减小样品中分析物品种的浓度范围的方法
相关申请的交叉参考
[01]本申请是要求临时申请号60/559,108(2004年4月2日提交)、 临时申请号60/582,650(2004年6月23日提交)、临时申请号60/587,585 (2004年7月12日提交)、临时申请号60/643,483(2005年1月12 日提交)，和欧洲专利申请号04290775.8(2004年3月23日提交)的 权益的部分接续申请，上述所有申请在此全文引入以供参考。
技术领域
[02]本发明涉及组合化学、蛋白质化学和生物化学的领域。
背景技术
[03]蛋白质组学的目的在于完成生物体全套蛋白质组的同一性图 谱，并通过分析该信息从而鉴定可能的诊断性和治疗性实体。目前用 于分离蛋白质混合物的方法包括两维凝胶电泳和多维液相色谱法。所 有这些方法均可以与质谱法结合。该途径的一个实例是酵母中1,484种 蛋白质的分离和鉴定(Washburn et al.，Nat.Biotechnol.19(3)：242-2471 (2001))。分离和鉴定蛋白质的方法学另一实例是由Uetz等(Uetz et al.，Nature 403(6770)：623-627(2000))和Ito等(Ito et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 98(8)：4569-4574(2001))发展的酵母双杂交筛选 法的改良方法，该方法已在酿酒酵母中鉴定了超过4,000种蛋白质-蛋 白质相互作用。蛋白质分离和鉴定的定量方法是由Aebersold及其同事 (Smolka et al.，Anal.Biochem.297(1)：25-312(2001))发展的同 位素编码亲和标记(isotope coded affinity tag(ICAT))。ICAT包括 采用普通或重同位素性试剂对蛋白质进行位点特异性的、共价的标记 从而定量蛋白质表达的水平。
[04]复合蛋白质混合物还可以在组合产生的配体文库上分离。实 体分子与组合文库接触后，该实体分子可与文库中的配体结合。当采 用纯化的、放射性标记的初始实体时，可以实施对结合的实体的检测 (Mondorf et al.，J.Peptide Research 52：526-536(1998))。其它方 法包括通过针对实体的抗体进行的检测(Buettner et al.，International Journal of peptide & Protein Research 47：70-83(1996)；Furka et al.， International Journal Peptide Protein Research 37(6)：487-493(1991)； 和Lam et al.，(1991)如上)。采用固定在粘着物上的珠联合使用删减 筛选法可以检测多种实体的配体。这被称为QuASAR法(国际(PCT) 专利申请WO 01/40265)，其已被用于检测结合病毒和朊病毒蛋白质 的配体。
[05]FIoNA检测技术(Hammond等国际(PCT)专利申请WO 04/007757)和其他组合技术能够鉴定配体：实体相互作用。FIoNA检测 技术基于化学、物理、生物学，和/或生物化学功能从混合物中鉴定蛋 白质，而不仅仅是基于其与文库中配体的结合能力。因此，FioNA的 目的在于采用现有的蛋白质组学方法，鉴定结合所需物质的配体-载 体，然后在适宜的珠上解码配体，以及合成适宜量的珠以便纯化一种， 或若干具有所需活性的蛋白质。
[06]各分析物之间浓度的巨大差异会妨碍对复合生物提取物中分 析物的完全分析。在大多数生物混合物中，某些分析物的浓度很高， 而其它分析物则仅为痕量水平。结果，分析物的浓度可能并不适应给 定分析方法的动态范围。也就是说，由样品中最大丰度和最小丰度分 析物品种所产生的信号强度差异一般比分析方法检测和精确测定的能 力宽。例如，高度浓缩的蛋白质可能会饱和检测系统，而非常低的浓 度可能会低于分析方法的灵敏度，人血清即是如此，人血清中最大丰 度蛋白质(白蛋白-数十mg/ml)与最小丰度(例如，IL-6-小于1pg/ml) 之间的浓度差异可能会高达几亿倍。
[07]目前存在两种方式解决这一巨大差异：第一种是设计适应性 更好的装置而第二种是改变用于分析的样品。
[08]改变样品的一种方法是减少样品的较高丰度的品种，由此使 得较低丰度的品种更易于检测。例如，该方法包括使用接头部分(linker moieties)，诸如针对样品中特定品种的抗体和特异性染料。例如，对 于血浆而言，丰度高的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原 和α-1蛋白酶抑制剂。免疫亲和柱非常昂贵，很少完全特异性地针对 其靶物质，而且会除去与靶蛋白质相关的蛋白质。而且，最大丰度的 蛋白质一旦被除去，另一组即成为最大丰度，其随即需要建立另外的 亲和柱。此外，来自相同物种的不同组织和不同物种的组织的生物样 品可能具有的完全不同的最大丰度蛋白质组。该方法还受到如下事实 的影响，即除去某些分析物品种同样会除去与它们发生相互作用的品 种。因此，会除去某些可能的兴趣品种。虽然除去高丰度的蛋白质在 某些情况下会有帮助，但该方法并不能检测那些浓度始终低于检测设 备灵敏度的非常低丰度的蛋白质。而且，若干种蛋白质(在某些情况 下甚至是数十种)表现为高丰度品种，因此不得不对大量特异性方法 进行设计以便寻找每一种不同的高丰度品种。因此，该方法基本上不 能压缩剩余分析物品种之间的浓度范围。
[09]另一方法是对样品进行分级分离(通常通过色谱法)。该方 法根据相似的生物化学特性将分析物种类区分为不同的级分。例如， 离子交换色谱法能够根据电荷从而将蛋白质区分为级分，而分子排阻 色谱法根据分子大小来区分蛋白质。因此，这些方法可以减小分析物 的浓度范围，但其代价是在每次区分中实质上降低了分析物品种的群 体多样性。
发明概述
[10]本发明提供了一种压缩复合样品中不同分析物品种间的浓度 范围同时基本上保持样品中分析物品种的群体多样性的方法。更具体 地，相对于低丰度品种的浓度而言，所述方法基于物理-化学特性降低 了高丰度品种的浓度，但基本上不会消除样品分析物品种。
[11]如上述，各种分析技术均具有检测动态范围。当样品中分析 物的量高于动态范围时，其信号将饱和检测系统，故无法准确测定其 量。当样品中分析物的量低于检测系统的灵敏度范围时，该分析物也 无法得以检测，而且，即使低丰度分析物处于检测动态范围内，来自 高丰度分析物的信号也会干扰检测低丰度分析物的能力。本发明的方 法压缩了样品中分析物品种之间的浓度范围。这可以为检测器系统提 供数量增加的分析物分子以便高于检测的灵敏度阈值，而同时降低了 进行检测的高丰度分析物的量因此由高丰度分析物导致的检测系统的 饱和度显著降低，因此降低了对检测高于灵敏度阈值的低丰度品种的 能力的干扰。其结果是具有了检测样品中更多分析物品种的能力。采 用该方法，可以检测的品种数量至少是通过质谱法从血清中检测的品 种数量的1.5倍。通常，该数量介于可检测的品种数量的2-4倍。
[12]本发明的方法与检测样品的其它处理方法相反。例如，除去 经选择的高丰度品种并不能显著降低样品中大量品种的浓度范围。分 级分离降低了分析物的浓度范围，但其代价在于实质上降低了分级物 种群中的品种多样性。
[13]本发明通过将复合样品与经选择量的文库相接触而实现该结 果，所述文库中包含多种不同的结合部分。可对所有变量(文库组分 的多样性和所用文库的量)进行操作以便有益于本发明。通过操作样 品所接触的不同结合部分的多样性，有可能结合遍及所有浓度范围的 品种，亦即，无论是高丰度的品种还是稀少的品种。而且，使用的不 同结合部分的量越大，样品群体中能够俘获的品种量就越大。
[14]文库的量同样必须进行选择以便使得结合部分被至少样品中 的高丰度品种饱和。通过这种方式，样品中所俘获的高丰度品种和稀 少品种的相对量将非常接近于原始样品中它们的相对浓度。这导致浓 度范围的压缩，使得在检测期间由高丰度品种和稀少品种所产生的处 于经选择检测系统的动态范围之内的信号量增大。
[15]本发明的目的在于显著增加样品中可检测的品种的量，亦即 尤其是，发现样品中的新品种。优选特定种类的结合部分的文库来实 现该目的。尤其，最好通过使用大量不同结合部分的文库来实现该目 的，所述结合部分预先未对其结合样品中特定分析物的能力进行选 择。在本文中将所述文库称为“非选择性”文库。(在使用文库后会 明确地显示出所述文库中某些结合部分的结合特异性这一事实并不会 导致相同文库具有“选择性”)使用所述文库增加了无差别地俘获完 整种群的品种的可能性。例如，因此，抗体文库(其中各抗体针对已 知结合位点)仅能选择各抗体所针对的品种，相反地，相同规模的生 殖系抗体文库并不包含与预先选择的分析物相结合的抗体。所述文库 更有可能选择出样品中存在的未知品种。通过实施组合化学或通过随 机组装化学部分可以创建非选择性文库。此外，通过增加文库(选择 性或非选择性)的规模，可以增加样品中所俘获的和所检测的不同分 析物品种的数量。结合部分的非选择性文库的实例包括生殖系抗体文 库、重组结合蛋白质的噬菌体展示文库、染料文库或非组合性文库， 其中成员的结合特异性为非预先选择的、多种类型的组合文库及其部 分。
[16]还应当注意到，浓度压缩的量依赖于结合部分和样品中分析 物的相对量。一种极端情况是，结合部分相对分析物的相对量可能非 常大以至于结合部分能够俘获样品中所有分析物。在这种情况下，分 析物浓度范围不会出现压缩。其它极端情况是，结合部分相对分析物 的相对量可能非常小，以至于每一种分析物品种均能饱和结合部分的 结合能力。在这种情况下，理论上，所俘获的各个分析物品种的量是 相同的，分析物浓度范围被压缩至相等。该极端情况在目的是尽可能 多地检测品种时尤为有用。在这两种极端情况之间是如下情况，该情 况中高丰度品种饱和了结合部分，而低丰度品种不能饱和结合部分。 在这种情况下，高丰度分析物浓度范围之间的差异非常小，而低丰度 分析物的浓度差异则得以保留。该结果在用于比较两种不同样品种类 之间分析物品种的相对浓度时尤为有用。例如，在探索生物标记时， 对取自具有两种不同表型状态(例如癌对比非癌)的生物体的样品进 行比较以便鉴定两种状态之间存在不同的分析物品种。通过保留稀少 品种之间的浓度差异，本发明的方法能够用于发现这些稀少品种中的 生物标记。在一个实施方式中，结合部分与样品中分析物品种的比值 最大为1∶500，更优选地，最大为1∶50或最大为1∶5。
[17]本发明提供了一种缩小复合样品中不同分析物品种之间的浓 度范围同时基本上保持样品中分析物品种的群体多样性的方法。在本 发明优选的实施方式中，提供了一种方法，其包括以下步骤(a)提供 第一样品，该样品中包含多个不同的分析物品种，所述分析物品种以 第一浓度范围存在于所述第一样品中；(b)将所述第一样品与包含至 少100种不同的结合部分的一定量文库接触；(c)以不同的结合部分 从所述第一样品中俘获一定量的不同分析物品种以及除去未结合的分 析物品种；和(d)从所述结合部分上分离所述俘获的分析物品种从而 产生第二样品，该样品中包含多个不同的分析物品种，所述分析物品 种以第二浓度范围存在于所述第二样品中。其中所述文库的量经过选 择以便俘获一定量的不同的分析物品种从而所述第二浓度范围低于所 述第一浓度范围。
[18]所述第一样品包含至少100、至少1,000、至少10,000、至少 100,000、至少1,000,000或至少10,000,000种不同的分析物品种。在某 些实施方式中，所述文库包括至少1,000、至少10,000、至少100,000、 至少1,000,000或至少10,000,000种不同的结合部分。
[19]优选地，所述结合部分包括生物有机聚合物。优选地，所述 生物有机聚合物选自肽、寡核苷酸和寡糖。在本发明的其它实施方式 中，所述结合部分选自抗体和核酸适体(aptamer)。
[20]在本发明的优选实施方式中，所述结合部分与固体载体或多 个固体载体(a solid support or supports)结合。优选地，所述固体载体或 多个固体载体是珠或颗粒的集合。各个珠或颗粒可连结于基本上不同 的结合部分。而且，多个不同的结合部分可连结于相同的珠或颗粒。 优选地，所述珠或颗粒的直径小于1μm。可采用选自粉碎、磨碎和声 波破碎的方法将所述珠或颗粒制成磨碎的微粒化珠。在该方法的优选 实施方式中，所述颗粒与第二固体载体连结从而形成阵列或试纸条 (dipstick)。优选的微粒化珠是由天然或合成聚合物形成的聚合物基 质。
[21]在本发明其它优选实施方式中，所述固体载体或多个固体载 体选自纤维、整体柱(monolith)、膜和塑料条带。
[22]在本发明优选实施方式中，与第一样品接触的所述文库是非 选择性文库。可以采用多种非选择性文库实施本发明的方法。优选的 非选择性文库可选自生殖系抗体文库、重组结合蛋白质的噬菌体展示 文库、染料文库或非组合性文库，其中成员的结合特异性为非预先选 择的、组合文库及其部分。
[23]优选地，所述不同的结合部分包含在完全或不完全的组合文 库中。优选的组合文库是六肽文库。
[24]在本发明的一个实施方式中，所述第二样品所具有的分析物 品种多样性基本上与所述第一样品的相同。
[25]可以采用多种样品实施本发明的方法。在本发明优选的实施 方式中，所述样品选自羊水、血、脑脊液、关节内液、眼内液、淋巴 液、乳液、汗液、唾液精液、精浆、血清、痰液、滑液、泪液、脐带 液、尿液、活检组织匀浆液、细胞培养液、细胞提取物、细胞匀浆液、 条件培养液、发酵液、组织匀浆液及其衍生物。
[26]在一个实施方式中，本发明的方法包括检测所述第二个样品 中分析物品种的步骤。优选地，通过采用选自比色、光度、磁共振、 椭偏光、质谱、电泳、色谱、酶性和序列分析的方法对所述分析物进 行检测。
[27]任选地，本发明的方法进一步包括基于物理或化学特性分级 分离所述第二样品中所述分析物的步骤或鉴定至少一种所分离的分析 物的步骤。优选地，对所述分析物的分级分离包括采用选自色谱法、 电泳、毛细电泳、过滤和沉淀的方法分离所述分析物。
[28]在本发明的一个实施方式中，所述方法进一步包括将生物特 异性结合部分与所述第二样品接触以及测定所述生物特异性结合部分 是否从所述第二样品中俘获了分析物品种的步骤。
[29]未结合的分析物的除去可包括采用洗涤缓冲液洗涤所述俘获 的分析物。
[30]可采用不同的分析物实施本发明的方法。在本发明优选的实 施方式中，所述分析物选自多肽、核酸、复合糖、复合脂质、合成无 机化合物和合成有机化合物。
[31]本发明还提供了鉴定诊断性生物标记的方法。在优选的实施 方式中，所述方法包括以下步骤(a)提供来自具有第一表型的第一组 生物体的第一组生物样品；(b)提供来自具有第二表型的第二组生物 体的第二组生物样品；(c)对各个所述的生物样品实施如本文(权利 要求1)所述的减小样品中不同分析物品种的浓度范围的方法，由此分 别产生第三和第四组生物样品；(d)在所述第三和第四组生物样品的 各个样品中检测分析物品种；和(e)鉴定在所述第三和第四组样品中 存在不同的至少一种分析物品种，由此所述最少一种分析物品种为用 于区分所述第一表型和第二表型的生物标记。在优选的实施方式中， 该方法的步骤(e)包括鉴定生物标记图谱以便提供较所述图谱中任一 生物标记单独所具有的预测力更佳的预测力。
[32]本发明进一步提供了用于减小样品中分析物相对量的方法。 在本发明优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤(a)提供第一样 品，该样品包含第一的多种不同的分析物，所述分析物具有第一量方 差(a first variance in amounts)；(b)将所述第一样品与多种不同的 结合部分接触，各结合部分的存在量均为已确定的；(c)以所述不同 的结合部分从所述第一样品中俘获一部分所述第一的不同的分析物以 及除去未俘获的分析物；和(d)从所述结合部分上分离所述俘获的分 析物从而产生第二样品，该样品中包含第二的多种不同的分析物，所 述分析物具有第二量方差(a second variance in amounts)。多种不同 结合部分的各结合部分的所述已确定的量经过选择以便俘获一定量的 所述不同的分析物由此所述第二量方差小于所述第一量方差。
[33]本发明还提供了用于检测样品中多种分析物的试剂盒。在本 发明优选的实施方式中，试剂盒包括含有至少100种不同的结合部分 的文库的容器和使用所述文库实施本发明方法的说明书。优选地，所 述结合部分与固体载体或多个固体载体连结。所述文库可包括六肽组 合文库或其部分，其中所述六肽与颗粒连结。
[34]任选地，本发明的试剂盒包括用于以所述结合部分俘获分析 物的结合缓冲液或用于从所述结合部分上洗脱俘获的分析物的洗脱缓 冲液。本发明的其它试剂盒实施方式包括能够允许本领域技术人员实 施本文所述任何方法变型的任选的功能性组分。
[35]本发明还提供了包含结合部分的文库。在本发明优选的实施 方式中，文库包含至少100种不同的结合部分，其中多种不同的结合 部分与相同的固体载体或多个固体载体连结。优选地，所述结合部分 包括组合六肽文库或其部分。
附图简介
[36]图1显示了展示本发明的组合配体文库与血浆孵育结果的分 析。根据实施例2中所述方法将所述文库与血浆孵育。
