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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711179549.1 (22)申请日 2017.11.09 (71)申请人 沈阳静冶生物科技有限公司 地址 110000 辽宁省沈阳市皇姑区扬子江 街12号181 (72)发明人 戴速航 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代 间隔时间的方法 (57)摘要 本发明提供了一种延长白菜小孢子胚状体 再生植株继代间隔时间的方法， 本方法使用的继 代培养基为含有绵白糖2030g/L， 6-BA 0.15。
2、 0.25mg/L， 琼脂粉810g/L， NAA 0.350.45mg/ L， 卡那霉素(Kan)0.10.2mg/L， pH值为5.5 6.5的MS培养基， 培养基分装量为每100mL三角瓶 装入7080mL， 将再生植株接入培养基中， 在20 2， 光照强度20003000lx， 光周期12h/12h 的条件下培养710d后， 移入28冷藏箱中放 置， 待培养基含量下降至1020mL时取出， 进行 下一次的继代操作。 以此方法可使继代间隔时间 达到7090d， 是常规培养继代间隔时间的2 3.5倍， 可以大大减少继代转接的工作量。 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 CN 107950。
3、392 A 2018.04.24 CN 107950392 A 1.一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法， 其特征在于： 所使用的 继代培养基为： 含有绵白糖2030g/L， 6-BA0.150.25mg/L， 琼脂粉810g/L， NAA0.35 0.45mg/L， 卡那霉素(Kan)0.10.2mg/L， pH值为5.56.5的MS培养基； 培养基分装量为每 100mL三角瓶装入70mL80mL。 2.根据权利要求1所述的一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法， 其特征在于： 具体操作步骤如下， (1)将由胚状体形成的再生植株转接入含有权利要求1所述培养基的三角瓶。
4、中； (2)在202， 光照强度20003000lx， 光周期12h/12h的条件下培养710d； (3)将第(2)步接种再生植株后的三角瓶移入28冷藏箱中放置， 待培养基含量下降 至1020mL时取出， 继而进行下一次的继代转接操作。 3.根据权利要求1所述的一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法， 其特征在于： 使继代间隔时间达到7090d， 是常规培养继代间隔时间的23.5倍。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107950392 A 2 一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法 技术领域 0001 本发明涉及属于生物技术领域， 尤其涉及一种延长白菜小孢子胚。
5、状体再生植株继 代间隔时间的方法。 技术背景 0002 白菜是我国人民生活中主要的食用蔬菜之一， 长期以来深受广大群众喜爱。 为培 育新的种质资源， 育成优质白菜品种， 常规方法需要经过杂交、 回交和自交分离， 选育出理 想的材料常常需要好几个世代， 而利用小孢子培养技术， 不仅可快速得到双单倍体纯系， 还 可大大缩短育种年限， 随着国内外利用游离小孢子培养技术在芸薹属作物育种的研究中相 继取得突破， 也为此技术在实际中应用提供了基础。 0003 利用小孢子培养技术能缩短育种年限， 但在具体操作中却存在要对胚状体再生植 株进行多次继代转接再培养以保持其活性从而满足现实躲过炎热夏季入土栽培时间的。
6、问 题， 继代转接要耗费大量的人力和时间， 所以建立一种延长继代间隔时间的方法就非常重 要， 而延长继代间隔时间则主要通过延缓植株在培养基中生长速度及培养基干枯时间来实 现。 通过研究发现， 培养基的成分含量、 培养温度、 光照强度及光周期等因素均可对植株生 长速度及培养基干枯时间产生影响， 本发明通过对以上因素进行优化， 进而实现延长继代 间隔时间的目的。 发明内容 0004 一种延长白菜小孢子胚状体再生植株继代间隔时间的方法， 所使用的继代培养基 为： 含有绵白糖2030g/L， 6-BA 0.150.25mg/L， NAA 0.350.45mg/L， 琼脂粉810g/L， 卡那霉素(Ka。
