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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810044896.1 (22)申请日 2018.01.17 (71)申请人 山西省农业科学院玉米研究所 地址 034000 山西省忻州市新建北路14号 (72)发明人 赵变平 王建军 邵林生 杨俊伟 陈朝辉 李彦良 贾鑫 罗绮 王志虹 焦建伟 (74)专利代理机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 代理人 韩晓娟 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种利用EMS诱变产生。
2、玉米突变体的方法 (57)摘要 本发明属于玉米育种技术领域， 具体涉及一 种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法。 包括花 粉收集、 花粉诱变处理和人工授粉步骤， 其中收 集的花粉除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶液 中， 按以下步骤进行诱变： (1)在紫外灯下方照射 3060s， (2)避光搅拌2030min， (3)在紫外灯 下方照射1530s， (4)避光搅拌1520min； 其中 人工授粉前， 在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂 抹EMS-石蜡油溶液， 得到诱变处理花丝， 然后进 行人工授粉。 本发明利用紫外与EMS的诱变机理 不同， 将两种诱变方式相结合， 通用性良好， 还对 花丝进行了。
3、诱变处理， 使雌蕊中部分基因发生突 变， 突变率较高。 权利要求书1页 说明书7页 CN 107950388 A 2018.04.24 CN 107950388 A 1.一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1， 花粉收集 给处于散粉早期玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 得到待授粉玉米植株； S2， 花粉诱变处理 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶液中， 按以下 步骤进行诱变： (1)在紫外灯下方照射3060s， (2)避光搅拌2030min， (3)在紫外灯下方 照射153。
4、0s， (4)避光搅拌1520min， 得到诱变花粉溶液； 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.050.06:2:50的体积比例混合 制成的； S3， 人工授粉 人工授粉前3060mim， 在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 得到诱 变处理花丝， 然后进行人工授粉， 人工授粉时将S2的诱变花粉溶液均匀刷在诱变处理花丝 上， 套袋， 正常田间管理直至收获玉米， 得到玉米突变体。 2.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， S1中， 处于 散粉早期玉米是指即将散粉或者刚开始散粉2d内的玉米。 3.根据权利要求1所述的利用EM。
5、S诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， S2中， (1) 和(3)是将花粉置于15W紫外灯正下方30cm处照射。 4.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， S2中， 每5 10ml EMS-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉。 5.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， S2中， 搅拌 转速为5001000r/min。 6.根据权利要求1所述的利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 其特征在于， S3中， 待玉 米的花丝抽出12d后的下午6:00对花丝进行整理， 第二天中午11:30在雌穗花丝上涂抹 EMS-石蜡油溶液， 中午1。
6、2:00进行人工授粉。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107950388 A 2 一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法 技术领域 0001 本发明属于玉米育种技术领域， 具体涉及一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方 法。 背景技术 0002 玉米是世界上仅次于小麦和水稻的农作物， 通过杂交手段培育的新品种的发展空 间小， 品种的抗逆性不全面。 利用诱变技术培育玉米新品种， 其变异范围广， 可产生自然突 变难以出现的新基因突变体。 目前常用的有变方法有化学诱变、 电力辐射诱变、 生物诱变以 及空间诱变等方法。 甲基磺酸乙酯是玉米常用的且使用最广的诱变剂。 利用EMS(甲基磺酸 乙酯。
7、)处理玉米花粉的诱变技术， 不仅可以创造新型使用的具有经济价值的突变体种质资 源， 而且为玉米生长发育等基础性研究提供较高学术价值的玉米突变体。 0003 由于玉米不同自交系对EMS的敏感程度不同， 而且玉米自交系中的特定基因不尽 相同， 甚至一些重要的基因在某些玉米自交系中根本不存在， 这就给重要突变体的筛选造 成了障碍。 目前通用的EMS诱变方法为玉米花粉诱变， 使用的EMS的体积浓度为0.667- 9.99。 中国专利CN102835300A公开了一种EMS诱变W64A花粉高效获得分蘖突变体的方法， 该方法测试了不同EMS诱变溶液浓度以及不同玉米自交系对获得玉米分蘖突变体比率的影 响， 。
