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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711462427.3 (22)申请日 2017.12.28 (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 王神云 戴忠良 李建斌 王红 于利 余方伟 唐君 秦文斌 山溪 (74)专利代理机构 南京申云知识产权代理事务 所(普通合伙) 32274 代理人 王云 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚 胎率发生的方法 (57)摘要 本发明公开。
2、了一种提高结球甘蓝低出胚基 因型小孢子胚胎发生率的方法,将芥菜、 小白菜 无菌花药与结球甘蓝小孢子混合悬浮液共同培 养,培养得到的胚状体在初期即可确定是结球甘 蓝的胚状体,因为结球甘蓝小孢子是游离状态 的,而芥菜、 小白菜小孢子在花药中,因此在再生 植株移栽时不需要对小孢子植株群体的芥菜、 小 白菜植株进行区别鉴定,从而减少了工作量,从 而提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子出胚效率。 权利要求书3页 说明书9页 CN 108157177 A 2018.06.15 CN 108157177 A 1.一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法， 其特征在于主要包括以 下步骤: (1)选取结球甘。
3、蓝、 芥菜、 小白菜处于单核晚期至双核早期阶段的干净无污染花蕾,将 花蕾保湿置于4处理1-3d备用； 花蕾灭菌消毒用体积比75%酒精消毒60s， 质量比8%的次氯 酸钠溶液表面消毒20min,无菌水冲洗5次； (2)将20-25个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入15-20ml pH6.0 NLN-13液体培 养基,采用挤压法游离小孢子,然后用450目尼龙网过滤,将滤液收集于离心管,1000r.min-1 离心5min,弃上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0 NLN-13液体培养基,调整小孢子密度 为1.51052105个ml-1,并加入100l的活性炭混合液,分装到15-20个直径为6。
4、0mm的塑 料或玻璃无菌培养皿中,每培养皿3-4ml; (3)剥取无菌芥菜、 小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤(2)中的培养皿中,芥菜、 小 白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为3:3:15:5:1,加盖后封口; (4)将步骤(3)中得到的加盖封口的培养皿置于32.5恒温培养箱热激处理24h,再转 移到25条件下静置黑暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现后,置于摇床70-80rpm、 25 黑暗培养胚状体发育到成熟的子叶型胚状体； (5)无菌条件下,将步骤(4)中得到的成熟的子叶型胚状体转接至胚状体分化培养基 B5培养基中,18 h.d-1、 5000Lx， 241条件下培养18-20天至形成愈。
5、伤组织或直至分化出 芽， 再按大小将愈伤组织切成3-5块置于生根培养基中生根培养形成再生植株, 生根培养 的条件为25、 5000Lx、 16h.d-1; (6)步骤(5)中得到的再生株长到含4-5片叶的健壮苗时,在培养室内开瓶炼苗,驯化移 栽到装有灭菌基质的营养钵中,于25下12h光照和12h黑暗交替静值培养,1周后营养钵放 置外界阴凉处,逐步炼苗,3周后将其移栽到大田,获得植株； 经倍性鉴定后,获得的纯合双 单倍体再生植株用于育种。 2.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 所述结球甘蓝的花瓣和花药长度比为0.5-1.0， 芥菜的花瓣和花药长度比。
6、为0.4-0.8， 小白菜的花瓣和花药长度比为0.6-0.9。 3.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 在步骤 （1） 前分别进行周年采集结球甘蓝、 芥菜、 小白菜花蕾供小孢子培养。 4.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 所述NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、 蔗糖125-130g， 0.05 mg 6-BA,15 mg AgNO3和0.05 mg 2,4-D； pH为5.8-6.2。 5.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 所述活性炭混。
