技术领域
本发明涉及一种新型免疫奶制品，特别是涉及一种含有抗阪歧肠杆菌特异 性IgY的免疫奶制品及其制备方法。
背景技术
2002年11月1日，美国食品药品监督管理局(FDA)从「惠氏」公司生 产的婴儿配方奶粉中检出阪歧肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，并从市场上召回 该公司的部分产品。随后，其它国家的检验机构也先后在“美赞臣”等大型奶 粉厂的婴儿奶粉中检测出阪歧肠杆菌等致病菌。
这就警示人类：婴儿配方奶粉并非无菌产品，可能含有致病的细菌，例如 阪歧肠杆菌、沙门氏菌。
世界卫生组织(WHO)指出，2004年法国两名体重不足的婴儿在医院喝 下遭细菌污染的婴儿配方奶粉后夭折，类似的案例在新西兰也有一例。WHO 和联合国食品专家推论，婴儿配方奶粉遭细菌污染是造成感染，是导致早产儿 和体重不足婴儿生病的一个原因，甚至可能导致严重发育受损和死亡。
世界各国对婴儿配方奶粉遭细菌污染的问题关切日深，2005年5月，192 个会员国在的WHO大会最后一天一致通过决议指出，市面上的奶粉存在含阪 歧肠杆菌等致病菌的严重风险，呼吁为高危险群(例如早产儿、体重不足、或 免疫力差)的婴儿准备配方奶粉时，应提高警觉。
由于被检出奶粉产品中含有阪歧肠杆菌的厂家都是大药厂，其奶粉产品在 生产过程中必定有高标准的无菌环境，出产前也肯定经过严格灭菌工序；结果 其产品中仍然被检出有害的阪歧肠杆菌。这就告诉人们，目前的灭菌措施并不 能杜绝阪歧肠杆菌。本发明的发明人认为这是一种生命力特强、耐药性很强的 特殊细菌，目前的消毒方法对其无能为力；而且它会附着在已经消毒过的奶粉 生产设备上(有报告指出：生产婴儿配方奶粉的设备上曾找到阪歧肠杆菌，此 可能是已经消毒的奶粉配方的潜在污染源头)，造成奶粉生产商对其束手无策。 迄今为止，全世界都尚未找到有效解决这一令人头痛的问题之方法；因此，许 多国际知名大型奶粉企业近年来产品销量大幅滑坡，全球奶粉生产企业都面临 严重威胁。
阪歧肠杆菌为食源性致病菌，如果被新生儿特别是早产儿和免疫力弱的婴 儿吸食体内，极易患脓毒症、肠坏死症和败血症，在某种情况下，死亡率高达 80％。鉴于这种细菌对婴幼儿危害很大，务必将其从婴儿奶粉中清除。可是， 这种特殊的细菌型种多变，生命力又非常强；目前的方法包括巴氏高温消毒都 无法消除它，又不可能在婴儿奶粉中添加化学杀菌药或抗生素，更何况普通化 学杀菌剂和抗菌素对它也没有多大效果。针对这一现状，本发明提出一种创新 方法，制备一种天然安全的抗阪歧肠杆菌特异性IgY，将其添加到婴儿奶或奶 粉中，婴幼儿服用这种特殊奶或奶粉，其中所含的抗阪歧肠杆菌特异性IgY就 会特异性与这种顽固的阪歧肠杆菌等致病菌结合，将其抑灭，从而避免阪歧肠 杆菌等致病菌危害婴幼儿身体健康。同时，由于腹泻病是发展中国家小儿死亡 的第一位原因，其中婴幼儿轮状病毒和大肠杆菌、沙门氏菌是主要病原体；特 别是对轮状病毒引致的腹泻，全世界无药可治，据世界卫生组织统计，全球每 年有60万婴幼儿因此夭折。本发明采用特别技术将阪歧肠杆菌与沙门氏菌、 大肠杆菌以及婴幼儿轮状病毒复合制成一种复合抗原免疫产蛋禽类，制备一种 抗阪歧肠杆菌和婴幼儿轮状病毒等病原体的特异性复合IgY，将其添加到奶粉 或液体奶中，制成一种安全奶粉；既可抑灭乳制品中残留的阪歧肠杆菌和沙门 氏菌等致病菌，又能同时有效抑灭对婴幼儿生命威胁很大的婴幼儿轮状病毒， 全面提升婴幼儿免疫力，使婴幼儿从此摆脱腹泻的困扰。从而，为全球奶粉企 业提供了一种切实有效的消灭阪歧肠杆菌的手段，既可提升这些企业的产品的 功效和品质又可增加其经济收益；同时，保护了千百万婴幼儿的健康和生命， 具有很大的经济意义和社会意义。
发明内容
针对现有奶制品的上述缺陷，本发明的目的在于为解决现有的奶制品中残 存阪歧肠杆菌等致病菌的问题，提供一种可有效排除阪歧肠杆菌或同时有效排 除阪歧肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌以及婴幼轮状病毒对婴幼儿的侵袭的新型 免疫奶制品。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种抗阪歧肠杆菌特异性免 疫奶制品，其特征在于，该奶制品中含有阪歧肠杆菌特异性IgY抗体。
本发明所提供的奶制品为婴儿免疫奶或奶粉，其中阪歧肠杆菌特异性IgY 抗体的含量为0.01-1‰。该奶制品中含有的阪歧肠杆菌特异性IgY抗体，还可 以是抗阪歧肠杆菌、抗沙门氏菌、抗大肠杆菌和抗婴幼儿轮状病毒的复合IgY 抗体。
本发明的另一目的是提供一种抗阪歧肠杆菌特异性免疫奶制品的制备方 法，其特征在于，包含以下步骤：
1)对普通奶制品中检测到的残留细菌以及从受感染人体内获取的病原体 进行分析，筛选并确定最常见的阪歧肠杆菌作为单一免疫抗原，或将 筛选出的阪歧肠杆菌和沙门氏菌、大肠杆菌和婴幼儿轮状病毒一起作 为复合免疫抗原；
2)培养上述筛选出的阪歧肠杆菌，或同时培养阪歧肠杆菌和采用常规方 法培飬沙门氏菌、大肠杆菌和婴幼儿轮状病毒；
3)利用上述培养出的阪歧肠杆菌制备单一抗原，或者采用阪歧肠杆菌和 沙门氏菌、大肠杆菌以及婴幼轮状病毒，制备含阪歧肠杆菌的复合抗 原；
4)利用所述阪歧肠杆菌单一抗原或含阪歧肠杆菌的复合抗原，对产蛋禽 类进行高免疫注射，并检取免疫禽类所产的免疫蛋；
5)取所述免疫蛋的蛋黄，制备相应的阪歧肠杆菌特异性IgY抗体粗提物 或复合IgY抗体粗提物；
6)对所述阪歧肠杆菌特异性IgY抗体或复合IgY抗体粗提物进行纯化， 并进行过滤处理以滤除各种细菌和病毒，得到相应的阪歧肠杆菌特异 性IgY抗体或复合IgY抗体成品；