8、得到了适用于W64A花粉的高效诱变溶液浓度。 但是该专利仅仅实在已公开的EMS诱变溶 液浓度范围内进行了选择， 仅仅包括EMS诱变剂一种诱变方式， 但是由于不同诱变剂对玉米 花粉的制变作用机理不同， 单一的诱变方式仅在某一方面具有高效的突变频率， 该方法与 其他玉米自交系B73、 Mo17等中的突变频率仍较低， 单一的EMS诱变方式在不同玉米自交系 中通用性较差。 发明内容 0004 为了解决上述问题， 本发明提供的一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 解决 了现有技术中单一的EMS诱变方式在不同玉米自交系中通用性较差的问题。 0005 本发明的目的是提供一种利用EMS诱变产生玉米突变体的。
9、方法， 包括以下步骤： 0006 S1， 花粉收集 0007 给处于散粉早期玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 0008 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 得到待授粉玉米植株； 0009 S2， 花粉诱变处理 0010 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶液中， 按 以下步骤进行诱变： (1)在紫外灯下方照射3060s， (2)避光搅拌2030min， (3)在紫外灯 下方照射1530s， (4)避光搅拌1520min， 得到诱变花粉溶液； 0011 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.050.06:2:50的体积比例 混合。
10、制成的； 0012 S3， 人工授粉 说 明 书 1/7 页 3 CN 107950388 A 3 0013 人工授粉前3060mim， 在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 得 到诱变处理花丝， 然后进行人工授粉， 人工授粉时将S2的诱变花粉溶液均匀刷在诱变处理 花丝上， 套袋， 正常田间管理直至收获玉米， 得到玉米突变体。 0014 优选的， 上述利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， S1中， 处于散粉早期玉米是指 即将散粉或者刚开始散粉2d内的玉米。 0015 优选的， 上述利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， S2中， (1)和(3)是将花粉置于 15W紫外灯正下方30。
11、cm处照射。 0016 优选的， 上述利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， S2中， 每510ml EMS-石蜡油 溶液加入1g除掉花药的花粉。 0017 优选的， 上述利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， S2中， 搅拌转速为5001000r/ min。 0018 优选的， 上述利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， S3中， 待玉米的花丝抽出12d 后的下午6:00对花丝进行整理， 第二天中午11:30在雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 中午 12:00进行人工授粉。 0019 与现有技术相比， 本发明提供的利用EMS诱变产生玉米突变体的方法具有以下有 益效果： 0020 1、 本发明利用。
12、紫外与EMS的诱变机理不同， 对DNA和细胞造成不同类型的损伤， 将 两种诱变方式相结合， 通用性良好， 还对花丝进行了诱变处理， 使雌蕊中部分基因发生突 变， 故突变率较高。 0021 2、 花粉收集期、 紫外处理方式、 诱变剂用量、 搅拌转速、 人工授粉时间对玉米突变 效率均有影响， 花粉收集期推迟、 长时间或者高功率的紫外照射、 高搅拌转速、 人工授粉时 间推迟都会降低突变率， 故本发明实施例的技术方案为最佳。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明， 但不应理解为本发明的限制。 下列 实施例中未注明具体条件的试验方法， 通常按照常规条件操作， 由于不涉及发明点，。
13、 故不对 其步骤进行详细描述。 0023 下述实施例中， 实验材料为四川农大正红生物可以有限公司提供的玉米自交系 K305、 R08、 21-ES、 W64a和P167。 0024 本发明提供的一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 包括以下步骤： 0025 S1， 花粉收集 0026 给处于散粉早期玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 0027 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 避免雌穗授粉， 得到待授粉玉米植株； 0028 S2， 花粉诱变处理 0029 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉用筛网除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶 液中， 按以下步骤进行诱变： (1)在紫外灯下。