7、合液的组成为:NLN液体培养基1L、 琼脂糖6-10g、 活性炭4-6g。 6.根据权利要求4或5所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其 特征是， NLN液体培养基,以1L计,组成为: KNO3 125mg, Ca(NO3)24H2O 500mg, MgSO47H2O 125mg, kH2PO4, 125mg, 权 利 要 求 书 1/3 页 2 CN 108157177 A 2 H3BO3 6.2mg, MnSO4H2O 18.95mg, ZnSO47H2O 8.6mg, Na2MoO42H2O 0.25mg, CuSO45H2O 0.025mg, CoCL26H2O 0.。
8、025mg, 维生素B1 0.5mg, 维生素B6 1.0mg, 生物素 0.05mg, 叶酸 0.5mg, Na2EDTA 37.3mg, FeSO47H2O 27.8mg, 肌醇 100mg, 甘氨酸 2mg, 烟酸 5mg, L-谷氨酞胺 800mg, 谷肤甘肽 30mg, 维生素B5 5mg, 丝氨酸 100mg， 和余量的无菌水, pH5.9-6.1。 7.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 所述胚状体分化培养基组成为:B5培养基1L、 蔗糖35-40g、 琼脂8-11g, 6-BA 0.2mg， 活性炭2-4g， pH为5.8-6.1。。
9、 8.根据权利要求7所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， B5培养基,以1L计,组成为: NaH2PO42H2O 169.5mg, KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg, MgSO47H2O 500mg, MnSO44H2O 10mg, H3BO3 3mg, ZnSO47H2O 2mg, KI 0.75mg, Na2MoO42H2O 0.25mg, CuSO45H2O 0.025mg, CoCl26H2O 0.025mg, Na2-EDTA 37.3mg, FeSO47H2O 27.8mg, 权 利 要 求 书 2/3 页 3 CN 10815。
10、7177 A 3 CaCl22H2O 150mg, VB1 10mg, VB6 1mg, VPP 1mg, 肌醇 100mg 和余量的蒸馏水。 9.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， 所述生根培养基组成为:1/2MS培养基1L、 蔗糖2530g、 琼脂10-12g、 0.150.25mg NAA、 0.150.25mg IBA、 活性炭2-4g ， pH为5.8-6.1。 10.根据权利要求9所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特 征是， MS培养基,以1L计,组成为: NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, C。
11、aCl22H2O 440mg, KH2PO4 170mg, MgSO47H2O 370mg, FeSO47H2O 27.8mg, Na2EDTA 37.3mg, H3BO3 6.2mg, MnSO4H2O 16.9mg, ZnSO47H2O 8.6mg, Na2MoO42H2O 0.25mg, CuSO45H2O 0.025mg, CoCl26H2O 0.025mg, KI 0.83mg, 肌醇 100mg, 甘氨酸 2mg, 烟酸 0.5mg, 维生素B1 0.1mg, 维生素B6 0.5mg 和余量的无菌水。 权 利 要 求 书 3/3 页 4 CN 108157177 A 4 一种提高结。
12、球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎率发生的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养技术领域,尤其涉及一种提高结球甘蓝低出胚基因型小 孢子胚胎发生率的培养方法。 背景技术 0002 结球甘蓝(Brassica oleacea L.var.cap itata L.)是十字花科芸薹属植物的一 个变种， 起源于地中海沿岸， 16世纪开始传入中国。 结球甘蓝具有抗病、 适应性强、 易贮耐 运、 产量高、 品质好等特点， 由于其适应性广及抗逆性强， 稳产， 又耐贮运， 因此在我国栽培 发展很快， 目前每年种植面积已达300万hm2以上， 在蔬菜周年供应及出口贸易中都占有重 要地位。 0003 目前,我国。
13、生产所用的结球甘蓝种子主要靠进口,价格昂贵。 选育具有自主知识产 权的结球甘蓝品种,是急待解决的问题。 结球甘蓝属于绿体春化型植物,两年才能完成一个 生活周期,加代繁殖十分困难。 从一个杂合基因型材料起步,培育一个可用于商业制种的杂 交种亲本自交系,至少需要6-8年时间。 结球甘蓝最适宜采用单倍体育种途径加快新品种选 育进程,游离小孢子培养是十字花科芸薹属作物近年来被开发的一条单倍体育种的有效途 径。 0004 Lichter(1982)在甘蓝油菜上首创的单细胞培养技术,目前已经应用于多种甘蓝 类植物的单倍体育种。 Lichter(1989)和Takahata et.al(1990)在结球甘蓝。