7)取所述阪歧肠杆菌特异性IgY抗体或复合IgY抗体成品按事先确定好 的比例与液态奶或奶粉原料混合，制成相应的抗阪歧肠杆菌免疫奶制 品。
上述制备方法中，在所述步骤(3)中制备单一阪歧肠杆菌抗原的方法可 以是：取事先培养好的单一型种阪歧肠杆菌2×109/mL或多型种阪歧肠杆菌按 各2×109/mL混合均匀得到阪歧肠杆菌混合液，再按10～1∶1～10的比例加 入福氏佐剂，然后置入高速匀浆机中，以8,000～30,000rpm高速匀化，形成 油包水乳液，即制得含阪歧肠杆菌的单一抗原。
上述步骤(3)中制备单一阪歧肠杆菌抗原的方法也可以是：取事先培养 好的单一型种阪歧肠杆菌2×109/mL或多型种阪歧肠杆菌按各2×109/mL混合均 匀得到阪歧肠杆菌混合液，然后置入超声粉碎机中加以超声粉碎，再将经粉 碎处理后的阪歧肠杆菌菌体混合液按10～1∶1～10比例加入福氏佐剂，即制 得含阪歧肠杆菌菌体的单一抗原。
上述制备方法中，在所述步骤(5)中制备阪歧肠杆菌特异性IgY抗体粗 提物或复合IgY抗体粗提物的方法为：(i)取步骤4)中所得的免疫蛋洗净并 擦洗消毒，用打蛋机免疫蛋打碎，再用蛋黄筛筛滤除去蛋清，将留下的蛋黄搅 拌均匀，测量所得的蛋黄的体积，按此体积的4～6倍加入蒸馏水进行稀释并 混合均匀，用NaOH溶液调整pH至5.5～6.0之间；(ii)将调整好pH值的稀 释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2～6℃，静置12～24小时；(iii)将 稀释液置入高速离心分离机中，离心分离20分钟；(iv)将离心分离所得的上 清液再置入超滤器中进行超滤并浓缩10～20倍，按0.1～0.3％的比例向浓缩后 的浆料中加入海藻酸钠，充分搅拌；再置入高速离心机中进行离心分离，取上 清液，去除脂蛋白；并将离心分离后的浆料置入超滤机中，经过超微膜，进行 过滤除菌；(v)将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得抗阪 歧肠杆菌特异性IgY抗体粗提物或特异性复合IgY抗体粗提物。
上述制备方法中，步骤(7)制备抗阪歧肠杆菌免疫奶制品的方法是：取 经前述步骤所制得抗阪歧肠杆菌特异性IgY抗体干粉或复合IgY抗体干粉，按 实现确定好的比例添加到奶粉原料中，采取等量放大匀化法用干粉搅拌机充分 混和匀化，即制成含抗阪歧肠杆菌特异性IgY抗体或复合IgY抗体的免疫奶粉。
上述步骤(7)中制备抗阪歧肠杆菌免疫奶制品的方法还可以是：取取经 前述步骤所制得阪歧肠杆菌特异性IgY抗体液体或复合IgY抗体液体，按实现 确定好的比例与液态奶混合，再置入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即可制成含 阪歧肠杆菌特异性IgY抗体抗体或复合IgY抗体的免疫液态奶；也可将该液态 奶再经冷冻干燥或在60～140℃温度下进行喷雾干燥，制成含抗阪歧肠杆菌特 异性IgY抗体或复合IgY抗体的免疫奶粉。
由于卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，简称IgY)属IgG类免疫 球蛋白，能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原(为某些细 菌或病毒)的状态或活性，并通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细 菌或病毒的吞噬；它能与病毒结合，改变病毒表面的构像，阻止病毒吸附于易 感细胞，同时，形成的病毒-IgY免疫复合物会被巨噬细胞吞噬。研究表明，IgY 属天然物质，没有任何药味，又不会诱发细菌产生耐药性；因然很适合作为一 种新型抗菌物质加入婴儿奶制品中。同时，本发明创造性地采用抗阪歧肠杆菌 特异性IgY这种新型抗体物质来解决阪歧肠杆菌污染婴儿奶粉这一困扰全球 奶品业的难题，还基于发明人独到地发现IgY应用在这里将会发挥以下其它抗 体所没有的优点：
1)由于进化的差异，IgY可和抗原上多个抗原决定簇起反应，这就起了 一个信号放大作用；其灵敏度和抗体活性也比一般哺乳动物包括牛的IgG高得 多(只需50微克/mL浓度就有理想的特异性活性)，同时，IgY不会诱发细菌 产生耐药性。这样就为解决生命力特强、亚型变化多的顽固阪歧肠杆菌的耐药 性问题创造了条件；
2)不会产生交叉血清反应或过敏反应；也不会将人的病原体带入人体内。 这一点对于作为食品添加成份供给免疫能力十分薄弱的婴幼儿使用，显得特别 重要。
3)试验证明IgY可抵抗胃蛋白酶和肠道胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶对其 活性的破坏，能通过胃到达小肠被人体吸收；这就使其能加入奶粉，通过口服 达到效果。
4)所制的抗体具有类似单克隆抗体的一致性；使得最终产品质量和性能 稳定。抗体制备成本比从牛等哺乳动物中制备低得多。这就为本发明能在全球 奶业中大面积推广应用提供了保证，具有确切可行的实用性。
5)鸡蛋黄中含有丰富卵磷脂，对婴幼儿大脑发育很有益，可制备一种含 卵磷脂的IgY抗体。
因此，发明人经过大量的研究试验和对比分析后，选择制备一种新型的能 特异性对抗阪歧肠杆菌的IgY抗体或复合抗体作为抑灭顽固阪歧肠杆菌等病 原体的最理想物质。
具体实施方式
一.抗阪歧肠杆菌特异性免疫奶粉的制备
1.制作抗阪歧肠杆菌特异性IgY或抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY
