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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711384052.3 (22)申请日 2017.12.20 (71)申请人 淮阴师范学院 地址 223311 江苏省淮安市淮阴区长江西 路111号 (72)发明人 潘正军 朱传坤 王辉 张芳 安然 常国亮 丁怀宇 吴楠 (74)专利代理机构 淮安市科文知识产权事务所 32223 代理人 张丽 (51)Int.Cl. A01K 61/10(2017.01) A01K 61/95(2017.01) C12Q 1/68(2018.01) (54)发明名称 一种乌苏里拟鲿遗传雄性。
2、逆转生理雌性鱼 育筛方法 (57)摘要 本发明公开了一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆 转为生理雌性鱼育筛方法， 包括鱼苗孵化、 试验 鱼苗选择、 卤虫孵化、 雌二醇溶液浸泡卤虫、 卤虫 作为激素载体饲喂鱼苗、 鱼种和成鱼的生理性别 观察、 遗传性别鉴定步骤。 通过优化的程序筛选 合适的饲喂起始时间、 浸泡卤虫的雌二醇浓度和 时间、 饲喂的持续处理时间， 将遗传雄性个体性 逆转为生理雌性个体， 使用雄性特异的分子标记 鉴定遗传雄性生理雌性个体， 将其分塘饲养， 按 照雄鱼性逆转人工雌核发育超雄鱼全雄 鱼的育种技术路线， 本发明为乌苏里拟鲿全雄鱼 育种在短期内提供大量高质的基础性材料。 权利要求书1页 说。
3、明书4页 附图1页 CN 107996468 A 2018.05.08 CN 107996468 A 1.一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育筛方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 亲鱼催产； （2） 鱼苗孵化； （3） 性激素诱导鱼苗性逆转 激素浸泡卤虫活饵： 将雌二醇用乙醇为溶剂配制成100毫克/毫升的母液， 4保存， 按 照150-250微克/升的剂量浸泡卤虫无节幼体1-1.5小时， 然后过滤并清洗卤虫； 活饵饲喂： 鱼苗开口时饲喂未处理活卤虫， 按照早、 中、 晚一日三次， 每次以半小时吃完 为准， 从开口后8-9天， 每天三次饲喂激素浸泡卤虫， 连续饲喂37-45天， 激素。
4、饲喂结束， 继续 饲喂未处理卤虫一段时间后， 逐渐改用商品饲料饲喂； （4） 遗传雄性逆转生理雌性鱼选筛 生理性别检查： 经活卤虫饲喂的鱼苗6个月即通过生殖突的有无、 生殖孔位置判定生理 性别， 并可计算性逆转率； 遗传性别鉴定： 取生理性别一致的雌性鱼若干并标记， 剪取尾鳍少许， 提取基因组DNA， 用雄性特异的引物进行PCR反应， 琼脂糖电泳， 紫外光检测并拍照， 根据雄性特异的扩增片 段有无判断其遗传性别， 将性逆转成功的个体分拣出来单独饲养作为育种材料。 2.根据权利要求1所述的一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育种方法， 其特征 在于： 所述引物的核苷酸序列为： 正向： 5 3 (。
5、GACAGCAGAACGGAANNNNNN) 反向： 5 3 (GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN)。 3.根据权利要求1所述的一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育种方法， 其特征 在于： 雌二醇为 型。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107996468 A 2 一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育筛方法 技术领域 0001 本发明涉及鱼类生物技术育种领域， 具体涉及一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转为生 理雌性鱼育筛方法。 背景技术 0002 在鱼类养殖生产实践中， 人们发现有多种鱼类在雌雄个体间存在形态、 生长速度、 性成熟体重等方面的雌雄二型性现象， 若进行单行养殖不仅。
6、可以获得规格整齐的商品鱼， 提高饲料的利用率， 增加养殖户的收入， 而且可以推进现代渔业产业化和形成具有自主知 识产权的新品种， 具有独特的优势与应用。 因此， 进行鱼类性别控制育种和单性养殖是水产 业发展的一个重要方向。 0003 鱼类性别控制育种最常用的做法是用性激素诱导遗传性别逆转的亲鱼， 与遗传性 别相同的另一性别的鱼交配以获得超雄或超雌鱼， 用超雄或超雌鱼与正常的雌鱼或雄鱼交 配即可获得全雄或全雌鱼苗， 达到单性养殖的目的。 这是因为鱼类性腺性别不仅受遗传因 子控制， 还容易受到内外环境影响， 特别是外源性激素的作用， 在个体发育早期使用激素处 理可以使得鱼苗的遗传性别与生理性别不一。