7、n)0.10.2mg/L， pH值为5.56.5的MS培养基； 培养基分装量为每100mL三角 瓶装入7080mL。 0005 进一步地， 具体操作步骤为： (1)将由胚状体形成的再生植株转接入含有上述培养 基的三角瓶中。 0006 (2)在202， 光照强度20003000lx， 光周期12h/12h的条件下培养710d。 0007 (3)将第(2)步接种再生植株后的三角瓶移入28冷藏箱中放置， 待培养基含量 下降至1020mL时取出， 继而进行下一次的继代转接操作。 0008 进一步地， 可使继代间隔时间达到7090d， 是常规培养继代间隔时间的23.5 倍。 附图说明 0009 图1为白。
8、菜胚状体再生植株继代间隔时间对照表。 0010 图2为白菜胚状体再生植株继代间隔时间对照表。 具体实施方式 说 明 书 1/2 页 3 CN 107950392 A 3 0011 选取白菜小孢子不同基因型胚状体再生植株， 在四个成分含量不同的继代培养基 中培养， 培养基分别为： 0012 1号： 含有绵白糖2030g/L， 6-BA 0.150.25mg/L， NAA 0.350.45mg/L， 琼脂粉 810g/L， 卡那霉素(Kan)0.1mg/L， pH值为5.56.5的MS培养基； 0013 2号： 含有绵白糖3040g/L， 6-BA 0.250.35mg/L， NAA 0.350.。
9、45mg/L， 琼脂粉 810g/L， 卡那霉素(Kan)0.1mg/L， pH值为5.56.5的MS培养基； 0014 3号： 含有绵白糖2030g/L， 6-BA 0.150.25mg/L， NAA 0.250.35mg/L， 琼脂粉 6.57.5g/L， 卡那霉素(Kan)0.2mg/LpH值为5.56.5的MS培养基； 0015 4号： 含有绵白糖3040g/L， 6-BA 0.250.35mg/L， NAA 0.250.35mg/L， 琼脂粉 6.57.5g/L， 卡那霉素(Kan)0.1mg/L， pH值为5.56.5的MS培养基； 0016 培养基分装量为每100mL三角瓶装入7。
10、080mL， 将再生植株转入培养基后， 在20 2， 光照强度20003000lx， 光周期12h/12h的条件下培养7d10d后， 移入28冷藏箱 中放置， 待培养基含量下降至1020mL时取出(如出现培养基干裂严重要提前取出)。 统计 从再生植株转接入培养基至从冰箱中取出的时间， 结果见表1， 0017 选取白菜小孢子不同基因型胚状体再生植株， 选用继代培养基为含有绵白糖20 30g/L， 6-BA0.150.25mg/L， NAA0.350.45mg/L， 琼脂粉810g/L， 卡那霉素(Kan)0.1mg/ L， pH值为5.56.5的MS培养基， 分别在三个不同培养条件下进行培养， 。
11、条件分别为： 0018 A.温度202， 光照强度20003000lx， 光周期12h/12h， 培养7d10d移入28 冷藏箱中放置， 待培养基含量下降至1020mL时取出。 0019 B.温度253， 光照强度30004000lx， 光周期16h/8h， 培养7d10d移入28 冷藏箱中放置， 待培养基含量下降至1020mL时取出。 0020 C.温度253， 光照强度30004000lx， 光周期16h/8h， 培养7d10d后放置在室 温条件下， 待培养基含量下降至1020mL时停止培养。 0021 统计从再生植株转接入培养基至从冰箱中取出或室温条件下停止培养的时间， 参 考附图2可见培养条件A对继代间隔时间的延长效果最好， 间隔时间可达到7090d， 是培养 条件C继代间隔时间的23.5倍。 0022 利用本发明所述的技术方案， 或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下， 设计出类似的技术方案， 而达到上述技术效果的， 均是落入本发明的保护范围。 说 明 书 2/2 页 4 CN 107950392 A 4 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 5 CN 107950392 A 5 。