1.1.根据近年来检验检疫部门在普通婴儿奶粉中检测到的残留细菌以及受感 染儿童体内获取的病原体，筛选确定常见的四型种的阪歧肠杆菌和沙门氏 菌为代表性致病菌，另选择大肠杆菌和婴幼儿轮状病毒作为婴幼儿腹泻主 要病原体。
1.2.分别培养阪歧肠杆菌和沙门氏菌、大肠杆菌和婴幼儿轮状病毒
1.2.1.阪歧肠杆菌：
向美国病毒中心(ATCC)购买四种有代表性的阪歧肠杆菌，编号如下：
I.No.BAA-894：2001年从美国因食用奶粉感染阪歧肠杆菌的人体中 提出的品种；
II.No.29004：寄生在阴沟阪歧肠杆菌(Enterobacter cloacae)[此品种 由美国CDC从临床儿童体内获取培养成]；
III.No.29544：寄生在儿童体内阪歧肠杆菌变种(Enterobacter flavus)[此 品种由临床儿童喉中提出培养成]；
IV.No.51329：阪歧肠杆菌标准株。
然后分别用下列方法培养；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析 法纯化：
培养基：ATCC#3大菜汤：营养大菜汤(BD234000)
ATCC#3琼脂：营养琼脂(BD213000)
环境： 温度：30℃
大气环境：带氧
培飬步骤：
[1]按附上的指示打开小瓶
[2]用一支#3大菜汤(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小 管内将整粒菌球浸活。
[3]以无菌方式将同等量抽回大菜汤。摇匀。
[4]从大菜汤中抽取数滴种到另一支大菜汤或#3倾斜琼脂或/及琼脂碟。
[5]在30℃中培养24小时。
在#3碟上生长的菌落是：全缘的、平滑的、闪亮的、及微窿起的，并带有黄色斑点。
1.2.2.沙门氏菌、大肠杆菌、婴幼儿轮状病毒：
从婴幼儿腹泻患者粪便中中分离得到沙门氏菌、大肠杆菌和婴幼儿轮状 病毒，委托中国「江西省分子医学重点试验室」采用常规方法培养，然 后在香港雅臣药业集团(远东)有限公司本身所属的「雅臣生命科学院」 纯化。
1.3.制备单一抗原或复合抗原：
1.3.1.制备不同的含阪歧肠杆菌或阪歧肠杆菌体的单一抗原：
1.3.1.1.先将培养好的单一型阪歧肠杆菌种2×109/mL或2-4型阪歧肠杆菌种按 各2×109/mL混合均匀得到阪歧肠杆菌混合液；再按10-1∶1-10比例加入 福氏佐剂(最佳比例为1∶1)。然后将它们置入高速匀浆机中，以 8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得含阪歧肠杆菌的 单一抗原。
1.3.1.2.为了进一步提高所制备的IgY对付多型种和耐药的阪歧肠杆菌之生物 活性，本发明先将培养好的单一型种液2×109/mL或2-4型种阪歧肠杆 菌按各2×109/mL混合均匀，得到阪歧肠杆菌混合液，置入超声粉碎机 中加以超声粉碎；再将经特殊粉碎处理后的菌体混合液按10-1∶1-10比 例加入福氏佐剂(最佳比例为1∶1)，即制得含阪歧肠杆菌菌体的单一抗 原。
1.3.2.制备复合抗原：
1.3.2.1.先将培养好的No.BAA-894型阪歧肠杆菌(2×109/mL)、大肠杆菌 (2×109/mL)和沙门氏菌(2×109/mL)按1-10∶10-1∶10-1比例混合，最 佳比例为2∶0.5∶1；然后置入超声粉碎机中加以超声粉碎。
1.3.2.2.再将这三种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒液按10-1∶1-10比 例混合，最佳比例为3∶1；将所制得的抗原混合液，充分混和均匀，然 后，按10-1∶1-10比例加入福氏佐剂，最佳比例为1∶1，置入高速匀浆机 中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得复合抗原。
1.4.制备免疫蛋：
1.4.1.采用以上述方法制备的单一抗原或复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫；
1.4.2.每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫 后的母鸡所产免疫蛋，并加以编码标记。
1.4.3.以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；也可应用上 述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭、产蛋母鹅、产蛋 火鸡、或产蛋鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，得到相应的免疫蛋。
1.5.抗阪歧肠杆菌特异性IgY或特异性复合IgY的制备：
1.5.1.首先用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫 蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄 的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH 溶液调整pH至5.5-6.0之间。
1.5.2.将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃， 静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20 分钟；