7、致， 产生性别逆转现象。 乌苏里拟鲿就具有典 型的体型、 生长性别二型性现象。 在相同的生长周期内， 雄鱼生长速度快于雌鱼， 成鱼雄性 体重可达雌性二倍甚至更多。 若能进行全雄单性养殖， 将会大幅提升产量， 提高饲料的转化 系数， 降低养殖成本， 大幅提高其养殖的社会和经济效益。 按照雄鱼性逆转人工雌核发育 超雄鱼全雄鱼的技术路线， 获得遗传雄性而生理雌性鱼是育种成功的关键一环。 但不 同的鱼类其遗传物质组成不同、 性别决定机制不同、 性腺发育时序与进程不同， 在一种鱼类 激素诱导性逆转成功的方法与步骤不能直接应用于另一种鱼类， 必须进行重新开发。 0004 目前性激素诱导鱼苗性逆转主要有以下。
8、三种方法：（1） 激素溶液直接浸泡。 将鱼苗 直接在一定浓度的激素溶液中浸泡一段时间后取出， 持续到性腺发育形成。 浸泡法对于乌 苏里拟鲿这种无鳞鱼来说存在相当大的风险， 处理时间长、 对鱼苗刺激大、 幼鱼体质差、 对 鱼苗造成损害影响其存活。（2） 饲料拌喂。 将激素直接拌入商品鱼饲料中， 投喂给鱼苗食用。 乌苏里拟鲿属于杂食性， 早期以浮游生物为饵料， 商品饲料适口性差、 繁殖季节水温高易使 水体浑浊、 生长杂菌影响鱼苗健康、 激素污染水体， 鱼苗存活率低。（3） 活饵料浸泡饲喂。 卤 虫无节幼体是鱼虾幼苗的优质饵料， 营养丰富且全面， 是乌苏里拟鲿仔鱼的优秀适口饵料。 在激素浸泡过程中，。
9、 通过呼吸和吞咽使激素进入虫体内， 过滤清洗后虫体体表激素残留量 极少、 不会污染水体， 鱼苗受刺激小、 存活率高。 但因为鱼苗个体娇嫩， 什么时间开始处理， 处理时激素的浓度如何选择， 处理的持续时间多长效果最好， 稍一不慎就将引起鱼苗的大 量死亡， 使得育种工作失败。 0005 再有性激素诱导鱼苗性逆转是否成功， 需要测交进行确定性验证， 一般需要耗费 4-5年时间， 难以在短期内获得大量育种材料。 发明内容 说 明 书 1/4 页 3 CN 107996468 A 3 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转为生理雌性鱼育 筛方法， 性逆转率达95%以上， 6个月。
10、存活率达60%左右， 激素诱导性逆转结合雄性特异的分 子标记鉴定遗传性别， 可在试验当年短期内获得大量育种材料。 0007 本发明通过以下技术方案实现： 一种乌苏里拟鲿遗传雄性逆转生理雌性鱼育筛方法， 包括以下步骤： （1） 亲鱼催产； （2） 鱼苗孵化； （3） 性激素诱导鱼苗性逆转 激素浸泡卤虫活饵： 将雌二醇用乙醇为溶剂配制成100毫克/毫升的母液， 4保存， 按 照150-250微克/升的剂量浸泡卤虫无节幼体1-1.5小时， 然后过滤并清洗卤虫； 活饵饲喂： 鱼苗开口时饲喂未处理活卤虫， 按照早、 中、 晚一日三次， 每次以半小时吃完 为准， 从开口后8-9天， 每天三次饲喂激素浸泡卤。
11、虫， 连续饲喂37-45天， 激素饲喂结束， 继续 饲喂未处理卤虫一段时间后， 逐渐改用商品饲料饲喂； （4） 遗传雄性逆转生理雌性鱼选筛 生理性别检查： 经活卤虫饲喂的鱼苗6个月即通过生殖突的有无、 生殖孔位置判定生理 性别， 并可计算性逆转率； 遗传性别鉴定： 取生理性别一致的雌性鱼若干并标记， 剪取尾鳍少许， 提取基因组DNA， 用雄性特异的引物进行PCR反应， 琼脂糖电泳， 紫外光检测并拍照， 根据雄性特异的扩增片 段有无判断其遗传性别， 将性逆转成功的个体分拣出来单独饲养作为育种材料。 0008 本发明进一步改进方案是， 所述引物的核苷酸序列为： 正向： 5 3 (GACAGCAGA。
12、ACGGAANNNNNN) 反向： 5 3 (GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN)。 0009 本发明进一步改进方案是， 雌二醇为 型。 0010 本发明与现有技术相比， 具有以下明显优点： 一、 激素诱导性逆转结合雄性特异的分子标记鉴定遗传性别有以下优势：（1） 准确鉴定 性逆转鱼的遗传性别， 不需要测交即可确定性逆转是否成功。（2） 在试验当年可将性逆转鱼 检出分塘饲养， 这一步可节省育种时间3-4年。（3） 获得性逆转鱼成功率高， 短期内即可获得 大量育种材料。 0011 二、 本发明使用雌二醇作为诱导剂， 与黄颡鱼诱导法 （ZL 200610166518.8） 相比有 以下优。