[37]图2是在与文库孵育之前除去或不除去IgG的血浆的比较。 按照实施例3中所述实施该试验。
[38]图3显示了本发明的组合配体文库与血浆孵育的结果。按照 实施例4实施该试验。
[39]图4是Protein G柱留存物的PAGE分析。左栏是考马斯蓝 染色；右栏是用Silver Quest染色的相同凝胶。
[40]图5是对血液级分的图解说明(基于质量)，其中着重显示 了大量低丰度蛋白质的痕量特性。
[41]图6是用均一化珠处理之前和之后的样品的质谱比较。质量 范围是2.5kDa-10kDa。根据实施例1实施该试验。
[42]图7是用均一化珠处理之前和之后的样品比较。质量范围是 2kDa-30kDa。根据实施例1实施该试验。
[43]图8是用均一化珠处理之前和之后的样品比较。质量范围是 30kDa-180kDa。根据实施例1实施该试验。
[44]图9是对本发明均一化珠概念的一个实施方式的图解说明。
定义
[45]除非另有定义，此处所用的所有技术与科学术语具有本发明 所属领域的技术人员通常所理解的意义。下列参考文件为所属领域技 术人员提供了本发明中所使用的多个术语的一般定义：Singleton et al.，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)； The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.， 1988)；The Glossary of Genetics，5th Ed.，R.Rieger et al.(eds.)，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionay of Biology(1991)。如此处所使用的，除非另有定义否则下列术语具有 所描述的意义。
[46]“分析物”是指能够与本发明的结合部分相结合的任何分子 部分，其结合的方式是不会通过与本文所述洗涤液的接触而完全被断 裂的方式。“俘获的分析物”是在接触洗涤液后由本发明的结合部分 所结合的任何分析物。
[47]“吸附剂”是指能够结合分析物(例如靶多肽)的任何物质。 “色谱吸附剂”是指通常用于色谱法中的物质。例如，色谱吸附剂包 括离子交换物质、金属螯合剂、疏水作用吸附剂、亲水作用吸附剂、 染料和复合型吸附剂(例如，疏水吸引/静电排斥吸附剂)。“生物特 异性吸附剂”是指包含生物分子，例如核苷酸、核酸分子、氨基酸、 多肽、单糖、多糖、脂肪酸、脂质、类固醇或其结合物(例如糖蛋白、 脂蛋白、糖脂)的吸附剂。在特定情况下，生物特异性吸附剂可以是 大分子结构诸如多蛋白质复合体、生物膜或病毒。生物特异性吸附剂 的实例是结合了抗体、受体蛋白质、凝集素和核酸的固体载体。生物 特异性吸附剂针对靶分析物的特异性通常高于色谱吸附剂。SELDI中 使用的吸附剂的其它实例可见于美国专利6,225,047(Hutchens and Yip， ″Use of retentate chromatography to generate difference maps，″May 1， 2001)。
[48]结合部分可在适于形成分子相互作用的任何物理状态(包括 气体、水性和有机悬浮物和乳状物，最优选地是液态)中存在并与可 采用本发明进行检测的分析物发生相互作用。
[49]“固体载体”是指包括颗粒(例如珠)、纤维、整体柱、膜、 滤器、塑料条带等等的任何不溶性物质。
[50]“蛋白质生物芯片”是指适于俘获多肽的生物芯片。在现有 技术中记载了多种蛋白质芯片。其包括，例如，由赛弗吉生物系统公 司(Ciphergen Biosystems)(Fremont，CA)、Packard BioScience公司 (Meriden CT)、Zyomyx公司(Hayward，CA)以及Phylos公司(Lexington， MA)生产的蛋白质生物芯片。所述蛋白质芯片的实例可见于下列专利 或专利申请中：美国专利6,225,047(Hutchens and Yip，″Use of retentate chromatography to generate difference maps，″May 1，2001)；国际公开 WO 99/51773(Kuimelis and Wagner，″Addressable protein arrays，″ October 14，1999)；国际公开WO 00/04389(Wagner et al.，″Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof，″July 27，2000)以及 国际公开WO 00/56934(Englert et al.，″Continuous porous matrix arrays， ″September 28，2000)。
[51]“表面增强净解吸(Surface-Enhanced Neat Desorption)” 或“SEND”是SELDI的变型，其包括使用包含能量吸收分子层的探 针(“SEND探针”)，所述能量吸收分子结合在探针表面。例如，可 以通过共价或非共价化学键进行结合。与传统的MALDI不同的是， SEND中的分析物不需要在用于解吸/电离的能量吸收分子的晶体基质 中俘获。“能量吸收分子(Energy absorbing molecules)”(“EAM”) 是指能够吸收来自激光解吸/电离源的能量并随后将与其接触的分析物 分子解吸和电离的分子。该用语包括MALDI中使用的分子(通常称为 “基质”)，且明确地包括肉桂酸(cinnamic acid)衍生物、芥子酸 (sinapinic acid)(“SPA”)、氰基-羟基-肉桂酸(“CHCA”)和 二羟基苯甲酸、阿魏酸、羟基苯乙酮衍生物，以及其它。其还包括SELDI 中所使用的EAM。在特定实施方式中，能量吸收分子组成线形或交联 的聚合物，例如聚甲基丙烯酸酯。例如，构成可以是α-氰基-4-甲基丙 烯酰氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一实施方式中，构成是α- 氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三-甲氧基)硅基丙基甲 基丙烯酸酯的共聚物。在另一实施方式中，构成是包含α-氰基-4-甲基 丙烯酰氧基肉桂酸和甲基丙烯酸十八烷基酯(octadecyl methacrylate) (“C18 SEND”)的共聚物。SEND可进一步见于美国专利5,719,060 和WO 03/64594(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having Energy Absorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes″， August 7，2003)。
[52]SEAC/SEND是SELDI的变型，其中结合部分和能量吸收分 子均结合于样品呈递表面。因此，SEAC/SEND探针能够通过亲和性俘 获和解吸而无需提供外部基质即可俘获分析物。C18 SEND生物芯片是 SEAC/SEND的变型，其包括C18部分，该部分的功能在于作为结合部 分，而CHCA部分的功能在于作为能量吸收部分。
[53]由赛弗吉生物系统公司制造的蛋白质生物芯片包含具有色谱 性或生物特异性吸附剂的表面，所述色谱性或生物特异性吸附剂连结 于所述表面的可寻址位置。赛弗吉ProteinChip阵列包括：NP20、H4、 H50、SAX-2、Q10、WCX-2、CM-10、IMAC-30、LSAX-30、LWCX-30、 IMAC-40、PS-10以及PS-20。这些蛋白质芯片包含条带形铝基质。该 条带的表面上涂覆二氧化硅。
[54]对于NP-20生物芯片，氧化硅的功能在于作为亲水性吸附剂 俘获亲水性蛋白质。
[55]H4、H50、SAX-2、WCX-2、IMAC-3、PS-10以及PS-20生 物芯片进一步包含水凝胶形式的官能化、交联聚合物，该聚合物以物 理方式连结于生物芯片表面，或通过硅烷以共价方式连结于生物芯片 表面。H4生物芯片具有用于疏水性结合的异丙基官能基。H50生物芯 片具有用于疏水性结合的壬基苯氧基-多(乙二醇)甲基丙烯酸酯。SAX- 2生物芯片具有用于阴离子交换的四级铵官能基。WCX-2生物芯片具 有用于阳离子交换的羧酸盐官能基。IMAC-3生物芯片具有通过胺乙酸 (nitriloacetic acid)或IDA固定的用于配位共价结合的铜离子。PS-10生 物芯片具有酰基-咪唑(acyl-imidizole)官能团，其能与蛋白质上用于 共价结合的基团进行反应。PS-20生物芯片具有用于与蛋白质共价结合 的环氧官能团。PS系列生物芯片用于将生物特异性吸附剂，如抗体、 受体、凝集素、肝素、蛋白质A、生物素/抗生蛋白链菌素等，结合至 可发挥其特异性俘获样本中分析物功能的芯片表面。LSAX-30(阴离子 交换)、LWCX-30(阳离子交换)及IMAC-40(金属螯合物)生物芯片在其 表面具有功能性乳胶珠(latex bead)。所述生物芯片可进一步见于：WO 00/66265(Rich et al.(″Probes for a Gas Phase Ion Spectrometer，″ November 9，2000)；WO 00/67293(Beecher et al.，″Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase Mass Spectrometer，″November 9， 2000)；美国专利申请09/908,518(Pohl et al.，″Latex Based Adsorbent Chip，″July 16，2002)以及美国专利申请60/350,110 (Um et al.，″Hydrophobic Surface Chip，″November 8，2001)。
[56]“气相离子光谱仪”是指检测气相离子的装置。气相离子光 谱仪包括提供气相离子的离子源。例如，气相离子光谱仪包括质谱仪、 离子移动光谱仪及总离子流测定装置。“气相离子光谱法”是指使用气 相离子光谱仪检测气相离子。
[57]“质谱仪”是指检测可被转化成气相离子质荷比的参数的气相 离子光谱仪。质谱仪一般包括离子源和质量分析仪。质谱仪的实例是 飞行时间(time-of-flight)式、扇形磁场(magnetic sector)式、四极子滤过 (quadrapole filter)式、离子阱(ion trap)式、离子回旋共振(ion cyclotron resonance)式、静电扇形分析器，以及这些形式的组合。“质谱法”是 指使用质谱仪检测气相离子。
[58]本发明文中的“探针”或“质谱仪探针”是指可用于将来自 分析物的离子导入气相离子光谱仪(诸如质谱仪)的装置。“探针” 一般包括含有样品呈递表面的固体基质(挠性的或刚性的)，分析物 在所述样品呈递表面上被呈递至电离能量源。“SELDI探针”是指包 含结合于表面的吸附剂(又称“结合部分”)的探针。“吸附剂表面” 是指吸附剂所结合的表面。“化学选择性表面”是指吸附剂或者能够 例如通过反应形成共价或配合共价键的方式与结合部分相结合的反应 部分所结合的表面。
[59]“SELDI MS探针”是指包含结合于表面的吸附剂的探针。
[60]本发明文中的“方差”是指在试验样品中分析物浓度的数学 方差。方差减少是指具有统计学显著性(p＞0.05)的情况。用最简单的术 语表示，方差是通过至少一种检测方法所检测的试验样品中所有分析 物浓度的标准差的平方。优选的检测方法是质谱法，其中可检测分析 物的量是由检测器所鉴定的质峰下方的区域面积。
[61]“洗涤缓冲液”是指可用于洗涤并从吸附剂表面除去未结合物 质的溶液。洗涤缓冲液通常包括盐(可以将其或者也可以不将其pH缓 冲至特定的范围内)，去污剂并且任选地可包括可用于从表面或复合 物上除去偶发结合物质的其它成份。
[62]“洗脱缓冲液”是指能够将结合部分和所结合的分析物解离 的溶液。在某些情况下，当亚基在复合物中相结合时，洗脱缓冲液能 够断裂亚基间的相互作用。如同洗涤缓冲液，洗脱缓冲液可包括单独 使用或作为混合物使用的去污剂、盐、有机溶剂等。通常，后面这些 试剂在洗脱缓冲液中的浓度要高于在洗涤缓冲液中的浓度，以便使洗 脱缓冲液更易于断裂分子的相互作用。断裂分子的相互作用的这种能 力称为“严紧性”，而洗脱缓冲液的严紧性高于洗涤缓冲液的严紧性。
发明详述
[63]本发明提供了试剂盒和方法，该试剂盒和方法能使本领域技 术人员减小在复合混合物中发现的兴趣分析物的浓度范围。比较采用 分析物特异性试剂的现有技术方法而言，此处所述的方法尤为有益， 因为这些方法能够减小样品中分析物的浓度范围，所述样品含有未知 组分并且是复合物，该复合物中不仅存在大量不同的分析物(大于103种)，而且存在浓度的动态范围(数量级大于103)。结果，采用所主 张的发明能够同时分析“深蛋白质组(Deep Proteome)”，其包括来 自生物来源(包括血、血浆和血清)的多种液体中所存在的大量低丰 度蛋白质。(参见图5)。由此本发明具有用于分子复合混合物，诸如 生物样品的分析性制备的用途。
[64]分析物浓度范围或浓度方差的减小是通过使用结合部分文库 实现的，所述文库具有确定的规模和多样性，所述文库优选在惰性载 体上合成或被结合于惰性载体上。当导入包含分析物多样性的溶液中 时，所主张的发明的结合部分将结合溶液中的分析物。高丰度分析物 的存在量远远高于饱和其各自结合部分的能力所需要的量；因此，这 些高丰度分析物总量的高百分比将保持未结合。相反地，痕量分析物 的量较低意味着这些分子无法饱和所有适于它们的结合部分；因此， 与高丰度分析物相比，痕量分析物起始量的较高百分比将保持与其各 自的结合部分相结合。未结合的分析物可通过洗涤而被除去。当从结 合部分上洗脱结合的分析物时，相对起始物质而言，洗脱物质中高丰 度分析物的相对量降低。相反，相对起始物质而言，洗脱物质中痕量 分析物的量增加。分析物相对浓度的这种同时发生的改变会导致在单 一分析，或者比采用起始物质时数目更少的分析中检测洗脱物质中众 多(既便不是全部)存在于溶液中的分析物。以血清为例，白蛋白是 高丰度的，多种补体相关蛋白、激素结合蛋白具有中间浓度，而旁分 泌因子和细胞标记物可能具有微小的浓度。使用本发明，血清中所检 测到的分析物丰度范围可被降低，这能够使众多(既便不是大多数或 甚至全部)兴趣分析物得以分析。
[65]采用所主张的发明制备样品是简单易行的。在吸附了兴趣分 析物之后，任选地洗涤该分析物从而除去未结合的分析物。随后采用 例如通过施以洗脱缓冲液的方式从结合部分上洗脱吸附的分析物。所 得溶液包含全部兴趣分析物，而不包含结合部分；但是，与初始复合 混合物不同的是，由于相对于初始复合混合物而言高丰度分析物的浓 度降低而低丰度分析物的浓度增加，故所得溶液中存在的分析物浓度 范围相对较小。分析物的浓度范围或分析物之间的浓度范围所发生的 这种改变能够在无须重新校准检测装置的情况下使得所得溶液中分析 物的较大百分比得以检测，而对含有非常不同浓度组分的复合混合物 直接分析时则必需进行所述重新校准。
[66]在本发明某些实施方式中，可以将与结合部分结合的分析物 直接洗脱至适用于质谱仪的探针或蛋白质芯片上。为有助于分析，在 这些实施方式中使用的洗脱缓冲液可包括适用于质谱仪的基质物质。 可选地，可在分析物沉积于探针或芯片之后，将该基质物质导入分析 物。在这种情况的优选实施方式中，使用SEND或SEAC/SEND生物 芯片，该生物芯片上包含基质物质。这些优选实施方式缓解了对在洗 脱缓冲液包含基质物质或在沉积于生物芯片之上后的某些时间点将基 质物质导入分析物的需求。
[67]通过提供多种结合部分(每种结合部分识别复合混合物中存 在的单一或较小百分比的兴趣分析物)，本发明可以在最低限度地或 无须重新校准检测装置的情况下使复合混合物的组成得以检测。这包 括对那些除此以外将无法得到检测的品种(其由于被高丰度分析物掩 蔽，或者存在的浓度非常低以至于无法通过分析法得到检测)的检测。 这为高通量分析技术提供了非常大的益处，否则由于众多复合混合物 中存在大浓度范围分析物而不得不需要多次重新校准、和/或多个通 道、和/或多个检测步骤或昂贵且浪费的分级分离技术，故此高通量分 析技术将在检测步骤上受到上述需要的限制。此外，通过增加低丰度 分析物的相对浓度，本发明能够检测样品中仅以痕量存在的分析物。 以血清为例，未浓缩血清中仅存在痕量的特定分析物诸如某些激素。 其它分析物，诸如白蛋白是高丰度的，存在量为微摩尔至毫摩尔。相 对于高丰度分析物而言，本发明能够浓缩低丰度分析物。因此，采用 本发明制备示例性血清样品时，相对于白蛋白和其它高丰度分析物的 浓度而言，激素浓度增加。通过将血清中低和高丰度分析物的浓度相 靠近，就可仅采用检测分析物的分析装置的一项或若干项灵敏度设定 而定性且定量地检测分析物组成。
[68]通过相同的方法，本发明能够测定生物样品中存在的痕量蛋 白质，诸如纯化的治疗性蛋白质，其中对蛋白质杂质含量的容许量非 常有限。例如来自细胞培养物上清的纯化抗体可包含痕量的不同蛋白 质，该蛋白质来自用于表达抗体的细胞。后者这些蛋白质是不应该存 在的，通常可用特异性ELISA检测法进行检测。但是，当杂质的浓度 非常低时，免疫化学试验是无效的。如果首先根据本发明对要分析的 样品进行处理，痕量蛋白质杂质则可被显著地浓缩，由此可通过常规 化学或免疫化学方法进行检测。