1.5.3.将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3 ％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心 机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过 超微膜，进行过滤除菌；
1.5.4.将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干燥，分别制得抗阪歧肠杆 菌特异性IgY或特异性复合IgY粗提物。
1.5.5.应用SDS-PAGE电泳测定法，分别对按以上工艺所制得的特异性IgY或 特异性复合IgY粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量均为50％以上。
1.6.抗阪歧肠杆菌特异性IgY或特异性复合IgY的纯化：将以上抗阪歧肠杆菌 特异性IgY或特异性复合IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓 冲液)液中，再先后过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗阪歧肠杆 菌特异性IgY或特异性复合IgY成品。
1.7.对所制得的抗阪歧肠杆菌特异性IgY或抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY，参 照常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)分别进行活性检测。
检测结果显示，抗阪歧肠杆菌特异性IgY对阪歧肠杆菌的抗体结合效价 都达到1∶1,024以上。抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY对阪歧肠杆菌、大肠 杆菌和沙门氏菌的抗体结合效价都达到1∶1,024以上，对轮状病毒的抗体 结合效价则达到1∶4,096。以上测试样本的IgY浓度均为1mg/mL。
2.制作含抗阪歧肠杆菌特异性IgY或复合IgY的免疫奶制品
2.1.干粉混合法：
将所制得的抗阪歧肠杆菌特异性IgY或抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY干粉 以适当比例添加到婴儿免疫奶粉中，采取等量放大匀化法用干粉搅拌机充 分混和匀化，即制成含抗阪歧肠杆菌和抗婴儿腹泻病原体之抗体或复合抗 体之婴儿免疫安全奶粉。
2.2.液态混合法：
将1.5所制得的抗阪歧肠杆菌特异性IgY或抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY 液体经过过滤除菌后，不要冷冻干燥，按一定比例与普通鲜奶汁混合，置 入搅拌机中充分搅拌混和匀化，即制成含抗阪歧肠杆菌和抗婴儿腹泻病原 体之抗体或复合抗体之婴儿免疫安全奶。将这种婴儿免疫安全奶采用泠涷 干燥或以60-140℃温度进行喷雾干燥(注意：如用喷雾干燥，干燥时间要 尽量缩短，以免影响其中IgY的抗体活性)，即制成含抗阪歧肠杆菌和抗 婴儿腹泻病原体抗体或复合抗体之婴儿免疫安全奶粉。
二.试验例
1.试验例1
1.1.采用常规方法培养NO.BAA-894型阪歧肠杆菌和沙门氏菌。然后分别用 以下两种方法处理：
1.1.1.将NO.BAA-894型阪歧肠杆菌(2×109)、沙门氏菌(2×109)按1∶1比例 混合后加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化， 形成油包水乳液，即制得阪歧肠杆菌和沙门氏菌的原菌抗原。
1.1.2.将NO.BAA-894型阪歧肠杆菌(2×109)、沙门氏菌(2×109)按1∶1比例 混合后先加入超声粉碎机超声粉碎；再把所得菌体混合液以1∶1比例加 入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油 包水乳液，即制得阪歧肠杆菌和沙门氏菌的菌体抗原。
1.2.分别用这种两种抗原免疫鸡，得到相应的免疫蛋。并采用前叙方法中制备 的两种抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性IgY。
1.3.分别以NO.BAA-894型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧 肠杆菌以及沙门氏菌和轮状病毒作检测抗原，用常规“ELISA法”(酶联 免疫吸附试验)检测所制得的两种抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性IgY对 这6种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表： 检测用抗原 抗体结合效价 抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异 性IgY(原菌抗原免疫) 抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特 异性IgY(菌体抗原免疫) 阪歧 肠杆 菌 NO.BAA-894 1∶2,048 1∶2,048 NO.29004型 1∶1,024 1∶2,048 NO.29544型 1∶1,024 1∶2.048 NO.51329型 1∶1,024 1∶2,048 沙门氏菌 1∶2,048 1∶2,048 轮状病毒 0 0
(注：测试样本中的浓度均为1mg/mL)