13、点：（1） 乙炔基雌二醇为人工合成药， 应用于鱼类安全性未知。（2） 乙炔基雌二醇对下 丘脑有正、 负反馈作用。 小剂量使用可刺激促性腺激素分泌； 大剂量使用抑制其分泌， 连续 使用可致腺垂体促性腺激素释放激素受体下调， 减少性激素分泌， 抑制性腺发育。 在实际应 用中要精确把握使用剂量， 生产中不易掌握。（3） 雌二醇为卵巢分泌的自然雌激素， 能增进 和调节雌性性器官及副性征的正常发育。（4） 市售商品雌二醇为 、 型混合物， 其中 型生理 作用强， 还有抗雄激素作用， 性逆转成功率高。（5） 雌二醇使用剂量范围广， 便于生产上应 用。 0012 三、 本发明在鱼苗开口后8-9天开始饲喂激素。
14、浸泡卤虫活饵， 选择时机恰当， 鱼苗 体健， 对药物耐受性好， 可定向诱导性腺向卵巢发育， 性逆转率、 6个月存活率均达到显著提 高。 说 明 书 2/4 页 4 CN 107996468 A 4 附图说明 0013 图1为本发明流程图。 具体实施方式 0014 下面结合附图1详述本发明乌苏里拟鲿遗传雄性逆转为生理雌性鱼育筛方法， 具 体按以下步骤实施： 1、 亲鱼选择与催产： 挑选性腺发育良好、 健康皮肤无损伤的亲鱼， 雌性亲鱼分两次注射 人绒毛膜促性腺激素与促黄体激素释放激素混合物 （2000 IU/kg HCG, 20 g/kg LHRH- A） ， 雄性亲鱼剂量减半且只注射一次。 00。
15、15 2、 人工授精： 效应时间出现时， 将鱼卵挤入塑料盆中， 同时解剖雄鱼取精巢加入少 许生理盐水研磨， 采取半干法人工授精。 0016 3、 受精卵孵化： 受精卵铺设于备好的尼龙网上， 把尼龙网悬挂于充气的孵化池中， 保持孵化池水有一定的流动性， 每天三次观察孵化情况。 0017 4、 鱼苗选择： 鱼苗孵出后， 选择形态正常并活泼游泳的鱼苗放入标记好的试验水 池， 保持充气良好。 0018 5、 卤虫孵化与处理： 按照卤虫孵化条件进行虫卵的孵化， 去除卵壳， 收集无节幼体 供鱼苗开口后食用。 配制雌二醇母液100毫克/毫升的母液， 按照150-250微克/升的剂量浸 泡卤虫无节幼体1-1.。
16、5小时， 然后过滤并清洗卤虫。 0019 6、 鱼苗激素饲喂： 鱼苗开口时饲喂未处理活卤虫， 按照早、 中、 晚一日三次， 每次以 半小时吃完为准， 从鱼苗开口后8-9天开始饲喂激素浸泡的卤虫， 连续饲喂37-45天， 结束激 素处理， 继续用卤虫饲喂一段时间， 逐步改用商品饲料饲喂以节约成本。 0020 7、 生理性别检查： 试验鱼饲养6个月即通过生殖突的有无、 生殖孔位置判定其生理 性别， 并可计算性逆转率。 0021 8、 遗传性别鉴定： 对需要进行遗传性别鉴定的生理性别一致的个体进行标记并尾 鳍取样， 按照标准方法提取基因组DNA， DNA浓度稀释为50-100ng/ l； 用性别特异。
17、性标记引 物进行聚合酶链式反应 （PCR） ， 即以基因组DNA为模板， 采用PCR引物扩增遗传性别特异的 DNA片段 ， PCR体系25l ， 待测个体DNA模板1l、 雌雄特异的正向 引物53 (GACAGCAGAACGGAANNNNNN)1 l、 反向引物5 3 (GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN) 1 l、 PCR Mix 12 l、 ddH2O 10 l； PCR反应条件： 94 30S预变性， 94 30S， 55-59 30S， 72 30S， 共 30-35个循环， 72 延伸6min. PCR产物4保存； 琼脂糖凝胶电泳， 即配制1-2%的琼脂糖凝 胶， 上样时取。
18、DNA Marker 5 l， 取每个待测样品5 l PCR产物电泳检测， 电泳条件： 电压120- 180V， 电流300-600mA， 时间15-20min； 紫外光检测并拍照， 即电泳结束后将琼脂糖凝胶经溴 化乙锭染色后放入凝胶分析仪， 设置好适当的参数后曝光拍照； 遗传性别判定， 即对照片进 行解读， 如果在相应的泳道上只出现一条300bp条带， 则该个体为遗传上XX雌性， 如果在相 应的泳道上出现一条300bp条带和一条471bp条带， 则该个体为遗传上XY雄性。 确定每一条 鱼的遗传性别， 把遗传雄性而生理雌性的个体拣出， 饲养于单独的池塘， 即可供作单性育种 的材料。 0022 分组试验苏里拟鲿性性激素诱导鱼苗性逆转状况， 实施例试验条件及试验结果见 说 明 书 3/4 页 5 CN 107996468 A 5 下表。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107996468 A 6 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 107996468 A 7 。