1.减小样品中的相对分析物浓度
A. 适宜的试验样品
[69]本发明的试验样品可以是能使该试验样品中的分析物与本发 明的结合部分相接触(如本文所述)的任何形式。适宜的试验样品包 括气体、粉末、液体、悬液、乳液、可透过的或粉末化的固体，等等。 优选地，试验溶液是液体。试验样品可直接取自来源并用于本发明的 方法中，而无须任何预先操作。例如，水样品可直接取自含水层并采 用本文所述方法直接进行处理。
[70]可选地，初始样品可用多种方法进行制备以便增强其对检测 的适应性。所述样品制备包括除去特定分析物、浓缩、磨碎、提取、 渗滤等。例如，固体样品可被粉末化成为粉末，然后采用水或有机溶 剂进行提取。然后对来自粉末的提取物实施本发明的方法。在对液体 实施本发明的方法之前，可将气体样品通过溶液进行发泡或渗滤以便 将该气体的组分在液体中溶解和/或浓缩。
[71]试验样品优选包含至少四种兴趣分析物，更优选地至少8、 15、20、50、100,1000、100,000、1,000,000、10,000,000或更多种兴趣 分析物。在某些情况下，适于采用本发明的方法进行操作的试验样品 可包含数百种或数千种兴趣分析物。优选地，试验样品中的分析物浓 度至少跨越数量级，更优选地，至少两个、三个、四个或更多个数量 级。本发明的方法一经实施，可通过至少一种检测法进行检测的分析 物的该浓度范围将减小至少两倍、更优选地，10、20、50、100、1000 或更多倍。
[72]可以采用任何适宜的方法收集试验样品。例如，可以采用浸 渍、挖取、舀取、吸取或捕集来收集环境样品。可以采用抽取、刮取、 手术切除或用皮下针等来收集生物样品。各种情况中的收集方法高度 依赖于样品来源和状态，而多种可选的适宜收集技术是本领域技术人 员众所周知的。
1.生物试验样品
[73]试验样品可以取自潜在地包含兴趣分析物任何来源，包括环 境样品，诸如空气、水、土、提取物等。本发明优选的试验样品是生 物样品，优选是生物液体。可采用本发明的方法操作的生物样品包括 羊水、血、脑脊液、关节内液、眼内液、淋巴液、乳液、汗液、唾液 精液、精浆、血清、痰液、滑液、泪液、脐带液、尿液、活检组织匀 浆液、细胞培养液、细胞提取物、细胞匀浆液、条件培养液、发酵液、 组织匀浆液及其衍生物。生物样品中的兴趣分析物包括蛋白质、脂质、 核酸和多糖。更具体地，兴趣分析物是动物中通常存在的，或是与疾 病或感染状态诸如癌症、病毒感染、寄生虫感染、细菌感染等相关的 细胞代谢产物。特别地，兴趣分析物是针对细胞应激的标记物。显示 动物处于应激中的分析物是多种疾病状态(包括特定心理疾病、心肌 梗死和感染)的早期指示物。
[74]兴趣分析物还包括那些对动物异源的，但在动物组织中发现 的物质。特别地，在此意义下的兴趣分析物包括治疗性药物(包括抗 生素)，其中的很多种以可由感染性生物体产生的，或来源于环境隐 匿于动物内的不同对映体和毒素存在。例如，实例可以是蛋白(egg white)或E.Coli提取物。
2.环境试验样品
[75]环境样品是用于本发明的另一类优选试验样品。优选的环境 样品包括土、尘、皮屑、天然和合成纤维、水、植物材料、动物粪便 等。环境样品中优选的分析物包括天然和合成毒素、肥料、除草剂和 杀虫剂，以及用于细菌和病毒剂的标记，诸如所述兴趣剂的结构蛋白 特征。特别地，在环境试验样品中寻找的优选分析物是毒素，特别是 诸如肉毒素、蓖麻毒素、炭疽毒素等的毒素。环境试验样品中存在的 疾病相关的兴趣分析物包括完整病毒体以及肉毒杆菌、埃博拉病毒 (ebola)、HIV、SARS、炭疽、鼠疫、疟疾、天花、牛海绵样脑病相 关的蛋白酶传染因子、绵羊搔痒症、变异体CJD等的特征性蛋白质和 核酸。
[76]示例性环境样品可获自多种来源，包括自然环境，诸如天然 存在的水体。天然存在的水体例如可以是洋、湖泊、海、河流、沼泽、 水塘、三角洲或湾。可选地，环境提取物可以是来自水处理中心的提 取物。
[77]可选地，环境样品可取自人造环境，诸如建筑物。该建筑物 可以是任何人造建筑物。优选地，所述建筑物已受到一种或多种生物 病原体诸如天花、炭疽，或一种或多种毒剂，诸如沙林、梭曼、神经 毒剂、爆炸性化学剂、杀虫剂、VX和糜烂性毒剂的污染。获取该环境 样品的方法包括采用本领域技术人员已知的适宜溶剂从建筑物表面上 干燥抹取，或从建筑物表面上潮湿抹取。
B. 适宜的结合部分
[78]本发明适宜的结合部分包括小有机分子，诸如染料和三嗪， 以及生物聚合物诸如肽、蛋白质、多核苷酸、寡糖或脂质。本发明的 结合部分可以是分子量为100KDa或更高的分子，诸如抗体，但优选 是分子量在10KDa范围内的较小的分子，更优选是1KDa左右，期望 是小于1KDa，例如小于750、500或250Da。理想上，本发明的结合部 分与不溶性颗粒化物质结合。各个不溶性颗粒优选携带有若干拷贝的 相同结合部分，而各个颗粒类型结合不同的结合部分。
[79]本发明的结合部分可以是在溶液、悬液，或在能使所述结合 部分与分析物(包括置于固体载体上的)相接触的任何其它状态中。
[80]结合部分可以是“噬菌体展示文库”(其中肽作为噬菌体外 膜的部分而呈递)的一部分。(例如参见，Tang，Xiao-Bo，et al.；J. Biochem；1997；pp.686-690；vol.122，No.4)。在噬菌体颗粒的表面上 呈递肽能够实现小肽的组合文库快通量筛选，该方法还有益于筛选组 合抗体文库。噬菌体展示文库由噬菌体制成，所述噬菌体已经通过重 组操作从而将结合部分作为噬菌体蛋白外膜的部分进行表达。采用噬 菌体展示，可以方便地构建结合部分的文库。
[81]结合部分还可以是可溶性组合分子。可溶性组合分子优选包 括俘获部分，该部分能使所述结合部分与互补固体载体相连结。可溶 性结合部分实施方式通常是在通过将该结合部分结合至或连结至固体 载体从而分离所得复合物之前与样品接触并与兴趣分析物结合。组合 文库可以由构建块组成，所述构建块包含手性原子诸如19种天然存在 的氨基酸。
[82]本发明的结合部分可以采用本领域技术人员已知的任何技术 进行制备。例如，结合部分可以通过化学合成、从天然来源中收集(在 此情况下结合部分是生物有机聚合物)、采用重组技术制备。对于该 后者情况，具有不多于15、10、8、6或4个氨基酸的肽尤为有益，因 为它们易于采用重组或固相化学技术进行制备。此外，化学合成文库 可见于，例如Fodor et al.，Science 251：767-773(1991)和Houghten et al.，Nature 354：84-86(1991)。在裂解-连结-重组固相组合合成(Lam et al.，Nature 354，82-84(1991))中，结合部分的补体的多样性是不同 氨基酸的数目与结合部分的长度(在单个结合部分中氨基酸的数目) 相乘的结果。
[83]核酸是另一种优选的生物有机聚合物结合部分。与肽相同， 可以采用本领域技术人员众所周知的合成或重组技术制备核酸。本发 明优选的核酸结合部分的长度为至少4个，更优选6、8、10、15或20 个核苷酸。核酸结合部分包括能够与特异性分子靶(诸如蛋白质或代 谢物)结合的单链或双链DNA或RNA分子(例如，核酸适体)。
[84]本发明还包括寡糖结合部分。寡糖结合部分的长度优选是至 少5个单糖单位，更优选是8、10、15、20、25或更多个单糖单位。
[85]生物聚合物结合部分可以是脂质。如此处所使用的，术语“脂 质”是指疏水性或两亲性部分。由此，结合部分的脂质文库同样可用 于本发明的方法和试剂盒中。适宜的脂质包括C14至C50脂肪族、芳 基、芳烷基、芳稀基或芳炔基部分，其可包括至少一种杂原子，该杂 原子选自氮、硫、氧和磷。其它适宜的脂质包括磷酸甘油酯、糖基甘 油脂、鞘脂、固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丙醇胺。结合部分的脂质 文库的长度优选是至少5个单位，更优选至少8、10、15、20、25、50 或更多个单位。
[86]本发明也可以使用小有机分子作为结合部分。通常，所述分 子具有能使其与分析物发生离子性、疏水性或亲和相互作用的特性。 小有机结合部分包括通常用于色谱方法中的化学基团，诸如单-、二- 和三-甲基氨基乙烷基基团，单-、二-和三-乙烷基氨基乙烷基基团，磺 酰基，磷酰基，苯基，羧甲基基团等。例如，文库使用苯二氮卓(例 如参见，Bunin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712(1994)) 和类肽(例如Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-9371 (1992))。在其它实施方式中，结合部分使染料或三嗪衍生物。该 列表并非是穷举的，因为本领域技术人员可以很容易地识别数以千计 的化学官能团，这些基团具有离子性、疏水性或亲和特性，适宜用作 本发明的结合部分。以下将更详细地描述组合结合部分文库的制备和 使用。
[87]结合部分可以是购买的预先连结于载体的、在载体上合成 的，或者可以是采用标准方法直接连结于或直接固定在载体上的(例 如参见，Harlow and Lane，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor，NY(1988)；Biancala et al.，Letters in Peptide Science 7(291)：297(2000)；MacBeath et al.，Science 289：1760- 1763(2000)；Cass et al.，ed.，Proceedings of the Thirteenth American Peptide Symposium；Leiden，Escom，975-979(1994)；美国专利5,576,220； Cook et al.，Tetrahedron Letters 35：6777-6780(1994)；和Fodor et al.， Science 251(4995)：767-773(1991))。
组合文库
[88]在本发明的一个实施方式中，结合部分的文库是组合文库或 其部分。组合化学文库是通过将多个化学“构建块”组合成所有可能 的组合方式，以化学合成或生物合成方式形成的化合物的集合。例如， 完全线形组合化学文库，诸如多肽文库，是通过将一组化学构建块(氨 基酸)以每一种可能的方式组合成给定的化合物长度(即，多肽化合 物中氨基酸的数目)从而形成的。举例来说，如果构建块的数目是5 且构建体由五个成员组成，则可能的线形组合的数目是55或3,125个 成员。在该情况下，构建块(A、B、C、D和E)是线形组合的，诸如： A-A-A-A-A；A-A-A-A-B；A-A-A-A-C；A-A-A-B-A；A-A-A-B-B；A- A-A-B-C；.....；A-A-B-A-A；A-A-B-A-B；A-A-B-A-C；.....；E-E-E-E-C； E-E-E-E-D；E-E-E-E-E。
[89]组合文库的另一种形式是以支架为基础的。该构建体的基础 是单个中心分子或核心，其中包含可被构建块取代的位置。三氯-三嗪 (三个可取代位点)即为一种实例，其上可结合若干取代基。如果取 代基的数目是三，则可能的组合数目即为10。还可以考虑各取代基的 相对定位，在这种情况下组合的数目会更大。
[90]作为第三水平，可以将线性组合文库与以支架为基础的文库 进行组合，其中后者文库的取代基是组合的线性序列。
[91]可以通过化学构建块所述组合性混合从而合成数百万种化学 化合物。对于肽结合部分而言，所述长度优选限于15、10、8、6或4 个氨基酸。本发明核酸结合部分的优选长度是至少4个，更优选6、8、 10、15，或至少20个核苷酸。寡糖长度优选为至少5个单糖单位，更 优选8、10、15、20、25或更多个单糖单位。
[92]组合文库可以是完全的或不完全的。生物聚合物的完全组合 文库是这样一些文库，该文库中包含具有给定聚合物长度和组合的每 一种可能的单体排列方式的代表方式。不完全文库是这样一些文库， 该文库中缺少具有给定聚合物长度的一种或多种可能的单体排列方 式。
[93]肽结合部分是所主张的本发明的优选实施方式。生成适用于 所主张的本发明的肽结合部分的方法是本领域技术人员众所周知的， 例如“裂解、结合和重组”方法(例如参见，Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，37：487-493(1991)；Houghton et al.，Nature 354：84-88 (1991)；Lam et al.，Nature，354：82-84(1991)；国际专利申请WO 92/00091；和美国专利5,010,175、5,133,866和5,498,538)和本领域中 已知的其它方法。肽文库的表达还可见于Devlin et al.，Science，249： 404-406(1990)。
[94]本领域众所周知的组合和合成化学技术可以生成包含数百万 种成员的文库(Lam et al.，Nature 354：82-84(1991)和国际专利申请 (PCT)WO 92/00091)，各文库具有独有的结构。例如，由18种天 然氨基酸制备的线性六聚物配体文库包含34×106种不同的结构。当还 包括氨基酸类似物和异构体时，可能的结构数目事实上是无限的。此 外，所述文库的每一成员均有可能具有结合不同分子的能力。组合文 库的成员可在固体载体上合成或与固体载体连结，所述固体载体诸如 珠，其中各珠的表面上基本上含有文库成员的数百万个拷贝。由于可 将不同的珠与不同的文库成员结合以及用于结合文库成员的珠的总数 目非常大，故能够与珠所结合的文库成员相结合的不同分子的可能数 目非常巨大。
[95]Hammond等，US 2003/0212253(2003年11月13日)公开了 组合文库，如下所述。肽结合部分文库可以由氨基酸合成，所述氨基 酸能够提供相对于天然氨基酸而言增加的稳定性。例如，半胱氨酸、 蛋氨酸和色氨酸可从文库中省略而包括非天然氨基酸诸如2-萘丙氨酸 和正亮氨酸。N-端氨基酸可以是D-异构体或可以被乙酰化以在存在氨 基肽酶时提供更好的生物化学稳定性。结合部分的密度必须足以提供 对靶分子充分的结合力，但又不能太高以防止结合部分与其自身相互 反应而不与靶分子相互反应。结合部分的所需密度是0.1μmole-500 μmole/g载体干重，更优选地，结合部分的所需密度是10μmole-100 μmole/g载体。六聚肽文库在Toyopearl-AF Amino 650M树脂(Tosohaas， Montgomeryville，Pa)上合成。树脂珠的大小为60-130mm/珠。通过 与Fmoc-Ala-OH和Boc-Ala-OH的混合物(1∶3.8摩尔比)相结合从而 完成起始树脂的初始置换。结合后，完全净TFA除去Boc保护基团。 然后对所得去保护的氨基进行乙酰化。然后通过树脂珠上残留的 Fmoc-Ala-OH位点组装肽链。采用标准Fmoc合成策略。在典型试验 的一种实施方式中，采用20％哌啶/DMF将六克Fmoc-Ala-(Ac- Ala-)Toyopearl Resin去保护(2×20分钟)，然后用DMF洗涤(8次)， 然后等分为18个独立反应管。在各独立管中，单个Fmoc-氨基酸与树 脂(BOP/NMM，过量5-10倍)结合4-7小时。然后洗涤各树脂并采 用“裂解/混合”文库技术(Furka et al.，Int.J.Peptide Protein Res.， 37，487-493(1991)；Lam et al.，Nature，354，82-84(1991)；国际专利 申请WO 92/00091(1992)；美国专利号5,010,175；美国专利号 5,133,866；和美国专利号5,498,538)进行组合。重复去保护和结合的循 环直至完成氨基酸序列(六聚物文库需六个循环)。在最后的结合循 环中，在独立的反应管中采用20％哌啶/DMF从肽中除去最终Fmoc。 采用TFA处理(TFA∶H.sub.20∶Phenol，90∶5∶5)2小时以除去侧链保 护基团。充分洗涤树脂然后真空干燥。所得的肽密度通常为0.06-0.12 mmol/g树脂。所述氨基酸可以是L或D-立体异构体或外消旋混合物。
[96]测序并证实肽配体-树脂珠复合物的肽组成，通过 Commonwealth Biotechnologies，Inc.，Richmond，Va进行定量氨基酸分 析从而计算树脂的置换度。通过采用Hewlett PackardG1005A的Edman 降解于Protein Technologies Laboratories，Texas A&M University进行 测序。
[97]用于制备组合文库的装置是商业上可获得的(例如参见，357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony， Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，多种组合文库本身即可从商业 上获得(例如参见，ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis， MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Colnmbia， MD，等)。