从以上检测结果可以看出，采用本发明的将抗原原菌用超声粉碎后加 入高速匀浆机制成油包水菌体抗原，免疫禽类后所制备的抗阪歧肠杆 菌和沙门氏菌特异性IgY，对未作为抗原免疫的其它型种的阪歧肠杆 菌也有很高的抗体结合效价，即所制成的IgY可以对抗多种型种的阪 歧肠杆菌。也就是提示我们，「菌体抗原免疫」比「原菌抗原免疫」效 果好得多。这一点对于型种变化大的阪歧肠杆菌有着特别重要的意义。 试验结果也表明，由于没有将轮状病毒作为抗原免疫，所制得的两种 特异性IgY对轮状病毒都没有抗体结合效价。
2.试验例2
先将培养好的NO.BAA-894型种阪歧肠杆菌(2×109/mL)、大肠杆菌 (2×109/mL)和沙门氏菌(2×109/mL)按2∶1∶1比例混合；然后置入超声粉 碎机中加以超声粉碎。再将这三种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒 液按3∶1比例混合；将所制得的抗原混合液，充分混和均匀，然后，按1∶1 比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形 成油包水乳液，制成复合抗原。
用这种复合抗原免疫鸡，得到相应的免疫蛋。并采用前叙方法制备的抗阪歧 肠杆菌和沙门氏菌特异性复合IgY，分别以NO.BAA-894型、NO.29004型、 NO.29544型、NO.51329型阪歧肠杆菌以及沙门氏菌、大肠杆菌和轮状病毒 作检测抗原，用常规“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测所制得的抗阪 歧肠杆菌和沙门氏菌特异性复合IgY对这7种不同抗原的抗体结合效价。
结果如下表： 检测用抗原 抗体结合效价 抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性复合IgY (复合抗原免疫) 阪歧肠杆菌 NO.BAA-894 1∶2,048 NO.29004型 1∶2,048 NO.29544型 1∶2,048 NO.51329型 1∶2,048 沙门氏菌 1∶2,048 大肠杆菌 1∶1,024 轮状病毒 1∶4,096
(注：测试样本中的浓度为1mg/mL)
从以上检测结果可以看出，采用本发明的将细菌抗原原菌用超声粉碎 后再与轮状病毒混合，然后加入高速匀浆机制成油包水复合抗原，免 疫禽类后所制备的抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性复合IgY，对4种 型种的阪歧肠杆菌以及沙门氏菌、大肠杆菌、轮状病毒有很高的抗体 结合效价，即所制成的复合IgY可以对抗多种型种的阪歧肠杆菌以及 沙门氏菌、大肠杆菌和轮状病毒。
3.试验例3
将NO.BAA-894型阪歧肠杆菌(2×109)、沙门氏菌(2×109)按1∶1比例混 合后先加入超声粉碎机超声粉碎；再把所得菌体混合液以1∶1比例加入福氏 佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，制成阪歧肠杆菌 和沙门氏菌的菌体抗原。分别用这种两种抗原免疫鸡，得到免疫蛋。并采用 前叙方法制备抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性IgY。将这种抗阪歧肠杆菌特 异性IgY液体经过过滤除菌后，按一定比例与普通鲜奶汁混合，置入搅拌机 中充分搅拌混和匀化；然后以60-140℃温度进行喷雾干燥，即制成含抗阪 歧肠杆菌抗体之婴儿免疫安全奶粉。用纯水稀释这种免疫安全奶粉制成 1mg/mL浓度(IgY含量)的溶液；然后，分别以NO.BAA-894型、NO.29004 型、NO.29544型、NO.51329型阪歧肠杆菌和沙门氏菌作检测抗原，用常规 “ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测所制得的含抗阪歧肠杆菌和沙门氏 菌特异性IgY的免疫安全奶粉溶液对这5种不同抗原的抗体结合效价。结果 如下表： 检测用抗原 抗体结合效价 含抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性IgY之 免疫安全奶 阪歧肠杆菌 NO.BAA-894 1∶1,024 NO.29004型 1∶1,024 NO.29544型 1∶1,024 NO.51329型 1∶1,024 沙门氏菌 1∶1,024
(注：测试样本中的浓度为1mg/mL)
以上检测结果表明，采用本发明的方法所制成的含抗阪歧肠杆菌和沙 门氏菌特异性Ig的免疫安全奶粉对多种型种的阪歧肠杆菌以及沙门氏 菌都有很高的抗体结合效价，即对这些致病菌有理想的抑制作用。
4.试验例4
将所培养的NO.BAA-894型种阪歧肠杆菌(2×109/mL)、大肠杆菌(2×109/mL) 和沙门氏菌(2×109/mL)按2∶1∶1比例混合；然后置入超声粉碎机中加以超 声粉碎。再将这三种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒液按3∶1比例 混和均匀，再按1∶1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以 8,000-30,000rpm高速匀化制成复合抗原。