14、和花椰菜的游 离小孢子培养研究中获得了再生植株。 冯辉(2007)等利用自己构建的结球甘蓝游离小孢子 培养体系,首次获得了结球甘蓝双单倍体植株。 目前,该技术在结球甘蓝上的应用还不够成 熟,受基因型等很多因素的影响较大,许多品种难以获得胚状体及再生植株,限制了该项技 术在育种实践中应用的步伐。 发明内容 0005 为了克服现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种提高结球甘蓝低出胚基因 型小孢子胚胎发生率的方法,采用结球甘蓝低出胚基因型游离小孢子与易出胚的芥菜、 小 白菜花药共培养,获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数较对照大幅度提高,且 胚状体的质量也得到很大改善,从而提高结球甘蓝低出。
15、胚基因型小孢子出胚效率。 0006 本发明提供了一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法， 主要包 括以下步骤: 0007 (1)选取结球甘蓝、 芥菜、 小白菜处于单核晚期至双核早期阶段的干净无污染花 蕾,将花蕾保湿置于4处理1-3d备用； 花蕾灭菌消毒用体积比75酒精消毒60s， 质量比 8的次氯酸钠溶液表面消毒20min,无菌水冲洗5次； 0008 (2)将20-25个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入15-20ml pH6.0NLN-13液 体培养基 ,采用挤压法游离小孢子 ,然后用450目尼龙网过滤 ,将滤液收集于离心管 , 1000r.min-1离心5min,弃上清液后得。
16、到沉淀,然后依次加入pH6.0NLN-13液体培养基,调整 说 明 书 1/9 页 5 CN 108157177 A 5 小孢子密度为1.51052105个ml-1,并加入100 l的活性炭混合液,分装到15-20个直径 为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中,每培养皿3-4ml； 0009 (3)剥取无菌芥菜、 小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤(2)中的培养皿中,芥 菜、 小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为3:3:15:5:1,加盖后封口； 0010 (4)将步骤(3)中得到的加盖封口的培养皿置于32.5恒温培养箱热激处理24h, 再转移到25条件下静置黑暗培养15-20天至肉眼可见胚状体出现后。
17、,置于摇床70-80rpm、 25黑暗培养胚状体发育到成熟的子叶型胚状体； 0011 (5)无菌条件下,将步骤(4)中得到的成熟的子叶型胚状体转接至胚状体分化培养 基B5培养基中,18h.d-1、 5000Lx， 241条件下培养18-20天至形成愈伤组织或直至分化出 芽， 再按大小将愈伤组织切成3-5块置于生根培养基中生根培养形成再生植株,生根培养的 条件为25、 5000Lx、 16h.d-1； 0012 (6)步骤(5)中得到的再生株长到含4-5片叶的健壮苗时,在培养室内开瓶炼苗,驯 化移栽到装有灭菌基质的营养钵中,于25下12h光照和12h黑暗交替静值培养,1周后营养 钵放置外界阴凉处。
18、,逐步炼苗,3周后将其移栽到大田,获得植株； 经倍性鉴定后,获得的纯 合双单倍体再生植株用于育种。 0013 进一步地， 所述结球甘蓝的花瓣和花药长度比为0.5-1.0， 芥菜的花瓣和花药长度 比为0.4-0.8， 小白菜的花瓣和花药长度比为0.6-0.9。 0014 进一步地， 所述NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、 蔗糖125-130g， 0.05mg 6-BA,15mg AgNO3和0.05mg 2,4-D。 pH为5.8-6.2。 0015 进一步地， 所述活性炭混合液的组成为:NLN液体培养基1L、 琼脂糖6-10g、 活性炭 4-6g。 0016 本发明中， 所述。
19、NLN液体培养基,以1L计,组成为:KNO3125mg ,Ca(NO3)24H2O 500mg,MgSO47H2O 125mg,kH2PO4,125mg,H3BO36.2mg,MnSO4H2O 18.95mg,ZnSO47H2O 8.6mg,Na2MoO42H2O 0.25mg,CuSO45H2O 0.025mg,CoCL26H2O 0.025mg,维生素B1 0.5mg,维生素B60.5mg,生物素0.05mg,叶酸0.5mg,Na2EDTA 37.3mg,FeSO47H2O 27.8mg, 肌醇100mg,甘氨酸2mg,烟酸5mg,L-谷氨酞胺800mg,谷肤甘肽30mg,维生素B5 5m。
20、g,丝氨酸 100mg和余量的无菌水,pH5.9-6.1。 0017 进一步地， 所述胚状体分化培养基组成为:B5培养基1L、 蔗糖35-40g、 琼脂8-11g, 6-BA 0.2mg， 活性炭2-4g， pH为5.8-6.1,高温高压灭菌； 其中， 0018 B5培养基 ,以1L计 ,组成为:NaH2PO42H2O 169 .5mg ,KNO3 2500mg ,(NH4) 2SO4134mg,MgSO47H2O 500mg,MnSO44H2O 10mg,H3BO3 3mg,ZnSO47H2O 2mg,KI 0.75mg,Na2MoO42H2O 0.25mg,CuSO45H2O 0.025m。