[98]在某些肽文库实施方式中，肽在重组噬菌体的表面上表达从 而产生大规模、易于筛选的文库。采用“噬菌体”方法(Scott and Smith， Science 249：386-390，1990；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，87： 6378-6382，1990；Devlin et al.，Science，49：404-406，1990)，可以构建非 常大规模的文库(106-108种化学实体)。第二种方法主要使用化学方 法，其实例是Geysen法(Geysen al.，Molecular Immunology 23： 709-715，1986；Geysen et al.J.Immunologic Method 102：259- 274，1987；和Fodor等的方法(Science 251：767-773，1991)。Furka等 (14th International Congress of Biochemistry，Volume#5，Abstract FR： 013，1988；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.37：487-493，1991)， Houghton(美国专利号4,631,211,1986年12月公布)和Rutter等(美 国专利号5,010,175，1991年4月23日公布)公开了用于制备作为激 动剂或拮抗剂而得以检测的肽混合物的方法。
[99]还可以使用其它用于生成化学多样性文库的化学物质。所述 化学物质包括，但不限于：肽(例如，PCT申请号WO 91/19735)， 编码的肽(例如，PCT申请号WO 93/20242)，随机生物寡聚物(例 如，PCT申请号WO 92/00091)，苯二氮卓类(例如，美国专利号 5,288,514)，diversomer诸如乙内酰脲、苯二氮卓类和二肽(Hobbs et al.，Proc.Nczt.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))，插烯酰多肽 (vinylopgous polypeptide)(Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.114： 6568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽性肽模拟物(Hirschmann et al.， J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，小化合物文库的类似 有机合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡碳 胺酯(oligocarbamates)(Cho et aL.，Science 261：1303(1993))，和 /或肽基磷酸酯(Campbell et al.，J.Org.Chem.59：658(1994))，核 酸文库(参见Ausubel，Berger and Sambrook，均如上述)，肽核酸文 库(例如参见，美国专利5,539,083)，抗体文库(例如参见，Vaughn et al.，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和 PCT/US96/10287)，糖文库(例如参见，Liang et al.，Science，274： 1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子文库(例如参 见，苯二氮卓类，Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；类异戊二 烯，美国专利5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和间噻嗪烷酮 (metathiazanones)，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735 和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯二氮卓类， 5,288,514，等等)。
接头部分
[100]本发明的结合部分任选地包括接头部分，该部分使结合部分 靶向地和/或可逆地连结至固体载体。示例性接头部分包括表位和his- 标签，其可以与所要俘获的生物分子连结从而形成融合蛋白。在这些 情况下，可剪切的接头序列，诸如特异性针对Factor XA或肠激酶的 那些序列(Invitrogen，San Diego，Calif.)可任选地被包含在生物分子 和俘获部分之间以便于融合分子组分的分离和/或分开。特异性识别设 计配体的蛋白域也可被用作接头部分(例如参见，Deisenhofer，J.， Biochemistry 20(1981)2361-2370)。本领域中已知多种其它等效的 接头部分。例如参见，Hochuli，Chemisclze Irzdustrie，12：69-70(1989)； Hochuli，Genetic Engineering，Principle and Methods，12：87-98(1990)， Plenum Press，N.Y.；and Crowe，et al.(1992)OIAexpress：THe High Level Expression & Protein Purgfication System，QIAGEN，Inc. Chatsworth，Calif.；上述文件引入此处作为参考。需要吸附的生物分子 的抗原决定簇以及其它特征也可用作俘获部分标签。示例性接头部分 包括聚-组氨酸(聚-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(聚-his-gly)标签；flu HA 标签多肽及其抗体12CA5[Field et al.，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165 (1988)]；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体 (Evan et al.，Molecular and CeLlular Biology，5：3610-3616(1985))； 和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag-肽 (Hopp et a1.，BioTechnology，6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin et al.，Science，255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner et al.，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991))；和T7基因10种蛋白 质肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87： 6393-6397(1990))。
C.采用结合部分从试验样品中俘获分析物
[101]通过在能使各结合部分与其对应分析物相结合的条件下将 试验样品与结合部分接触可以俘获试验样品中存在的分析物。如上所 述，结合部分可以与试验样品直接接触，或者结合部分可以首先与固 体载体，诸如试纸条、SELDI探针和不溶性聚合珠、膜或粉末相连结。
[102]在结合部分是珠文库的一部分的情况中，珠体积与复合样品 诸如血清的样品体积的比率可以是介于例如，1∶150和1∶1之间。珠与 样品的比率越小，增加低丰度或稀少分析物品种的相对浓度的能力即 越强。在恒定珠∶样品体积为1∶10时，血清所使用的珠体积可以是至少 介于0.0005ml和15mL的珠之间(包括0.020ml)。
[103]在一个实施方式中，在与试验样品接触之前，将结合部分与 固体载体结合。在该可选的实施方式中，将固体载体仅与试验样品接 触一段时间，该时间足以使结合部分与分析物结合，然后将固体载体 撤离试验样品，而分析物通过在分析物和结合部分之间形成复合体而 被结合在固体载体上。
[104]在一个实施方式中，结合部分包含接头部分。在该实施方式 中，以能使试验样品中存在的分析物与结合部分结合的方式将结合部 分与试验样品直接接触。经过足够的时间之后，包含针对结合部分的 俘获部分的互补俘获部分的固体载体与试验样品接触。这使得结合部 分通过俘获部分与固体载体结合，而保留了结合的分析物。
[105]将结合部分与试验样品接触可通过如下步骤实施，将二者混 合，将试验样品拭抹在结合部分上，使试验样品流经其上结合了结合 部分的固体载体，以及对本领域技术人员而言显而易见的其它方法。 将结合部分与分析物持续接触一段时间，所述时间足以使得结合部分 达到与样品的结合平衡。在一般实验室条件下，该时间至少是10分钟。
固体载体
[106]用于本发明的可接受的载体的种类非常广泛。载体可以是可 透过性的或不可透过性的。其可以是连续性的或非连续性的，挠性的 或非挠性的。载体可以由多种材料制成，所述材料包括陶瓷、玻璃、 金属、有机高分子材料，或其组合。
[107]优选的载体包括有机聚合物载体，诸如颗粒化或珠化载体、 编织网和非编织网(诸如纤维网)、微孔纤维、微孔膜、空心纤维或 空心管。还可以使用聚丙烯酰胺和矿物质载体诸如硅酸盐和碳酸盐(例 如，羟基磷灰石)。编织网和非编织网可以具有规则或不规则的表面 物理构型。尤为优选的实施方式包括球形的载体或不规则形状的珠或 颗粒。
[108]可以使用多孔材料，因为其能够提供大的表面积。多孔载体 可以是合成的或天然的、有机的或无机的。具有多孔结构的适宜固体 的孔径是至少大约1.0纳米(nm)而其孔体积是至少大约0.1立方厘米 /克(cm3/g)。优选地，孔径是至少大约30nm，因为较大的孔对扩散 的限制较小。优选地，孔体积是至少大约0.5cm3/g，因为孔周围较大的 表面积会产生较大可能容量。优选的多孔载体包括颗粒载体或珠载 体，诸如琼脂糖、亲水性聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、矿物质氧化物和 Sepharose，包括球形和不规则形状的珠和颗粒。
[109]为获得显著的优点，结合部分的载体优选是亲水性的。优选 地，亲水聚合物是可水膨胀的以便使分析物得以更好的渗透。所述载 体的实例包括天然多糖诸如纤维素、变性纤维素、琼脂糖、交联的葡 聚糖、氨基变性的交联葡聚糖、瓜尔胶、变性瓜尔胶、黄胞胶、豆角 胶和水凝胶。其它实例包括交联的合成亲水聚合物诸如聚丙烯酰胺、 聚丙烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)和修饰的聚乙二醇。
[110]可以通过多种机制实施结合部分与固体载体的连结。可以通 过将预先制备的结合部分与固体载体连结从而用完全制备的结合部分 衍生固体载体。可选地，可以通过将前体分子与固体载体连结以及随 后在生长链(其通过第一前体分子与固体载体连结)中加入另外的前 体分子，从而在固体载体上形成结合部分。当结合部分是聚合物，尤 其是生物聚合物诸如多肽、多核苷酸或多糖分子时，这种将吸附剂构 建在固体载体上的机制尤为有用。可以采用本领域已知的方法，通过 连续地将单体组分(例如，氨基酸、核苷酸或单糖)添加至与固体载 体相连的第一单体组分，从而得到生物聚合物吸附剂。例如参见，美 国专利号5,445,934(Fodor et al.)。
[111]例如，在特定实施方式中，组合文库，各固体载体，例如各 个珠，可仅具有一种结合部分与其连结(受组合化学的限制)。
[112]但是，在另一实施方式中，各固体载体可结合多种不同的结 合部分。例如，可以采用裂解-和-合并的方法制备肽组合文库。可以将 这些肽从其结合的珠上剪切下来，混合，然后与新的珠组结合，而不 通过珠对肽进行任何分选。以这种方法，各个珠可结合多种不同的结 合部分。由此，本发明提供了结合部分的组合文库，其中组合文库的 多种不同成员与相同的固体载体相结合。少至一种而多至10、100、 1000、10,000、1,000,000、1,000,000,000或更多种不同的结合部分可与 单个固体载体相结合。在特定的实施方式中，固体载体的形式是珠， 而单个的、不同类型的结合部分与各个珠相结合。例如，在肽结合部 分文库中，代表一种可能的氨基酸排列的肽与一个珠结合，而代表另 一种可能的氨基酸排列的肽与另一个珠结合，等等。
[113]可采用可逆性或不可逆性相互作用将结合分子与固体载体 连结。例如，可以采用下述载体来实现不可逆的相互作用，所述载体 包括与结合部分化学连结的(任选地通过间隔基团)至少一个反应官 能团，诸如羟基、羧基、巯基或氨基。适宜的官能团包括N-羟基琥珀 酰亚胺酯、磺酰酯、碘代乙酰基、醛、环氧、咪唑基氨基甲酸酯和溴 化氰以及其它卤素活性载体。可以通过多种已知技术将所述官能团装 备至载体。例如，可通过已知的方式采用氨基丙基三乙烯乙醚衍生玻 璃表面。在某些实施方式中，结合部分在合成期间与固体载体结合， 如本领域技术人员所已知的(例如，固相肽和核酸合成)。
[114]可选地，可以采用与固体载体和/或结合部分相连结的接头 部分，来实现固体载体与结合部分之间的可逆性相互作用。适用于本 发明的多种接头部分均是已知的，其中某些在上面已经描述过。对本 领域技术人员而言，接头部分用于连结不同的试剂的用途是众所周知 的，本领域技术人员能够使用该公知技术仅通过常规试验即可制备适 用于本发明的固体载体/结合部分结合物。
微粒化固体载体
[115]本发明优选的实施方式采用小型、珠化、微粒化固体载体， 其直径小于1000μm，优选小于100、10、1或0.1μm。所述载体通常 通过机械碾磨或其它将较大珠减小为粉末一致性的方式制得。微粒化 固体载体是合乎需要的，因为相对于较大的珠而言，微粒化固体载体 的表面积和体积的比率增大。微粒化固体载体还减小了包含本发明的 组合文库时所需要的载体体积，由此可以使用更为复杂和有效的文 库。然而采用现有的设备，由于受到所用滤器系统的原料大小的限制， 故难以在非常小(＜10μm)的珠上合成组合文库。为了克服这一问题， 可以在珠上大批量合成组合文库，然后通过机械碾磨、粉碎或声粉碎 将其碎裂化，从而形成粉末或微粒的集合。
[116]使用这些技术，可以制备与不同结合部分相连结的微粒化固 体载体。这又可以广泛地进行混合从而形成相对于混合更大或多种大 小的不同珠而言，更为均一的组成。
[117]微粒化固体载体可与活性表面共价连结，通过环氧基团、N- 羟基琥珀酰亚胺、二甲基3，3′-二硫代丙亚氨酸酯 (dithiopropionimidate)或戊二醛以形成与组合文库的配体形成化学键 或与聚合物(配体在其上合成)的基础基质形成化学键，从而制成“试 纸条“或芯片。这可以通过与肽文库的N-端氨基交联而得以实现。
[118]在表面上的非反应的交联基团可与小化学物质诸如巯基乙 醇进行反应从而防止进一步的反应性。此外，还可对表面作进一步处 理从而防止蛋白质的非特异性结合。
[119]与微粒化固体载体所连结的结合部分相结合的靶分子可采 用一种或多种方法进行洗涤，所述方法例如采用具有不同盐浓度和pH 的缓冲液而结合的蛋白质被洗脱至具有低pH、低或高离子强度的溶 液、强离液剂、乙腈/甲酸等中。
[120]可以采用多种方法根据分子量针对洗脱的靶分子分析蛋白 质组成，所述方法例如包括，但不限于质谱法、SDS-PAGE、毛细管电 泳，或通过等电聚焦进行pI。
[121]可选地，可以通过电泳洗脱靶分子。在该实施方式中，可用 适宜的溶液诸如Laemmli缓冲液浸泡包含结合的靶分子的微粒化固体 载体，并用SDS-PAGE分析确定蛋白质。可选的缓冲液可以包含脲， 而蛋白质可通过在等电聚焦凝胶中的电泳进行分离。
[122]可选地，微粒化固体载体可与填充剂混合并被压制成片剂形 式。以这种形式，可以将其直接加入样品溶液或可替换地首先将其在 缓冲液中悬浮。
[123]可将微粒化固体载体置于溶液诸如琼脂糖或丙烯酰胺中，并 通过纤维上的交联剂的聚合反应而与凝胶自身交联或彼此交联从而形 成整体柱物质。
[124]可选地微粒化固体载体可固定在粘合剂薄膜上。
[125]另一方法是将微粒化固体载体包埋在多孔基质中。所述基质 可包括能够使颗粒在融解充气阶段整合至其中的非编织纤维或网。
[126]可根据需要将微颗粒整合至单张膜或层叠膜之中以便获得 适宜的所需结合能力；其中微粒化固体载体通过压延或水缠绕 (hydroentanglement)而被包埋在层之间。
[127]膜组成可以选自天然或合成来源，包括聚酯聚丙烯纤维网。 当然，本领域技术人员能够理解本节所描述的多种技术通常可用于本 发明的其它实施方式。
1.除去未结合的分析物
[128]本发明的一个特征是根据本文所述方法的分析物的处理优 选除减小分析物浓度之间的差异之外浓缩并部分纯化了结合的分析 物。该特征的完全实现包括任选地将未结合的分析物与固体载体上的 结合部分所结合的分析物洗涤分离。