用这种复合抗原免疫鸡，得到相应的免疫蛋。并采用前叙方法制备抗阪歧肠 杆菌和沙门氏菌特异性复合IgY。将所制得的抗阪歧肠杆菌特异性IgY或抗 阪歧肠杆菌特异性复合IgY干粉以适当比例添加到婴儿免疫奶粉中，采取 等量放大匀化法用干粉搅拌机充分混和匀化，即制成含抗阪歧肠杆菌和抗婴 儿腹泻病原体之抗体或复合抗体之婴儿免疫安全奶粉。用纯水稀释这种免友 安全奶粉制成1mg/mL浓度(IgY含量)的溶液；然后，分别以NO.BAA-894 型、NO.29004型、NO.29544型、NO.51329型阪歧肠杆菌和沙门氏菌、大 肠杆菌以及婴幼儿轮状病毒作检测抗原，用常规“ELISA法”(酶联免疫吸 附试验)检测所制得的含抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY的免疫安全奶粉溶 液对这7种不同抗原的抗体结合效价。结果如下表： 检测用抗原 抗体结合效价 含抗阪歧肠杆菌和沙门氏菌特异性IgY之 免疫安全奶 阪歧肠杆菌 NO.BAA-894 1∶1,024 NO.29004型 1∶1,024 NO.29544型 1∶1,024 NO.51329型 1∶1,024 沙门氏菌 1∶1,024 大肠杆菌 1∶1,024 婴幼儿轮状病毒 1∶2,048
(注：测试样本中的浓度为1mg/mL)
以上检测结果表明，采用本发明的方法所制成的含抗阪歧肠杆菌特异 性复合IgY的免疫安全奶粉对多种型种的阪歧肠杆菌以及沙门氏菌、 大肠杆菌和婴幼儿轮状病毒都有很高的抗体结合效价，即能有效抑制 这些病原体。
5.试验例5--抗阪歧肠杆菌特异性IgY抑菌、杀菌试验。
5.1.试验材料和仪器
5.1.1.抗阪歧肠杆菌特异性IgY0.1％水溶液，
5.1.2.阪歧肠杆菌和沙门氏菌，
5.1.3.营养琼脂，
5.1.4.营养肉汤，
5.1.5.5％羊血营养肉汤，
5.1.6.培养箱，
5.1.7.721分光光度计，
5.1.8.生理盐水，
5.1.9.吸管，
5.1.10.天平。
5.2.试验方法：
5.2.1.抑菌(MIC)实验方法：
取9支无菌试管，每支试管中加入1mL营养肉汤或1mL 5％牛血清营养 肉汤和1mL已调整好浓度的细菌液(阪歧肠杆菌OD600＝0.3；沙门氏 菌OD600＝0.2)。然后第一支试管加入1mL的IgY水溶液，待充分混匀 后吸出1mL液体加入第二管，充分混匀后吸出1mL液体加入第三 管......，依次倍比稀释，稀释比为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32......。第 十管为不加IgY的水溶液，作为阳性对照。将试管放置培养箱，35℃培 养过夜。第二天观察试管培养液澄清度，最高稀释度的澄清管为抑菌管， 计算抑菌浓度(MIC)。
5.2.2.杀菌(MBC)实验方法：
将上述培养过夜的试管中液体摇匀，从试管中取一接种环液体接种于血 营养琼脂平板上作次代培养。将血营养琼脂平板放置培养箱，35℃培养 过夜，第二天观察结果，杀菌(MBC)的培养皿无菌落生长。
5.3.结果：
5.3.1.抑菌(MIC)观察：培养24小时后最高稀释度的澄清管为抑菌管，此管 的稀释度为抑菌的稀释比。
5.3.2.杀菌(MBC)观察：血营养琼脂平板培养24小时后观察菌落，最高稀 释度的无细菌生长的培养皿为杀菌稀释比。
抑菌(MIC)表： MIC 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 IgY 阪歧肠杆菌 - - - - - - - - - + 沙门氏菌 - - - - - - - - - +
杀菌(MBC)表： MBC 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 IgY 阪歧肠杆菌 - - - - - - - - + + 沙门氏菌 - - - - - - - - + +
试验结果表明：抗阪歧肠杆菌特异性IgY对阪歧肠杆菌和沙门氏菌有很强的抑 灭作用。
三.实施例
实施例1--用纯水提取法制备抗阪歧肠杆菌特异性鸡IgY
1.1.向美国病毒中心(ATCC)购买四种有代表性的阪歧肠杆菌，编号如下：
I.No.BAA-894：2001年从美国因食用奶粉感染阪歧肠杆菌的人体中提 出的品种
II.No.29004：寄生在阴沟阪歧肠杆菌(Enterobacter cloacae)[此品种由 美国CDC从临床儿童体内获取培养成]
III.No.29544：寄生在儿童体内阪歧肠杆菌变种(Enterobacter flavus)[此 品种由临床儿童喉中提出培养成]
IV.No.51329：阪歧肠杆菌标准株；
1.2.然后分别用下叙方法培养；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法 纯化，分别得到提纯的四种有代表性的阪歧肠杆菌；
具体培飬方法如下：
培养基： ATCC#3大菜汤：营养大菜汤(BD234000)
ATCC#3琼脂：营养琼脂(BD213000)
环境： 温度：30℃
大气环境：带氧
培飬步骤：
[1]按附上的指示打开小瓶
[2]用一支#3大菜汤(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小 管内将整粒菌球浸活。
[3]以无菌方式将同等量抽回大菜汤。摇匀。
[4]从大菜汤中抽取数滴种到另一支大菜汤或#3倾斜琼脂或/及琼脂碟。
[5]在30℃中培养24小时。
在#3碟上生长的菌落是：全缘的、平滑的、闪亮的、及微窿起的，并带有黄色斑点。
1.3.将以上培飬得到的四种阪歧肠杆菌按1∶1∶1∶1比例(各2×109)混合均匀， 然后将此混合液再与沙门氏菌(2×109)按3∶1比例混合，再加入超声粉 碎机超声粉碎；最后把所得菌体混合液以1∶1比例加入福氏佐剂，置入高 速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，制成阪歧 肠杆菌和沙门氏菌的菌体抗原；