14、方照射3060s， (2)避光搅拌2030min， (3)在 紫外灯下方照射1530s， (4)避光搅拌1520min， 得到诱变花粉溶液； 0030 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.050.06:2:50的体积比例 混合制成的； 配制时先将称取的EMS和水混合， 然后加入称取的石蜡油， 混匀， 现配现用； 说 明 书 2/7 页 4 CN 107950388 A 4 0031 S3， 人工授粉 0032 人工授粉前3060mim， 在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液(将 玉米花丝浸湿即可)， 得到诱变处理花丝， 然后进行人工授粉， 人工授粉时用柔软。
15、的毛刷蘸 取S2的诱变花粉溶液， 均匀刷在诱变处理花丝上， 套袋， 进行套代标记， 正常田间管理直至 收获玉米， 得到玉米突变体。 0033 具体包括以下实施例。 0034 实施例1 0035 一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 包括以下步骤： 0036 S1， 花粉收集 0037 给处于即将散粉玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 0038 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 避免雌穗授粉， 得到待授粉玉米植株； 0039 S2， 花粉诱变处理 0040 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉用筛网除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶 液中， 每5ml EMS-石蜡油溶液加入1g除。
16、掉花药的花粉， 按以下步骤进行诱变： (1)在15W紫外 灯正下方30cm处照射60s， (2)避光500r/min搅拌30min， (3)在15W紫外灯正下方30cm处照射 15s， (4)避光500r/min搅拌15min， 得到诱变花粉溶液； 0041 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.05:2:50的体积比例混合制 成的； 0042 S3， 人工授粉 0043 待玉米的花丝抽出1d后的下午6:00对花丝进行整理， 第二天中午11:30在雌穗花 丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 中午12:00进行人工授粉； 即人工授粉前30mim， 在待授粉玉米植 株的雌穗花丝上涂。
17、抹EMS-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)， 得到诱变处理花丝， 然后进 行人工授粉， 人工授粉时用柔软的毛刷蘸取S2的诱变花粉溶液， 均匀刷在诱变处理花丝上， 套袋， 进行套代标记， 正常田间管理直至收获玉米， 得到玉米突变体。 0044 实施例2 0045 一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 包括以下步骤： 0046 S1， 花粉收集 0047 给处于刚开始散粉2d内玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 0048 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 避免雌穗授粉， 得到待授粉玉米植株； 0049 S2， 花粉诱变处理 0050 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉用筛网除掉花药。
18、后， 加入到EMS-石蜡油溶 液中， 每10ml EMS-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉， 按以下步骤进行诱变： (1)在15W紫 外灯正下方30cm处照射30s， (2)避光1000r/min搅拌20min， (3)在15W紫外灯正下方30cm处 照射20s， (4)避光1000r/min搅拌20min， 得到诱变花粉溶液； 0051 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.06:2:50的体积比例混合制 成的； 0052 S3， 人工授粉 0053 待玉米的花丝抽出2d后的下午6:00对花丝进行整理， 第二天中午11:00在雌穗花 丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 中午1。
19、2:00进行人工授粉； 即人工授粉前60mim， 在待授粉玉米植 说 明 书 3/7 页 5 CN 107950388 A 5 株的雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)， 得到诱变处理花丝， 然后进 行人工授粉， 人工授粉时用柔软的毛刷蘸取S2的诱变花粉溶液， 均匀刷在诱变处理花丝上， 套袋， 进行套代标记， 正常田间管理直至收获玉米， 得到玉米突变体。 0054 实施例3 0055 一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法， 包括以下步骤： 0056 S1， 花粉收集 0057 给处于即将散粉玉米的雄穗套袋， 收集玉米花粉； 0058 选择生育期长势良好的玉米单株雌穗套袋， 。
20、避免雌穗授粉， 得到待授粉玉米植株； 0059 S2， 花粉诱变处理 0060 配制EMS-石蜡油溶液， 将S1收集的花粉用筛网除掉花药后， 加入到EMS-石蜡油溶 液中， 每8ml EMS-石蜡油溶液加入1g除掉花药的花粉， 按以下步骤进行诱变： (1)在15W紫外 灯正下方30cm处照射45s， (2)避光600r/min搅拌30min， (3)在15W紫外灯正下方30cm处照射 20s， (4)避光600r/min搅拌16min， 得到诱变花粉溶液； 0061 其中， 所述EMS-石蜡油溶液是EMS、 水和石蜡油按照0.05:2:50的体积比例混合制 成的； 0062 S3， 人工授粉 。