[129]优选通过将结合部分所结合的分析物与温和洗涤溶液相接触 来实施洗去未结合的分析物。温和洗涤溶液意在除去通常见于初始包 含分析物的试验样品中的污染物和未结合分析物。通常，洗涤溶液具 有生理pH和离子强度而且在环境温度和压力条件下实施洗涤。
[130]本领域技术人员无须过度试验即可实施适用于本发明的洗 涤溶液的制备。除去污染物的方法，包括低严紧性洗涤方法，已有报 道，例如见于Scopes，ProteinPurification：Principles and Practice(1982)； Ausubel，et al.(1987和定期增刊)；Current Protocols in Molecular Biology；Deutscher(1990)″Guide to ProteinPurification″in Methods in Enzymology vol.182，以及该系列中的其它卷。
D. 从结合部分分离俘获的分析物
[131]可以采用多种方法，优选采用能够破坏结合部分和分析物之 间相互作用的水洗脱缓冲液从结合部分洗脱结合的分析物并进行分 离。任何适宜的洗脱缓冲液均可用于此目的，包括变性剂诸如离液剂 和有机溶剂。示例性洗脱缓冲液包括具有非常低或高离子强度的盐水 溶液、去污剂溶液和有机溶剂。竞争性结合本发明的结合部分的试剂 的溶液和悬液也可用于洗脱缓冲液，只要所述竞争性结合试剂不妨碍 随后兴趣分析物的收集或分析。所选择的洗脱缓冲液具有高度的应用 特异性，而且本领域技术人员通过公众领域中一般可获得的材料或通 过常规试验即可很容易地对其进行鉴别(例如参见，Protein Purification：Principlesand Practice(1982)；和Deutscher(1990)″Guide to Protein Purification″in Methods in Enzymology vol.182，以及该系列 中的其它卷)。
[132]典型的顺序包括用氯化钠洗涤(以便通过优势离子交换作用 收集蛋白质)，然后使用乙二醇(主要通过疏水缔合针对蛋白质相互 作用的洗脱液)，然后将pH降低至2.5(变性缓冲液)而最后使用盐 酸胍。
[133]适宜的洗脱缓冲液的实例包括修饰分析物和/或结合部分的 表面电荷的那些缓冲液，诸如pH缓冲溶液。用于通过修饰酸度而破坏 表面电荷的PH缓冲溶液优选是强缓冲液，足以将溶液的pH保持在酸 性范围，即，pH小于7，优选小于6.8、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0或3.0； 或保持在碱性范围内pH大于7，优选大于7.5、8.0、8.3、8.5、9.0、 9.3、10.0或11.0。在特定实施方式中，洗脱缓冲液可包含9M脲pH 为3、9M脲pH为11或6.66％MeCN/13.33％IPA/79.2％H20/0.8％ TFA的混合物。一种方法对比另一种方法的选择要依赖于用于均衡样 品的分析方法。
[134]可选地，可以使用高盐浓度溶液，该溶液具有充分的离子强 度以便遮蔽分析物和/或结合部分的电荷特性。此时，尤为优选的是具 有多价离子的盐，例如碱土金属或过渡金属平衡离子的硫酸盐和磷酸 盐，虽然解离为一个或多个单价的盐也适用于本发明，假若所得溶液 的离子强度为至少0.1，优选0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.75、1.0mol 1-1或更高。举例来说，多种蛋白质分析物/结合部分相互作用对其环境 的离子强度改变敏感。因此，可通过结合的分析物与盐溶液(优选无 机盐溶液诸如氯化钠)接触而将分析物与结合部分分离。这可以采用 多种方法来完成，所述方法包括在洗脱缓冲液中水浴、浸透或浸渍固 体载体，该载体上结合了分析物，或通过用洗脱缓冲液对固体载体冲 洗、喷雾或洗涤。所述处理能够从与固体载体结合的结合部分上释放 分析物。然后可以从洗脱缓冲液中回收所述分析物。
[135]离液剂，诸如胍和脲，破坏围绕结合部分和所结合分析物的 水封结构，这导致分析物和结合部分之间的复合解离。适于用作本发 明的洗脱缓冲液的离液盐溶液是应用特异性的且本领域技术人员可通 过常规实验进行制备。例如，适宜的离液洗脱缓冲液可包含浓度范围 为0.1-9M的脲或胍。
[136]基于去污剂的洗脱缓冲液从表面张力以及分子复合结构的 方面修饰亲和性分子的选择性。适宜用作洗脱缓冲液的去污剂包括离 子型和非离子型去污剂。非离子型去污剂通过修饰溶液的介电常数而 破坏分子间的疏水性相互作用，而离子型去污剂通常以传递均一电荷 的方式遮蔽感受性分子，这导致被遮蔽的分子排斥相似地被遮蔽的分 子。例如，离子型去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)以传递均一负电荷的 方式遮蔽蛋白质。非离子型去污剂的实例包括Triton X-100、TWEEN、 NP-40和辛基-糖苷。两性离子去污剂的实例包括CHAPS。
[137]另一类通过修饰溶液的介电常数而破坏疏水性相互作用的 去污剂类化合物包括乙二醇、丙二醇和有机溶剂诸如乙醇、丙醇、乙 腈和甘油。
[138]本发明优选的洗脱缓冲液包括适用于质谱仪的基质物质。基 质物质可包括洗脱缓冲液中。本发明的某些实施方式可任选地包括将 分析物从结合部分上直接洗脱至质谱仪探针，诸如蛋白质或生物芯 片。在本发明其它实施方式中，所述基质可与从结合部分上洗脱之后 的分析物混合。而其它实施方式包括将分析物直接洗脱至SEND或 SEAC/SEND蛋白质芯片，该芯片包括预先置于蛋白质芯片上的能量吸 收基质。在后者这些实施方式中，洗脱缓冲液中即无须存在其它基质 物质。
[139]适用于本发明的其它洗脱缓冲液包括上述缓冲液组分的组 合。由两种或多种上述洗脱缓冲液组分所制成的洗脱缓冲液能够基于 多种洗脱特性而修饰复合物亚单位之间分子相互作用的选择性。
[140]采用本发明分离的分析物所具有的分析物浓度范围或分析 物之间的浓度方差低于试验样品中初始存在的分析物浓度范围或浓度 方差。例如，相对于针对试验样品实施本文所述的任何方法之前试验 样品中所存在的相同分析物之间的浓度方差而言，在采用本发明的方 法进行操作后，分离的分析物所具有的分析物浓度范围或与其它分离 的分析物的浓度方差降低至少两倍，更优选地降低10、20、25、50、 100、1000或更多倍。优选地，本发明的方法以最小限量的洗脱缓冲液 进行实施，以确保洗脱缓冲液中分离的分析物的浓度最大化。更优选 地，洗脱缓冲液中至少一种分离的分析物的浓度大于先前在试验样品 中的浓度。
[141]在分离俘获的分析物之后，可对该分析物进一步进行基于某 些化学或物理特性诸如分子量、等电点或对化学或生物化学配体的亲 和力的浓缩或分级分离处理。用于核酸、蛋白质和多糖的分级分离方 法是本领域众所周知的，例如可见于Scopes，Protein Purification： Principles and Practice(1982)；Sambrook et al.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Press，N.Y.，(Sambrook)(1989)；以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc. and John Wiley & Sons，Inc.，(1994 Supplement)(Ausubel)。
E. 检测分离的分析物
[142]在已将分析物洗脱并分离以使其不含结合部分之后，可以采 用本领域技术人员可获得的任何技术对分析物进行检测、定量或其它 特征分析。将本发明的分析技术施用于复合试验样品的特征是相对于 在初始试验样品中所检测的大范围的分析物浓度而言，所分离的分析 物的浓度范围发生动态性方差减小。分析物浓度范围的这种减小能 使，比较使用初始试验样品自身的分析物检测可用的百分比而言，初 始试验样品中所检测的分析物大得多的百分比得以检测和特征分析， 而不需要重新校准设备。实现分析物浓度范围的实际减小需要依赖多 种因素，所述因素包括包括初始试验样品的性质和所用结合部分的性 质和多样性。一般地，采用本文所述技术对分析物浓度方差的减小足 以使至少25％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或 80％分离的分析物得以检测，而不需要重新校准设备。理想上，本发 明能使至少90％、95％、98％或更多分离的分析物得以检测，而不需 要重新校准设备。
[143]可以采用本领域技术人员已知的任何适宜方法实施对采用 本文所述技术分离的分析物的检测。例如，使用染料的比色测定的适 用范围非常广泛。可选地，可通过光谱法实施检测。光谱检测仪依靠 的是反射率、紫外线和/或可见光吸收，或用适宜波长激发后的荧光中 的变化来检测反应组分。示例性检测方法包括荧光分析法，吸光度、 反射率和透光度光谱法。双折射、反射率或衍射中的变化还可用于监 测复合物形成或反应进程。检测分子相互作用尤为有用的技术包括表 面等离子共振、椭率检测法、共振镜技术、光栅偶联波导技术和多极 共振光谱法。这些技术以及其它技术是本领域技术人员众所周知的， 而且在无须过度试验的情况下，本领域技术人员可以很容易地将其应 用于本发明。例如，这些技术以及其它技术的多种方式可见于 ″Spectrochemical Analysis″Ingle，J.D.和Crouch，S.R.，Prentice Hall Publ.(1988)以及″Analytical Chemistry″Vol.72，No.17。
[144]优选的检测方法是质谱分析法。质谱分析技术包括(但不限 于)离子化(I)技术诸如基质辅助激光解吸(MALDI)，连续或脉冲 电喷雾(ESI)和相关方法(例如，IONSPRAY或THERMOSPRAY)， 或大集束撞击(massive cluster impact(MCI))；这些离子源可与检 测形式相匹配，所述检测形式包括线形或非非线形反射飞行时间 (TOF)、单个或多个四极子、单个或多个扇形磁场、傅立叶变换离 子回旋共振(FTICR)、离子阱，及其组合(例如，离子阱/飞行时间)。 可以实施多种基质/波长组合(MALDI)或溶剂组合(ESI)以便用于 离子化。例如，采用ESI(Valaskovic，G.A.et al.，(1996)Science 273： 1199-1202)或MALDI(Li，L.et al.，(1996)J.Am.Chem.Soc.118： 1662-1663)质谱法检测分析物的Subattomole水平。ES质谱法已经由 Fenn等(J.Phys.Chem.88，4451-59(1984)；PCT申请号WO 90/14148) 提出而且在当前综述文章(R.D.Smith et al.，Anal.Chem.62，882-89 (1990)以及B.Ardrey，Electrospray Mass Spectrometry，Spectroscopy Europe，4，10-18(1992))中已经总结了目前的用途。Hillenkamp等已 经提出了MALDI-TOF质谱法(″Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization：A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules，″Biological Mass Spectrometry(Burlingame and McCloskey，editors)，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，pp.49- 60，1990)。采用ESI，由于存在可用于质量计算的多个离子峰，故可 以在飞克分子量的样品中非常精确地测定分子量。本发明优选的分析 法使用表面增强净解吸激光解吸/离子化(SELDI)，例如参照美国专利号 6,020,208中所述。质谱法是本发明的实施方式中尤其优选的检测方 法，其中分析物的洗脱物直接置于质谱仪的探针或生物芯片上，或其 中洗脱缓冲液包含基质物质或在从结合部分上洗脱分析物之后与基质 物质结合。
[145]另一种广泛使用的检测方法是基于兴趣分析物的一种或多 种物理特性的电泳分离。分析多肽和蛋白质分析物的特别优选的实施 方式是二-维电泳。优选的应用是通过在第一维中的等电点，以及通过 第二维中的大小来分离分析物。用于分析物电泳分析的方法随所研究 的分析物而广泛地变化，但用于鉴定适用于给定分析物的特定电泳方 法的技术是本领域技术人员众所周知的。
II.鉴定生物标记
[146]本发明的其它实施方式是采用上述珠化的结合部分来鉴定 用于诊断疾病、感染或污染的生物标记。生物标记可以在上述任何样 品中鉴定，但优选是从取自活体(最优选是人)的诸如血、尿、脑脊 液等的样品中鉴定。可以采用多种方法来鉴定生物标记。
[147]“生物标记”事实上可以是在生物样品中存在的且可被分离 的或可在生物样品中检测的任何生物化合物，诸如蛋白质及其片段、 肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂质、核酸、有机或无 机化合物、天然结合物和小分子。此外，生物标记可以是整个的完整 分子，或者其可以是完整分子的一部分，该部分可具有部分功能或例 如可被抗体或其它特异性结合蛋白质所识别。生物标记可以是表位特 异性抗体。如果生物标记的可检测方面与给定表型(诸如生命体中的 特定疾病状态，或水体中的污染水平)相关，则生物标记即被视为有 益的。例如，所述可检测方面可以包括来自个体的生物样品中生物标 记的存在、缺失或浓度，和/或其作为生物标记图谱一部分的呈现。生 物标记的所述可检测方面在本文中称为“特征”。例如，特征还可以 是生物标记的两个或多个可检测方面的比率，所述生物标记可以具有 或可以不具有已知的识别性。“生物标记图谱”包括至少两种所述特 征，其中所述特征可与生物标记(诸如核酸和糖)的相同或不同分类 相对应。生物标记图谱还可包括至少3、4、5、10、20、30或更多种 特征。在一个实施方式中，生物标记图谱包括数百种，或甚至数千种 特征。在其它实施方式中，生物标记图谱包括至少一种内标的至少一 种可检测的方面。
[148]“表型”是生物体的可观测的物理和生物化学特性，其由遗 传构成和环境影响二者所决定。可选地，在本发明的文中，表型还可 以与自然的无生命方面相关联，例如水体的表型包括水体可(物理地 或化学地)检测的那些方面。例如，湖泊的表型包括水温、酸度、矿 物质含量、氧含量，无论其是否能够维持生命以及何种生命形式。
[149]“表型改变”是一种可以检测的与给定表型相关的参数的改 变。例如，表型改变可包括体液中生物标记的增加或减少，，其中所 述变化与疾病状态相关。表型改变可进一步包括患者的给定状态的可 检测方面的改变，所述患者在生物标记的可检测方面无改变。例如， 表型的改变可包括体温、呼吸率、脉搏、血压或其它生理学参数的可 检测改变。所述改变可借助临床观察和检测采用本领域技术人员众所 周知的常规技术进行测定。如本文所使用的，“常规技术”是指可根 据表型改变对个体进行分类但不会获得根据本发明的生物标记图谱的 那些技术。
[150]采用所主张的发明来鉴定物种或组织中的诊断性生物标记 需要至少两种生物样品的可用性。所提供的生物样品可以是如下形 式：对照组和试验组、对照组和试验个体，在不同的时间取自相同的 个体或对本领域技术人员来说显而易见的任何其它排列形式。
[151]按照本文所述用珠化的结合部分文库处理所得到的各个样 品。以这种方式，能够检测更多的推定生物标记，如下面实施例部分 所述。其发生的原因是因为所述结合部分缩窄了样品中存在的分析物 浓度范围的方差，由此使低丰度和高丰度分析物均能得以检测。
[152]在用本发明的结合部分文库处理之后，对于各个生物样品， 分别针对与所述结合部分相结合的分析物进行洗脱和合并。然后分析 合并的样品以确定样品中的任何共同分析物是否表现出差异表达(一 种样品中的表达增强比对其它样品)，或者在一种样品中表达而在其 它样品中无表达。表现出所述差异表达的分析物即可被视为针对在各 生物样品源之间观察到的表型改变或差异的推定生物标记。然后可以 实施进一步的统计学和分析检测以便以所需确定度将该生物标记与表 型改变相关联。
[153]用于鉴定生物标记的优选分析性分析法是与上述用于一般 鉴定分析物的那些方法相同的方法，所述分析物与本发明的结合部分 相结合。
III.试剂盒
[154]本发明还包括试剂盒，其含有能够使本领域技术人员实施本 文所述技术的组分。为此目的，试剂盒最基本的要素是提供多种结合 部分，每一种结合部分具有经选择的量以便俘获预先确定量的不同分 析物。在本发明的某些试剂盒实施方式中，提供了与固体载体，优选 不溶性珠结合的结合部分。在其它实施方式中，分别提供固体载体和 结合部分。当分别提供时，结合部分和/或固体载体包括俘获部分，该 部分能够使本发明的操作者在实施本文所述发明期间将结合部分结合 于固体载体。分别提供结合部分和固体载体的试剂盒可任选地提供实 施结合部分与固体载体的结合反应所需的其它试剂。
[155]本发明的试剂盒还包括多种容器，该容器中含有用于样品制 备和分析物分离的组分。具有该特性的示例性组分包括一种或多种洗 涤溶液，该溶液足以从特异性结合分析物的结合部分上除去未结合物 质，和至少一种洗脱溶液，该溶液足以释放与结合部分特异性结合的 分析物。