1.4.以所制作的多种阪歧肠杆菌和沙门氏菌的菌体抗原免疫健康的产蛋母鸡 50只，每只肌内注射1mL，每隔二周注射一次，共计三次；
1.5.第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第7个月将所检得的7,500 只免疫蛋用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋 清，留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCl调pH至5.5-6.0，搅拌均 匀，2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20 倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊； 再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时； 8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗阪歧肠杆菌特 异性IgY粗提物750克；
1.6.将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗阪 歧肠杆菌特异性IgY纯品150克。
实施例2--用纯水提取法制备抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY
2.1.向美国病毒中心(ATCC)购买最有代表性的阪歧肠杆菌，编号： No.BAA-894；
2.2.然后采用以下方法培飬：
培养基： ATCC#3大菜汤：营养大菜汤(BD234000)
ATCC#3琼脂：营养琼脂(BD213000)
环境： 温度：30℃
大气环境：带氧
培飬步骤：
[1]按附上的指示打开小瓶
[2]用一支#3大菜汤(5-6mL)，用滴管吸0.5-1.0mL或移液管吸1mL，滴到小 管内将整粒菌球浸活。
[3]以无菌方式将同等量抽回大菜汤。摇匀。
[4]从大菜汤中抽取数滴种到另一支大菜汤或#3倾斜琼脂或/及琼脂碟。
[5]在30℃中培养24小时。
在#3碟上生长的菌落是：全缘的、平滑的、闪亮的、及微窿起的，并带有黄色斑点。
再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化。得到提纯的这种最有 代表性的阪歧肠杆菌；
2.3.委托“江西省分子医学重点试验室”从婴幼儿腹泻患者粪便中中分离得到 沙门氏菌、大肠杆菌、婴幼儿轮状病毒，然后采用常规方法培养，再纯化；
2.4.制备复合抗原：
2.4.1.先将培养好的No.BAA-894阪歧肠杆菌2×109/mL、大肠杆菌(2×109/mL) 和沙门氏菌(2×109/mL)按2∶0.5∶1比例混合；然后置入超声粉碎机中加 以超声粉碎；
2.4.2.再将这三种菌之混合物与已培养好并纯化的轮状病毒液按2∶1比例混合， 将所制得的抗原混合液，充分混和均匀；然后，按1∶1比例加入福氏佐 剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液， 制得复合抗原；
2.5.制备免疫蛋：
采用所制备的复合抗原，对产蛋母鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次， 计免疫三次；第一次免疫20天后，检取免疫后的母鸡所产免疫蛋；
2.6.抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY的制备：
2.6.1.首先用流动水洗净免疫蛋，再用酒精擦洗消毒；用打蛋机将检取的免疫 蛋打碎，用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀，测量所得的蛋黄 的体积，按此体积的4-6倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用NaOH 溶液调整pH至5.5-6.0之间；
2.6.2.将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃， 静置12小时-24小时；将稀释液加入高速离心分离机中，离心分离20 分钟；
2.6.3.将分离所得的上清再加入超滤器中进行超滤并浓缩10-20倍，按0.1-0.3 ％的比例将海藻酸钠加入浓缩后的浆料中，充分搅拌；再加入高速离心 机中离心，取上清，去除脂蛋白；将离心分离后的浆料加入超滤机，过 超微膜，进行过滤除菌；将过滤除菌后的产品用冷冻干燥机进行冷冻干 燥，则制成抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY粗提物；
2.6.4.应用SDS-PAGE电泳测定法，对所制得的抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY 粗提物进行检测，测得其中纯IgY含量为50％以上；
