5只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明实质内容所作的等效变化变或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。