[156]试剂盒实施方式可任选地包含在本发明的方法中使用结合 部分的文库的说明书。
[157]虽然为了清楚和便于理解而通过例证和实施例的方式对上 述发明给出了某些详细的描述，但对本领域技术人员来说，在本发明 的教导下，在不背离本发明的精神和范围的情况下，作出等同物的特 定变型、改变、修饰和替换是显而易见的。故此，本文所描述的实施 方式涉及的是多种修饰、改变等等，而本发明的范围单独地参照所附 权利要求而确定。本领域技术人员能够很容易地识别多种能够变化、 改变或修饰而产生基本上相似的结果的非关键参数。
[158]虽然本文所描述的本发明的各个元素包含多个实施方式，但 是应当理解的是(除非另有描述)，所给出的本发明的元素的各个实 施方式能够与本发明的其它元素的各个实施方式一同使用，所述各个 使用方式的目的在于构成本发明独特的实施方式。
[159]根据上述内容可以理解，本发明的应用非常广泛的。通过以 下实施例进一步描述本发明，所述实施例仅为描述性的，并不意在以 任何方式对本发明的定义和范围进行限制。
实施例
实施例1：人血清蛋白浓度范围的减小
[160]本实施例举例说明了上述本发明的一种实施方式如何施用 于复合生物样品(在此例中是人血清)。在本实施例中，通过选择性 地将血清蛋白吸附至与不溶性珠结合的六肽来实现血清蛋白浓度方差 的减小。在本例的结合部分群体(其形式为分拆、重组和合并的珠组 合文库)中，可以呈递超过1×106种可能的六肽排列方式。以这种形式， 高丰度血清分析物(诸如白蛋白)与六肽结合部分相结合，但其仅能 达到与特定结合部分的饱和度相等的水平。相反，由于识别低丰度分 析物的结合部分的量是非限制性的，故低丰度血清分析物几乎全部被 结合。该选择性结合的结果导致由所用结合部分所识别的蛋白质的分 析物浓度范围减小，而不会出现在意在选择性地除去高丰度分析物的 方法中，丢失固有的低丰度分析物的风险。因此，使用所述方法分离 的血清分析物的大部分可以在一种批量分析中进行检测，而无需重新 校对检测装置。这与下述情况相反，即当必须反复重新校准检测装置 以便检测未处理的血清中相同分析物，从而在血清试验样品中检测相 同分析物时所出现的情况。在本实施例中，以4℃，14,000rpm离心 30mL血清15分钟，然后从上层小心地除去全部脂质物质。将所余血 清通过0.8μm滤器过滤，然后通过0.45μm滤器过滤。保留500μl 该过滤的血清作为非均一化对照样品。将大约1mL六肽文库(在20％ 甲醇中溶胀过夜，然后以含有140mM氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液 pH7过夜，然后洗涤3次以除去细小颗粒物质)等分加入三个重力流 动柱的各个柱中。六肽文库的各个等份与7.6mL等份的过滤血清于室 温下温和搅动孵育2小时。孵育后，排干柱，收集的体积代表流通液 (flow-through)。保留1mL的流通液用于分析。然后立即用20mL 柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠，140mM氯化钠，pH＝7)洗柱。另 外收集第一个1mL的洗出液用于分析。洗涤后，从三个柱重复份的每 个中除去若干个200uL等份的树脂，然后按下述进行处理。针对来自 各个重复份的第一个200μL等份的树脂，用200uL 2×LDS缓冲液 +DTT还原剂(通过混合500uL 4×LDS，200uL 10×DTT，和300uL dH20制备)于90℃加热该样品10分钟。该样品冷却后，将其以2,000 rpm离心1分钟。收集上清液，然后保存于-20℃以备1D-凝胶分析。 针对来自各个重复份的第二个200μL等份的树脂，用400uL 6M尿素 以批量形式孵育该样品1小时，伴以温和搅动。然后2,000rpm离心该 样品1分钟以形成片状六聚物配体珠文库，然后收集上清液用SELDI- 质谱仪进行分析。针对来自各个重复份的第三个200μL等份的树脂， 用400uL 6M GuHCl以批量形式孵育样品1小时，伴以温和搅动。然 后2,000rpm离心该样品1分钟以形成片状六聚物配体珠文库，然后收 集上清液用SELDI-质谱仪进行分析。
[161]随后在IMAC-Cu ProteinChip Arrays上对为了SELDI-质谱 仪分析而保留的全部样品进行处理。首先使用50uL 100mM CuSO4孵 育5分钟以便用Cu使表面带电来制备IMAC阵列。在室温下持续摇动 从而完成孵育。孵育阶段过后，用蒸馏水冲洗阵列以便除去过剩的 CuSO4。然后用pH4.0 100mM醋酸钠于室温下持续摇动中和带电的 IMAC-Cu阵列5分钟。孵育期过后，除去醋酸钠并用蒸馏水冲洗 IMAC-Cu阵列。然后对IMAC-Cu阵列预处理两次，采用150ul结合 缓冲液(0.1M NaPO4，0.5M NaCl，pH7)于室温下持续摇动5分钟。预 处理后，除去这种缓冲液然后加入新的90ul等份的结合缓冲液，随后 加入10ul的来自均一化试验的样品(总孵育体积为100ul)。然后在 IMAC-Cu阵列上持续摇动孵育样品30分钟。孵育后，除去过剩的样 品体积，然后用150uL结合缓冲液洗涤阵列三次；每次洗涤5分钟并 持续摇动。最终洗涤之后，用150uL蒸馏水冲洗IMAC-Cu阵列两次， 然后干燥。作为最终步骤，将1uL 50％饱和SPA(在50％乙腈，0.5％ 三氟乙酸中)加至各点，干燥，然后用额外的1ul 50％SPA重复添加 基质。该阵列随后即可用于SELDI-质谱仪的分析。
[162]图6-8中描述了均一化前后过滤血清的SELDI-质谱的对 比。样品的质谱分析显示出，由于高丰度分子的减少还降低了能够隐 匿初始样品中的峰的离子抑制作用，故此峰高度平缓增加而且可见峰 的数目增加。预期这种方法将增加复合溶液(诸如血清)中可检测分 析物的数量，该增加的数量超过使用原始复合溶液(未施以本发明方 法)的可检测分析物数量至少0.5，更为可能的是1、2、3或更大的数 量级。
[163]已经发现，具有700,000种不同成员的六肽文库对血清所产 生的结果与具有6400万种成员或300万种成员的文库所产生的结果相 似。
表1：蛋白的峰检测，所述蛋白(S/N比＞3)来自未经均一化珠处 理的血清。所检测的全部峰＝191
M/z 质量 TOF 强度 MZ面积 TOF面积 S/N
2015.66 2014.65 17.177 6.4172 127.90 0.5429 49.02
2036.48 2035.47 17.265 5.3084 143.63 0.6038 40.64
2088.13 2087.12 17.482 2.2443 48.87 0.2033 17.28
2158.14 2157.14 17.771 1.1293 8.45 0.0346 8.76
2236.71 2235.71 18.090 1.4596 19.01 0.0765 11.41
2274.25 2273.24 18.240 2.6476 59.30 0.2367 20.78
2297.37 2296.36 18.332 1.7593 25.74 0.1021 13.84
2348.05 2347.05 18.532 1.1940 16.12 0.0632 9.44
2387.06 2386.06 18.685 1.0549 10.47 0.0408 8.38
2433.77 2432.76 18.865 1.1221 9.13 0.0352 8.95
2510.49 2509.48 19.159 1.1701 13.0S 0.0497 9.41
2548.37 2547.36 19.302 1.4879 17.14 0.0645 12.01
2588.13 2557.13 19.451 1.1253 24.23 0.0903 9.12
2645.66 2644.65 19.665 0.8016 6.61 0.0244 6.53
2672.54 2671.53 19.764 0.7100 7.81 0.0287 5.80
2701.93 2700.92 19.872 0.6059 1.89 0.0069 4.96
2714.04 2713.03 19.916 0.7967 5.25 0.0192 6.53
2744.23 2743.22 20.026 1.5753 15.67 0.0569 12.96
2765.83 2764.82 20.105 1.9933 35.32 0.1277 16.43
2798.60 2797.60 20.223 1.8114 17.06 0.0614 14.98
2822.57 2821.56 20.309 2.2505 28.31 0.1013 18.66
2841.99 2840.98 20.378 1.0515 13.66 0.0487 8.73
2874.68 2873.68 20.494 1.3501 16.29 0.0578 11.25
2882.13 2881.12 20.521 1.0852 7.18 0.0254 9.05
2986.19 2985.19 20.886 1.6218 16.72 0.0582 13.66
3008.50 3007.50 20.964 0.7147 2.51 0.0087 6.03
3035.73 3034.72 21.058 0.6588 4.37 0.0151 5.58
3051.05 3050.04 21.111 0.3948 1.66 0.0057 3.35
3069.95 3068.95 21.176 0.4739 1.33 0.0046 4.02
3092.47 3091.47 21.253 1.1918 16.40 0.0561 10.14
3114.57 3113.56 21.328 0.4997 1.64 0.0056 4.26
3151.05 3150.05 21.452 0.6513 5.28 0.0179 5.57
3164.53 3163.52 21.498 0.9793 11.19 0.0378 8.39
3232.23 3231.22 21.725 1.5813 18.92 0.0633 13.63
3243.48 3242.47 21.763 0.7721 6.38 0.0213 6.66
3298.21 3297.21 21.945 3.4654 36.61 0.1212 30.07
3313.89 3312.88 21.997 5.1135 76.84 0.2537 44.43
3333.83 3332.82 22.063 2.5432 37.75 0.1242 22.14
3384.92 3383.91 22.230 2.1432 65.06 0.2129 18.75
3407.63 3406.63 22.304 1.0824 12.54 0.0408 9.49
3429.51 3428.51 22.375 0.6049 3.05 0.0099 5.31
3452.91 3451.90 22.451 0.8204 7.29 0.0236 7.22
3476.39 3475.38 22.527 0.5334 4.42 0.0142 4.71
3503.26 3502.25 22.614 0.5524 2.93 0.0094 4.89
3511.64 3510.63 22.641 0.4732 2.83 0.0091 4.19
3528.97 3527.96 22.696 0.4620 5.10 0.0163 4.10
3546.06 3545.06 22.751 0.5973 6.70 0.0214 5.30
3568.26 3567.25 22.821 1.0034 9.59 0.0305 8.93
3590.14 3589.14 22.891 1.0356 32.09 0.1018 9.23
3623.82 3622.81 22.998 0.4337 3.89 0.0123 3.88
3637.24 3636.23 23.040 0.4513 6.62 0.0208 4.04
3694.92 3693.91 23.221 0.5609 5.95 0.0186 5.05
3729.43 3728.42 23.329 0.4638 2.79 0.0087 4.19
3764.53 3763.52 23.438 0.4174 1.51 0.0047 3.78
3805.09 3804.09 23.563 0.8459 10.90 0.0336 7.69
3823.32 3B22.31 23.619 1.7052 28.82 0.0886 15.54
3848.08 3847.07 23.695 1.0869 14.13 0.0433 9.93
3855.69 3854.69 23.719 0.8424 8.51 0.0260 7.70
3898.88 3897.87 23.850 2.3732 28.05 0.0854 21.77
3921.25 3920.25 23.919 1.1576 12.73 0.0387 10.64
3942.17 3941.16 23.982 0.5628 6.01 0.0182 5.18
3966.53 3965.52 24.056 0.5595 7.51 0.0227 5.16
3980.76 3979.76 24.099 0.4952 3.90 0.0118 4.58
4027.93 4026.93 24.240 0.3813 2.66 0.0080 3.54
4058.52 4057.52 24.332 0.5159 5.65 0.0169 4.80
4076.90 4075.89 24.386 1.2618 21.95 0.0653 11.77
4161.26 4160.25 24.636 9.0816 189.47 0.5588 85.34
4187.94 4186.94 24.715 3.9580 98.13 0.2882 37.28
4211.39 4210.38 24.784 1.9753 20.07 0.0588 18.65
4225.32 4224.31 24.824 1.7662 17.90 0.0524 16.69
4237.59 4236.58 24.860 1.0754 10.50 0.0307 10.18
4259.14 4258.13 24.923 1.1283 15.93 0.0464 10.70
4277.21 4276.20 24.976 0.9969 9.99 0.0290 9.47
4306.31 4305.31 25.060 1.4922 28.79 0.0835 14.21
4317.27 4316.27 25.092 1.4477 27.75 0.0803 13.80
4387.42 4386.41 25.294 0.5169 3.99 0.0114 4.96
4421.28 4420.27 25.391 0.6385 10.89 0.0311 6.14
4476.55 4475.55 25.549 1.6525 25.13 0.0714 15.98
4498.63 4497.62 25.611 0.8303 12.41 0.0352 8.04
4524.12 4523.11 25.683 0.5423 5.72 0.0162 5.27
4545.86 4544.85 25.745 0.7655 15.04 0.0424 7.45
4574.44 4573.43 25.825 0.2026 0.70 0.0020 1.98
4589.43 4588.42 25.867 0.2134 1.61 0.0045 2.08
4610.07 4609.07 25.925 0.1564 0.29 0.0008 1.53
4632.98 4631.97 25.989 0.9352 10.71 0.0299 9.17
4653.41 4652.40 26.046 0.3656 2.90 0.0081 3.59
4673.98 4672.97 26.104 0.2227 0.95 0.0026 2.19
4705.09 4704.08 26.190 0.1266 0.60 0.0017 1.25
4721.34 4720.33 26.235 0.5855 7.57 0.0209 5.79
4746.55 4745.55 26.305 0.5041 8.28 0.0228 4.99
4760.71 4759.70 26.344 0.4023 4.44 0.0122 3.99
4776.82 4775.81 26.388 0.5845 8.39 0.0231 5.81
4795.96 4794.95 26.441 0.8917 14.07 0.0386 8.87
4817.65 4816.64 26.500 0.7853 15.13 0.0414 7.83
4900.93 4899.92 26.727 0.5187 5.56 0.0151 5.21
4946.35 4945.35 26.850 0.3060 3.20 0.0086 3.09
4963.56 4962.55 26.897 0.4123 6.74 0.0182 4.16
5010.78 5009.78 27.024 12.5885 211.54 0.5681 127.69