2.6.5.抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY的纯化：将抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY 粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后过离子 交换柱和凝胶层析柱层析，制成抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY成品。 对所制得的抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY，参照常规“ELISA法”(酶联免 疫吸附试验)进行活性检测。检测结果显示，抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY 对阪歧肠杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抗体结合效价都达到1∶1,024以上， 对轮状病毒的抗体结合效价则达到1∶4,096(以上测试样本的IgY浓度均为 1mg/mL)。
实施例3--用纯水提取法制备抗阪歧肠杆菌特异性鸭IgY
3.1.向美国病毒中心(ATCC)购买其中一种最有代表性的阪歧肠杆菌，编号 为：No.BAA-894；
3.2.用前叙方法培养；再用蔗糖密度梯度超速离心法或凝胶柱层析法纯化，得 到提纯的最有代表性的阪歧肠杆菌；
3.3.将培飬所得的这种最有代表性的阪歧肠杆菌(2×109)与沙门氏菌(2×109) 按2∶1比例混合，再加入超声粉碎机超声粉碎；最后把所得菌体混合液以 1∶1比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆机中，以8,000-30,000rpm高速匀化， 形成油包水乳液，制成阪歧肠杆菌和沙门氏菌的菌体抗原；
3.4.以所制作的阪歧肠杆菌和沙门氏菌的菌体抗原免疫健康的产蛋鸭100只， 每只肌内注射1mL，每隔二周注射一次，共计三次；
3.5.第一次注射后第20天开始检取免疫蛋，至第7个月将所检得的15,000只 免疫蛋用流动水冲净，75％乙醇消毒，晾干破碎蛋壳，以蛋黄筛滤去蛋清， 留取蛋黄加5倍蒸馏水搅匀，用1.0N HCI调pH至5.5-6.0，搅拌均匀， 2-6℃静置过夜，于10,000rpm离心20分钟，取上清进行超滤浓缩10-20 倍；继而加入2.0％海藻酸钠液，至终浓度为0.1％，搅拌至出现浑浊； 再加入2.0％CaCI2液，至终浓度为0.1％，搅拌均匀，4℃过夜10小时； 8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌，Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去病毒；冷冻干燥；即制得抗阪歧肠杆菌特 异性鸭IgY粗提物1,500g；
3.6.将以上IgY粗提物先后过离子交换树脂柱和凝胶层析柱层析，即制得抗阪 歧肠杆菌特异性鸭IgY纯品300克。
实施例4--用干粉混合法制备10,000g抗阪歧肠杆菌特异性IgY婴儿免疫奶粉
4.1.先按普通方法制备营养成份齐全含各种脱脂奶、维生素、氨基酸、双歧杆 菌等的优质普通婴幼儿奶粉9,990g，并经巴氏消毒；
4.2.将按本说明书所叙方法制得的抗阪歧肠杆菌特异性IgY干粉10g；
4.3.用等量放大匀化法将所制得的IgY干粉加入已制好的优质普通婴幼儿奶 粉中，要在干粉混和机中充分搅拌均匀；
4.4.在包装机上包装出厂；
4.5.生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。
实施例5--用液态混合法制备10,000g抗阪歧肠杆菌特异性IgY婴儿免疫奶粉
5.1.先按普通方法制备营养成份齐全含各种脱脂奶、维生素、氨基酸、双歧杆 菌等的优质普通婴幼儿奶水，并经巴氏消毒；
5.2.将按本说明书所叙方法制得的未经冷冻干燥的抗阪歧肠杆菌特异性IgY 浆料；
5.3.0.1％的比例将所制得的IgY抗阪歧肠杆菌特异性IgY浆料加入已制好的 优质普通婴幼儿奶水中，置入搅拌机充分搅拌均匀；
5.4.采用60-140℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响 其中IgY的抗体活性)。即制成含抗阪歧肠杆菌特异性IgY抗体的婴儿免 疫安全奶粉；
5.5.在包装机上包装出厂；
5.6.生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。
实施例6--用液态混合法制备10,000g抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY婴儿免疫 奶粉
6.1.先按普通方法制备营养成份齐全含各种脱脂奶、维生素、氨基酸、双歧杆 菌等的优质普通婴幼儿奶水，并经巴氏消毒；
6.2.将按前述方法制得的未经冷冻干燥的抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY浆料；
6.3.将0.1％的比例将所制得的IgY抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY浆料加入已 制好的优质普通婴幼儿液体奶中，置入搅拌机充分搅拌均匀；
6.4.采用60-140℃温度进行喷雾干燥(注意：干燥时间要尽量缩短，以免影响 其中IgY的抗体活性)。即制成含抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY抗体的婴 儿免疫安全奶粉；
6.5.在包装机上包装出厂；
6.6.生产环境必须符合无菌条件，并严格在无菌、无尘条件下进行。
将按以上实施例方法所制得的含抗阪歧肠杆菌特异性复合IgY抗体的婴 儿免疫安全奶粉给婴幼儿食用，不但可以抑制阪歧肠杆菌和沙门氏菌等致病 菌，杜绝这些致病菌的感染，特别有意义的是，还可预防和治疗婴幼儿轮状病 毒和大肠杆菌、沙门氏菌引起的腹泻。