21、0063 待玉米的花丝抽出1d后的下午6:00对花丝进行整理， 第二天中午11:30在雌穗花 丝上涂抹EMS-石蜡油溶液， 中午12:00进行人工授粉； 即人工授粉前30mim， 在待授粉玉米植 株的雌穗花丝上涂抹EMS-石蜡油溶液(将玉米花丝浸湿即可)， 得到诱变处理花丝， 然后进 行人工授粉， 人工授粉时用柔软的毛刷蘸取S2的诱变花粉溶液， 均匀刷在诱变处理花丝上， 套袋， 进行套代标记， 正常田间管理直至收获玉米， 得到玉米突变体。 0064 下面以实施例1为例， 说明本发明方法的效果。 0065 一、 不同诱变方式效果评价 0066 (1)分组设计 0067 对照组： 不做诱变处理， 。
22、S3， 人工授粉时涂抹的是石蜡油。 实验组1组： 处理方式同 实施例1。 实验2组： S2按以下步骤进行诱变： 避光500r/min搅拌45min， 得到诱变花粉溶液； 其余步骤同实施例1。 实验3组： S3取消人工授粉前30mim， 在待授粉玉米植株的雌穗花丝上 涂抹EMS-石蜡油溶液的步骤； 其余步骤同实施例1。 0068 实验材料为四川农大正红生物可以有限公司提供的玉米自交系K305、 R08、 21-ES、 W64a和P167。 0069 (2)诱变后代处理： 上述分组收获时统计玉米的结实率， 得M0； 种植M0种子， 行宽3 米， 行距0.8米， 每行10穴， 每穴3粒种子， 每个分。
23、组各种植6行， 记录诱变处理后玉米的结实 率， 观察M0种子的出苗率、 苗高、 果穗性状， 记录突变频率。 0070 (3)结果与分析 0071 不同诱变方式处理玉米后， 结实率如表1所示， 结果显示， 同时经紫外诱变处理和 EMS诱变处理后， 实验1-3组的结实率介于50.0868.16之间， 均是适合进行花粉诱变的 适宜处理方式， 且实验1组的方法效果明显。 0072 表1不同诱变方式结实率 说 明 书 4/7 页 6 CN 107950388 A 6 0073 0074 M0种子田间种植后出现了各种变异植株， 主要包括矮化株(成株高度50cm左右)、 果穗突变株(雄花不育、 雄花结实、 。
24、无雄穗、 雌穗生长在植株顶部)、 叶形突变株(叶片皱缩、 叶色突变为白色或者黄色)， 其中雄穗果穗突变频率较高。 不同处理方式的出苗率和突变率 如表2所示。 表2结果显示， 对于不同的玉米自交系品种， 实验1组的突变率介于10.00 11.41， 且高于其他组， 各自交系之间差别不大， 说明交替使用紫外诱变和EMS诱变， 既可 以增加突变率， 而且适用于不同自交系， 适用范围广， 本发明利用紫外与EMS的诱变机理不 同， 对DNA和细胞造成不同类型的损伤， 将两种诱变方式相结合， 效果良好。 由实验2组的数 据可以看出， 虽然采用相同的诱变方式， 但是不同自交系之间的突变率差别较大(P0.05。
25、)， 说 明 书 5/7 页 7 CN 107950388 A 7 可能的原因是不同自交系之间的基因分布不同， 对EMS的抗性也不同， 因此表现出的突变率 差别较大。 实验3组的突变率普遍低于实验1组的突变率， 原因是， 实验1组还对花丝进行了 诱变处理， 使雌蕊中部分基因发生突变， 故突变率较高， 实验3组仅采用通用的花粉诱变处 理， 诱变部位较少， 故突变频率低。 0075 表2不同诱变方式出苗率和突变率 0076 0077 0078 二、 其他因素(花粉收集期、 紫外处理方式、 诱变剂用量、 搅拌转速、 人工授粉时间) 对突变率的影响。 试验材料为K305， 实验方法同实施例1， 区别在。
26、于将花粉收集期、 紫外处理 方式、 诱变剂用量、 搅拌转速、 人工授粉时间进行了适当改变， 记录的突变率如表3所示。 0079 表3其他因素对突变率的影响 说 明 书 6/7 页 8 CN 107950388 A 8 0080 0081 0082 考察不同花粉收集期对突变率的影响， 结果显示， 当玉米开始散粉第3d收集的花 粉进行诱变和人工授粉， 发现突变率降低， 原因是第3d后部分花粉散失， 花粉的总量减少。 考察不同紫外处理方式对突变率的影响， 相比于实施例1的紫外处理条件(15W紫外灯正下 方30cm处照射60s)， 长时间或者高功率的紫外照射， 均是突变率降低， 考虑原因是长时间或 者。
27、高功率的紫外照射是部分花粉致死。 考察不同诱变剂用量对突变率的影响， 结果显示， 诱 变剂用量对突变率影响不大， 随着诱变剂用量的增加， 突变率稍有降低， 但是考虑到诱变剂 的致癌危险性， 应当选取较少的量。 考察不同搅拌转速对突变率的影响， 结果显示， 大于 1000r/min的转速条件， 则突变率降低， 考虑原因是转速过大造成DNA损伤。 考察不同人工授 粉时间对突变率的影响， 玉米的花丝抽出3d后突变率降低， 考虑原因是， 花丝抽出时间过 长， 错过了最佳授粉时机， 影响了DNA的结合。 综上， 实施例1的技术方案为最佳方案。 0083 需要说明的是， 为了防止赘述， 本发明的描述了优选的实施例及效果， 尽管已描述 了本发明的优选实施例， 但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念， 则可对这些 实施例做出另外的变更和修改。 所以， 所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入 本发明范围的所有变更和修改。 0084 显然， 本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。 这样， 倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内， 则本发明也意图包含这些改动和变型在内。 说 明 书 7/7 页 9 CN 107950388 A 9 。