5031.99 5030.99 27.081 5.8531 84.84 0.2273 59.48
5053.19 5052.18 27.137 3.0847 47.31 0.1265 31.41
5074.18 5073.17 27.193 1.7893 33.97 0.0906 18.25
5109.70 5108.69 27.288 1.4186 37.78 0.1004 14.52
5174.52 5173.52 27.460 0.4570 6.47 0.0171 4.70
5215.36 5214.36 27.568 0.7393 7.91 0.0208 7.64
5234.38 5233.38 27.618 0.5442 9.17 0.0241 5.63
5273.44 5272.43 27.720 0.2111 1.10 0.0029 2.19
5340.59 5339.58 27.895 0.5133 5.40 0.0140 5.36
5504.23 5503.22 28.318 0.3130 3.85 0.0099 3.32
5525.79 5524.79 28.373 0.3048 4.10 0.0105 3.24
5584.59 5583.58 28.523 0.4938 16.84 0.0429 5.27
5710.82 5709.81 28.842 0.2989 6.40 0.0161 3.23
5758.22 5757.21 28.961 0.3075 2.85 0.0071 3.33
5832.21 5831.20 29.146 0.4003 4.57 0.0114 4.37
5871.67 5870.66 29.244 0.3528 4.17 0.0103 3.86
5885.14 5884.13 29.277 0.3028 7.90 0.0195 3.32
6013.84 6012.83 29.595 0.7071 19.42 0.0477 7.84
6034.06 6033.06 29.644 0.4344 5.55 0.0136 4.83
6396.04 6395.03 30.517 3.0543 118.14 0.2814 35.06
6455.26 6454.25 30.657 26.1287 771.78 1.8272 301.52
6477.39 6476.38 30.710 12.0491 218.47 0.5159 139.32
6499.00 6497.99 30.761 7.2773 135.33 0.3190 84.31
6521.19 6520.18 30.813 5.3012 97.81 0.2302 61.54
6542.80 6541.79 30.864 4.2675 88.66 0.2083 49.63
6638.04 6637.03 31.087 20.2348 631.52 1.4750 237.36
6654.30 6653.29 31.125 19.0952 360.62 0.8401 224.32
6675.85 6674.84 31.175 9.8609 187.44 0.4359 116.07
6698.42 6697.41 31.227 6.2424 112.83 0.2620 73.63
6718.01 6717.00 31.273 4.2544 83.96 0.1946 50.27
6739.45 6738.44 31.322 2.7267 46.03 0.1065 32.28
6765.34 6764.34 31.382 1.9976 39.64 0.0916 23.70
6810.67 6509.66 31.487 2.0664 79.46 0.1831 24.62
6858.73 6857.73 31.597 1.8896 104.59 0.2400 22.61
7151.49 7150.48 32.262 0.9514 22.94 0.0516 11.69
7172.92 7171.91 32.310 1.0333 43.31 0.0971 12.72
7472.88 7471.87 32.977 0.4560 13.01 0.0286 5.77
7617.94 7616.93 33.294 0.4693 11.51 0.0251 6.02
7654.14 7653.13 33.373 1.3314 67.51 0.1465 17.12
7827.96 7826.96 33.748 0.2802 7.57 0.0163 3.66
7926.90 7925.89 33.960 2.4904 114.75 0.2450 32.85
7958.23 7957.23 34.027 1.3527 31.25 0.0665 17.89
8133.31 8132.30 34.398 7.5286 658.02 1.3865 101.22
8303.10 8302.09 34.754 0.8155 44.66 0.0931 11.14
8365.08 8364.07 34.883 0.5422 19.48 0.0405 7.45
8612.18 8611.18 35.393 10.6716 1028.00 2.1038 150.06
8774.36 8773.35 35.723 2.1558 178.91 0.3625 30.78
8940.04 8939.03 36.058 4.2497 277.17 0.5570 61.65
9028.23 9027.22 36.235 0.5131 9.18 0.0184 7.51
9116.51 9115.50 36.411 0.6114 14.83 0.0295 9.02
9162.72 9161.71 36.503 0.8263 59.88 0.1189 12.25
9307.46 9306.45 36.789 0.5852 23.46 0.0462 8.80
9454.10 9453.09 37.077 1.5935 140.29 0.2741 24.30
9585.08 9584.07 37.332 0.1746 4.40 0.0085 2.70
9683.68 9682.67 37.523 0.2391 6.15 0.0119 3.73
9743.77 9742.76 37.639 0.4345 27.31 0.0525 6.82
10072.71 10071.70 38.267 0.2760 15.39 0.0291 4.47
11533.88 11532.87 40.940 0.2410 19.15 0.0339 4.56
11691.05 11690.04 41.217 0.2518 35.15 0.0617 4.84
12454.78 12453.77 42.538 0.5778 57.72 0.0983 12.12
13574.94 13573.93 44.405 1.1111 178.32 0.2910 26.75
13715.41 13714.41 44.633 0.4473 42.34 0.0686 10.97
13866.02 13865.01 44.877 0.3384 35.35 0.0570 8.46
14034.19 14033.19 45.148 0.2951 53.00 0.0849 7.55
14392.29 14391.28 45.719 0.5330 106.02 0.1676 14.32
15118.66 15117.65 46.855 0.3627 57.41 0.0886 10.83
15313.34 15312.33 47.155 0.1527 18.28 0.0280 4.70
15870.49 15869.48 48.003 0.1483 34.49 0.0519 4.99
16659.22 16658.21 49.178 0.1152 23.78 0.0350 4.45
17261.53 17260.53 50.057 0.2182 48.44 0.0702 9.49
17403.26 17402.25 50.262 0.2735 94.70 0.1356 12.26
22185.18 22184.17 56.732 0.6056 798.59 1.0136 49.97
28054.19 28053.18 63.781 0.2571 107.68 0.1221 39.27
29051.79 29050.78 64.903 0.1030 74.85 0.0832 16.04
33245.74 33244.73 69.421 1.6601 1750.64 1.8258 281.43
34281.46 34280.45 70.492 0.5196 597.67 0.6025 89.96
39898.16 39897.15 76.038 0.0257 11.52 0.0110 4.98
44457.39 44456.39 80.258 0.3417 989.32 0.8917 69.77
49939.53 49938.52 85.055 0.0226 19.83 0.0169 4.91
51350.04 51349.03 86.246 0.0499 94.72 0.0792 10.85
55656.75 55655.74 89.784 0.0711 186.88 0.1514 15.47
59215.94 59214.93 92.607 0.1083 250.62 0.1967 23.63
66317.60 66316.59 97.995 2.2783 6680.56 4.9211 498.39
72737.16 72736.15 102.622 0.1259 350.29 0.2456 27.61
75001.97 75000.96 104.206 0.1127 216.04 0.1488 24.73
80013.65 80012.64 107.627 0.0678 279.89 0.1869 14.91
88591.36 88590.35 113.242 0.0472 171.17 0.1093 10.41
99724.32 99723.31 120.139 0.0857 436.66 0.2624 18.82
110663.70 110662.70 126.550 0.0315 123.51 0.0705 7.11
115751.09 115750.08 129.423 0.0392 84.89 0.0477 9.03
116910.94 116909.93 130.069 0.0411 256.88 0.1413 9.53
132576.48 132575.47 138.501 0.2015 1519.36 0.7867 49.62
175561.80 175560.79 159.360 0.0192 204.64 0.0927 5.21
表2：蛋白的峰检测，所述蛋白(S/N比＞3)来自采用均一化珠处 理后的血清。所检测的全部峰＝271
M/z 质量 TOF 强度 MZ面积 TOF面积 S/N
2021.84 2020.83 17.207 0.6376 12.12 0.0503 8.96
2067.93 2066.93 17.398 0.6601 6.51 0.0267 9.31
2087.13 2086.12 17.476 0.7201 7.41 0.0303 10.18
2106.09 2105.09 17.554 0.4864 3.56 0.0145 6.89
2180.24 2179.23 17.853 0.5382 3.23 0.0129 7.67
2221.86 2220.85 18.019 1.4170 8.54 0.0339 20.27
2240.96 2239.96 18.095 0.5589 6.06 0.0240 8.01
2266.94 2265.93 18.198 0.5494 3.98 0.0157 7.89
2293.08 2292.07 18.300 0.3779 2.12 0.0083 5.44
2339.18 2338.18 18.480 0.9868 7.77 0.0301 14.26
2378.63 2377.62 18.632 0.6337 4.75 0.0183 9.19
2396.27 2395.27 18.700 0.5728 5.76 0.0221 8.32
2439.97 2438.96 18.867 1.0408 6.19 0.0235 15.17
2467.12 2466.12 18.969 0.9706 8.52 0.0322 14.18
2497.92 2496.92 19.086 0.9600 7.48 0.0281 14.06
2526.24 2525.23 19.192 0.8088 7.31 0.0273 11.88
2553.87 2552.86 19.295 2.9512 30.44 0.1132 43.44
2625.36 2624.35 19.559 0.5117 2.40 0.0088 7.58
2655.34 2654.33 19.669 0.9776 9.38 0.0343 14.51
2683.62 2682.62 19.772 19.4999 144.76 0.5259 290.17
2706.16 2705.15 19.853 2.6950 27.91 0.1010 40.18
2729.04 2728.03 19.936 1.1192 9.74 0.0351 16.72
2801.03 2800.03 20.194 1.4372 7.80 0.0278 21.60
2841.72 2840.71 20.338 5.3061 38.45 0.1359 80.01
2864.83 2863.82 20.420 0.9591 9.76 0.0344 14.49
2889.55 2888.55 20.507 3.5170 27.58 0.0967 53.24
2930.16 2929.15 20.649 0.6606 5.11 0.0178 10.03
2946.66 2945.66 20.706 1.4513 12.23 0.0425 22.07
2991.41 2990.41 20.861 1.0116 11.76 0.0406 15.44
3068.43 3067.42 21.125 2.6692 27.74 0.0946 41.00
3091.47 3090.47 21.204 0.5713 6.74 0.0229 8.79
3104.33 3103.32 21.247 2.7977 23.84 0.0808 43.10
3128.84 3127.84 21.330 0.4361 3.91 0.0132 6.73
3159.53 3158.53 21.434 1.1023 8.52 0.0286 17.06
3186.78 3185.78 21.525 0.2998 2.51 0.0084 4.65
3203.52 3202.51 21.581 0.6912 5.44 0.0182 10.73
3224.18 3223.17 21.650 2.4947 24.72 0.0823 38.81
3237.12 3236.11 21.693 1.2228 9.75 0.0324 19.04
3247.56 3246.55 21.728 0.4539 3.69 0.0122 7.07
3289.31 3288.30 21.866 13.5948 102.60 0.3383 212.58
3311.94 3310.93 21.940 1.9602 1493 0.0491 30.71
3336.82 3335.81 22.022 4.7302 36.91 0.1209 74.25
3346.26 3345.25 22.053 1.2829 10.27 0.0336 20.15
3358.47 3357.46 22.093 0.6222 3.29 0.0108 9.78
3373.64 3372.63 22.142 0.5314 4.59 0.0149 8.37
3385.05 3384.04 22.179 0.8139 6.98 0.0227 12.82
3415.17 3414.17 22.277 0.4451 3.75 0.0121 7.03
3427.49 3426.48 22.317 2.3109 15.05 0.0487 36.53
3438.79 3437.78 22.353 1.0937 8.77 0.0283 17.31
3447.05 3446.04 22.380 0.8280 5.94 0.0191 13.11
3459.90 3458.90 22.421 0.3291 1.87 0.0060 5.22
3467.20 3466.19 22.445 0.2547 1.29 0.0042 4.04
3485.27 3484.26 22.503 0.9642 6.74 0.0216 15.31
3495.20 3494.20 22.535 0.4776 3.13 0.0100 7.59
3506.27 3505.26 22.570 0.7766 5.56 0.0178 12.35
3524.49 3523.48 22.628 0.6243 5.34 0.0170 9.95
3530.57 3529.57 22.648 0.8564 6.82 0.0217 13.65
3552.77 3551.76 22.718 0.2099 1.07 0.0034 3.35
3573.00 3572.00 22.783 1.7464 12.44 0.0394 27.93
3642.53 3641.53 23.002 0.8032 4.85 0.0152 12.92
3660.13 3659.12 23.057 1.7988 14.34 0.0449 28.96
3683.85 3682.84 23.131 0.5319 4.38 0.0137 8.58
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11046.41 11045.40 40.104 0.1310 5.23 0.0096 3.68
11147.95 11146.94 40.289 0.1517 7.75 0.0141 4.29
11431.94 1143.093 40.802 1.5601 85.67 0.1542 45.13
11515.49 11514.48 40.952 3.4607 316.45 0.5666 100.79
11667.57 11666.56 41.223 5.1984 534.22 0.9496 153.29
11874.61 11873.61 41.590 0.8999 92.25 0.1626 26.99
12135.29 12134.28 42.047 0.3472 20.90 0.0365 10.64
12213.21 12212.20 42.183 0.1927 12.50 0.0217 5.94
12421.55 12420.55 42.543 0.4176 25.40 0.0438 13.11
12553.09 12552.08 42.770 0.3921 26.02 0.0446 12.44
12837.97 12836.97 43.255 0.7051 53.27 0.0904 22.92
13035.41 13034.40 43.589 0.2257 19.66 0.0331 7.46
13517.28 13516.27 44.393 1.7454 207.59 0.3436 60.20
13664.19 13663.19 44.635 1.0656 136.20 0.2239 37.24
13826.26 13825.25 44.901 0.9339 96.11 0.1572 33.11
14005.24 14004.23 45.193 4.3241 437.10 0.7106 155.80
14103.83 14102.82 45.353 2.4578 213.14 0.3450 89.36
14335.82 14334.81 45.727 8.7632 1030.75 1.6560 325.47
14534.46 14533.45 46.045 2.5813 335.53 0.5351 97.66
14717.09 14716.08 46.335 0.8605 197.18 0.3118 33.12
15187.24 15186.24 47.075 0.4437 75.60 0.1177 17.87
15657.41 15656.40 47.803 0.0897 8.45 0.0130 3.78
15820.39 15819.38 48.053 0.0865 9.75 0.0149 3.71
16443.65 16442.64 48.997 0.1190 11.73 0.0176 5.45
17066.08 17065.07 49.923 1.3076 165.52 0.2444 64.05
17175.08 17174.07 50.083 2.5670 301.87 0.4434 127.30
17296.48 17295.47 50.261 2.7701 417.80 0.6109 139.28
17482.10 17481.09 50.532 1.0341 142.54 0.2072 53.11
17766.54 17765.53 50.944 0.6228 131.11 0.1894 33.08
17945.02 17944.01 51.201 0.6698 282.23 0.4026 36.33
21092.56 21091.55 55.543 0.1325 101.64 0.1341 11.26
23718.05 23717.04 58.924 0.0883 65.37 0.0812 13.41
25789.62 25788.62 61.462 0.0509 34.02 0.0407 10.83
27804.46 27803.45 63.835 2.9497 1524.96 1.7606 669.03
28548.76 28547.75 64.689 0.8053 668.67 0.7571 187.12
31256.57 31255.56 67.709 0.0260 14.77 0.0161 6.61
32717.17 32716.17 69.284 0.0180 7.30 0.0078 4.81
34145.25 34144.24 70.791 0.1024 84.34 0.0879 28.83
34918.38 34917.37 71.593 0.0511 38.33 0.0394 14.78
37428.16 37427.16 74.139 0.0394 67.81 0.0677 12.55
39114.93 39113.92 75.802 0.0493 57.70 0.0560 16.80
41845.54 41844.54 78.421 0.1089 116.05 0.1097 40.17
42589.26 42588.26 79.120 0.0904 94.91 0.0883 33.69
44703.94 44702.93 81.073 0.0546 86.72 0.0788 20.98
50260.95 50259.94 85.996 0.0194 29.77 0.0255 8.06
55322.52 55321.51 90.250 0.1770 349.83 0.2859 79.52
65162.70 65161.69 97.996 0.0237 72.94 0.0551 11.64
69555.70 69554.69 101.264 0.0206 80.68 0.0584 10.46
82925.12 82924.12 110.623 0.0246 73.37 0.0490 13.93
89416.65 89415.64 114.894 0.0060 23.19 0.0148 3.43
97397.95 97396.94 119.939 0.0063 12.81 0.0079 3.57
110339.51 110338.50 127.698 0.0057 46.50 0.0263 3.26
实施例2.文库与未分级分离的、未稀释的人混合血浆的孵育
[164]为有助于分析复合样品，本方法可用于减小浓度差异。人血 浆是一种最复杂和难以分析的物质：蛋白质存在的浓度范围大于1010 (Anderson和Anderson)；减小该范围将有助于分析痕量蛋白质。在 该方法的条件下，与未经处理的起始物质相比，血浆与配体文库的孵 育将增加可检测的并随后可分析的蛋白质的数量。
A. 样品制备
[165]冷冻的、混合的人贫血小板血浆(PPP)于37℃下解冻，然 后经0.8和0.45μm滤器过滤。位于具有EA CA-Ala间隔子的Toyopearl 650M氨基树脂(平均直径65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences， Montgomeryville，PA)上的，四个重复份的大约1ml六聚体肽配体文 库各自与9ml血浆于室温下旋转孵育1小时。树脂排干，然后用1ml 柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸盐，140mM NaCl，pH 7.0)洗涤。保 留该洗涤溶液，以及上样血浆和起始流通的样品。随后用20个柱体积 的柠檬酸盐洗涤珠文库。
[166]100μl来自样品2和4的树脂与等体积(100μl)的2×LDS 缓冲液+DTT(Invitrogen，Carlsbad，CA)在90℃下孵育10分钟， 然后离心。收集并保存上清液以备分析。
[167]200μl来自重复份1-4的树脂与400μl 6M GuHCl或400μl 6M脲以批量形式孵育1小时。树脂排干，然后收集流通液以备分析。 在G-25柱上将洗脱液中GuHCl和脲的浓度减低至1M脲，步骤如下： 用200μl 1M脲5分钟平衡G-25柱两次，然后2000rpm离心3分钟。 在试管中加入20μl脲和GuHCl样品，然后在相同的条件下再次离心。 收集流通液。
B. LDS-PAGE分析
[168]起始PPP、流通液和洗涤液用柠檬酸盐缓冲液按1∶25稀释， 然后用2×样品缓冲液按1∶2稀释。14μl处理的GuHCl和脲上清液在 5μl 4×LDS缓冲液+2μl DTT还原剂中于90℃加热10分钟。用大约 10μl来自样品2和4的珠上样两个孔。在MOPS缓冲液中，23μl的 各个保留的样品在4-12％Bis-Tris凝胶(NuPage，Invitrogen)上于200 V进行电泳。凝胶用Simply Blue(Invitrogen)按照厂商说明书进行染 色。结果显示于图1和图4中。
[169]经过处理的样品中存在若干条带，这些条带未能见于初始血 浆中，而初始血浆中存在的非常明显的白蛋白条带(～64kD)基本上 被减小了。这些结果表明，所述方法确实减少了蛋白质的浓度范围， 如该方法所检测到的，因此与初始物质的分析相比，所述方法增加了 可检测和可分析的蛋白质的数量。
实施例3.除去IgG后浓度方差的减小
[170]在多种蛋白质组应用中，样品制备的首要步骤之一是除去白 蛋白和IgG，因为这些高丰度蛋白质掩蔽了低丰度品种的检测。然而除 去这些蛋白，也常常除去了与它们相关的痕量品种，而且还会有样品 的损失。在分析前不需要除去IgG的样品制备方法将会是有益的。本 实施例表明，使在完整血浆中不能检测的蛋白质品种可视化并不需要 除去IgG。在除去或未除去IgG的血浆中，比较了在LDS-PAGE中检 测到的蛋白质图谱。
A. 样品制备
[171]冷冻的、混合的人贫血小板血浆(PPP)于37℃下解冻，然 后经0.8和0.45μm过滤器过滤。按照如下步骤除去血浆中的IgG：在 Bio-Rad柱中填充5ml Protein G Sepharose Fast-flow树脂 (Amersham，T&S)，以10cm/h流速(通过振动泵控制)加入10ml 过滤的PPP，然后收集流通液。
[172]位于具有EA CA-Ala间隔子的Toyopearl 650 M氨基树脂 (平均直径65μm，～2×106珠/ml；Tosoh Biosciences， Montgomeryville，PA)上的，大约1ml六聚体肽配体文库与9ml流 通液(如上)孵育1小时/室温/旋转。用手除去孵育期间形成的凝块。 树脂排干，然后用1ml柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸盐，140mM NaCl，pH 7.0)洗涤，接着用10ml T-柠檬酸盐(柠檬酸盐缓冲液+0.05％ Tween-20)和10ml柠檬酸盐缓冲液洗涤。收集流通液和最初1ml的 洗涤液以备分析。将树脂大约分为3等份，每等份200μl。
[173]一个树脂等份与等体积(200μl)2×LDS缓冲液+DTT (Invitrogen，Carlsbad，CA)于90℃加热10分钟，然后离心。收集 并保存上清液以备分析。剩余的树脂等份与500μl 6M GuHCl或500 μl 6M脲以批量形式孵育1小时。树脂排干，然后收集流通液已备分 析。
[174]洗脱液中的GuHCl和脲浓度从6M减少至1M浓度，而一 半的初始体积(2×浓缩的)在G-25柱上通过缓冲液交换。
B. LDS-PAGE分析
[175]初始的PPP、除去IgG的PPP、流通液和洗涤液，以及GuHCl 和脲上清液的样品在LDS缓冲液+DTT还原剂中于90℃加热10分 钟。LDS缓冲液、GuHCl和脲洗脱液的最终稀释度分别为0.25x、lx 和lx。PPP、除去IgG的血浆、流通液和洗涤液被稀释为50X。Protein G LDS和Glycine洗脱液与2×LDS缓冲液+DTT孵育。23μl各样品 在4-12％Bis-Tris凝胶上电泳，MOPS缓冲液，200V。根据上述方法 先前所制备的血浆样品(从中除去IgG)同样进行电泳。随后通过 SilverQuest按照厂商说明书使用Simply Blue对凝胶染色。数据显示于 图2中。
[176]虽然开始时，流通液和洗涤液样品的MW 50和25 KDa的 蛋白质(减少的免疫球蛋白重链和轻链的大小)有明显的减少，但如 凝胶所示，来自包含和不包含IgG的血浆的LDS-PAGE洗脱液中均没 有显著性差异。由于样品处理的问题，来自脲和GuHCl样品的信号是 不明显的。这些数据表明除去IgG的影响不明显。优选除去和保留IgG 可能是为了其它的原因，或许是为了独立分析；但是，对于通过该方 法分析痕量蛋白而言，并不需要除去IgG。
实施例4.人血清中蛋白质浓度范围的减小
[177]前面的实施例已表明所述方法可用于未稀释和未分级分离 的人血浆的用途。在临床诊断中起始样品通常是血清，而非血浆。下 面的实施例表明使用所述方法制备血清用于分析的可行性。
A. 血清制备
[178]5个7ml装有人血的试管在4℃过夜使其凝固成血块。凝固的 血块在Sorvall离心机RT7中4,000rpm离心5分钟，收集血清，然后 经0.8和0.45μm滤器过滤。
B. 样品制备：
1.基于TentaGel的文库孵育
[179]将250μl TentaGel文库[含有Gly间隔子的TentaGel M NH2 10μm(Rapp Polymer)文库(Peptides International，Louisville， KY)平均直径10μm，～5.6×108珠/ml]置于15ml锥形管中与2.25ml (1∶9v/v)血清在室温(RT)下孵育1小时。4000rpm离心树脂2分 钟，然后保存上清液以备分析(FT Tenta)。用1.25ml柠檬酸盐缓冲 液摇动洗珠，然后在2ml Eppendorf管中4,000rpm离心2分钟。保留 洗涤液用于分析(W Tenta)。再加入4×1.25ml柠檬酸盐缓冲液洗珠。 将珠分成3等份，每等份大约75μl。
[180]一个树脂等份与75μl 2×LDS/DTT于90℃孵育10分钟。离 心珠，然后将上清液保存于-20℃。其它等份与200μl 6M脲或6M GuHCl于RT下孵育1.5小时。初始及未结合的血清部分用柠檬酸盐按 1∶25稀释，然后用2×LDS/DTT按1∶2稀释。样品于90℃加热10分钟， 然后冷冻于-20℃。
2.基于Toyopearl的文库孵育
[181]将大约1ml Toyopearl文库(平均直径65μm，～2×106珠 /ml；Tosoh Biosciences，Montgomeryville，PA)与9ml血清孵育1小 时/RT/旋转。200μl树脂在200μl 2×(LDS缓冲液+DTT还原剂)中 于90℃加热10分钟。收集上清液并保存于-20℃以备分析。200μl树 脂与400μl(v/v)6M脲以批量形式孵育1小时。收集流通液以备分析 并保存于室温下。200μl树脂与400μl 6M GuHCl以批量形式孵育1 小时。收集流通液以备分析并保存于室温下。初始及未结合的血清部 分用柠檬酸盐按1∶25稀释，然后用2×LDS/DTT按1∶2稀释。样品于 90℃加热10分钟，然后冷冻于-20℃。200μl血清和200μl各未结合 部分交付于Analytical Chemistry分析。
C. LDS-PAGE分新
[182]14μl的1M脲和GuHCl样品用5μl 4×LDS缓冲液和2μl 10×DTT于90℃加热10分钟。冷冻的LDS样品于90℃再加热10分钟。 在4-12％Bis Tris凝胶中每孔上样各样品20μ1。凝胶用MOPS电泳缓 冲液于200V进行电泳，直至染料前端到达凝胶底部。根据厂商说明书 用Simply Blue蛋白质染色剂染色凝胶，然后用H2O脱色。凝胶显示 于图3中。
[183]用文库孵育后，血清中可见条带的数目有实质性增加(泳道 2与3和8相比)。条带的图谱与使用血浆孵育文库所得图谱非常相似 (泳道3，图3与泳道7，图1相比)。这些结果表明用本发明的方法 制备的血清样品增加了可用LDS-PAGE分析的条带的数目，而且与初 始血清相比，洗脱液中大部分高丰度蛋白质的浓度减小。
[184]虽然为了清楚和理解而通过例举说明和实施例的方式已经 对上述发明作出了某些细节描述，但对于本领域的普通技术人员来说 显而易见的是，在本发明的教导下在不背离所附权利要求的精神和范 围的情况下可对其作出特定的变化和修改。
[185]正如具体地而且独立地将各个独立出版物或专利申请引入 作为参考一样，本说明书中所引用的全部出版物和专利申请均被引入 此处作为参考。