21、g,CoCl26H2O 0.025mg,Na2-EDTA 37.3mg,FeSO47H2O、 27.8mg,CaCl22H2O 150mg,VB1 10mg,VB6 1mg,VPP 1mg,肌醇100mg 和余量的蒸馏水。 0019 进一步地， 所述生根培养基组成为:所述生根培养基组成为:1/2MS培养基1L、 蔗糖 2530g、 琼脂10-12g、 0.150.25mg NAA、 0.150.25mg IBA、 活性炭2-4g， pH为5.8-6.1。 其中， 0020 MS培养基,以1L计,组成为:NH4HO3 1650mg,KNO3 1900mg,CaCl22H2O 440mg, KH2。
22、PO4 170mg,MgSO47H2O 370mg,FeSO47H2O 27.8mg,Na2EDTA 37.3mg,H3BO3 6.2mg, 说 明 书 2/9 页 6 CN 108157177 A 6 MnSO4H2O 16.9mg,ZnSO47H2O 8.6mg,Na2MoO42H2O 0.25mg,CuSO45H2O 0.025mg, CoCl26H2O 0.025mg,KI 0.83mg,肌醇100mg,甘氨酸2mg,烟酸0.5mg,维生素B1 0.1mg,维 生素B6 0.5mg和余量的无菌水。 0021 本发明将芥菜、 小白菜无菌花药与结球甘蓝小孢子混合悬浮液共同培养,获得的 结球。
23、甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数较对照大幅度提高,且胚状体的质量也得到很大 改善,解决了结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率低的问题,提高了小孢子培养技术 的利用效率。 0022 有益效果:与现有技术相比， 本发明的优点在于： 0023 (1)本发明采用结球甘蓝低出胚基因型游离小孢子与易出胚的芥菜、 小白菜花药 按一定数目比例共培养,获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数最高达18个/蕾, 而对照1结球甘蓝出胚率最高仅为1.5个/蕾； 而对照2结球甘蓝+芥菜出胚率最高仅为4.5 个/蕾； 而对照3结球甘蓝+小白菜出胚率最高仅为5.5个/蕾,且胚状体的质量也得到很大改 善,解决了结球甘蓝低出。
24、胚基因型小孢子胚胎发生率低的问题,提高了小孢子培养技术的 利用效率。 0024 (2)经植株形态鉴定及气孔保卫细胞叶绿体数目观察发现,在相同的条件下混合 培养最后得到30株结球甘蓝再生植株,而对照1结球甘蓝单独培养的株数为4株； 对照2结球 甘蓝+芥菜混合培养的株数为8株； 对照3结球甘蓝+小白菜混合培养的株数为10株， 差异显 著。 0025 (3)所采用的方法简便易行,培养得到的小孢子再生植株群体为结球甘蓝,不需要 对植株类型进行鉴定,从而减少了工作量,提高了培养效率,具有可操作性。 具体实施方式 0026 下面通过具体实施例来进一步阐述本发明。 0027 本发明中所采用的原料均为市售产品。
25、。 0028 实施例1 0029 (1)培养基配制:包括小孢子不同培养阶段的培养基,其组分与各组分在每升培养 基中所含的重量为: 0030 所述NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、 蔗糖125g,0.05mg 6-BA,15mg AgNO3和0.05mg 2,4-D。 pH为6.0。 0031 所述活性炭混合液的组成为:NLN液体培养基1L、 琼脂糖8g、 活性炭4g， 121， 0.1MPa， 12h高温高压灭菌而成。 0032 上述NLN液体培养基,以1L计,组成为: 说 明 书 3/9 页 7 CN 108157177 A 7 0033 0034 0035 和余量的无菌水。
26、。 0036 所述胚状体分化培养基组成为B5培养基1L、 蔗糖40g、 琼脂10g,6-BA 0.2mg， 活性 炭4g， pH为6.0,121， 0.1MPa， 12h高温高压灭菌而成； 0037 B5培养基,以1L计,组成为: 说 明 书 4/9 页 8 CN 108157177 A 8 0038 0039 0040 和余量的蒸馏水。 0041 所述生根培养基组成为:1/2MS培养基1L、 蔗糖30g、 琼脂12g、 0.25mg NAA、 0.25mg IBA、 活性炭4g,pH为6.0。 其中， 0042 MS培养基,以1L计,组成为: 说 明 书 5/9 页 9 CN 1081571。
27、77 A 9 0043 0044 0045 和余量的无菌水。 0046 (2)周年采集结球甘蓝、 芥菜、 小白菜花蕾供小孢子培养， 具体的步骤如下： 0047 1.结球甘蓝室内春化： 0048 1.1种子处理： 0049 将结球甘蓝种子于38-40下浸泡55-65min后表面盖湿布， 放入光照培养箱中20 、 培育2428h， 待种子萌出0.4-0.6mm长的白色根尖时， 切断根尖； 0050 1.2室内培养： 0051 播种， 在所述穴盘内填满营养土并压实， 每穴播一粒处理后的种子， 表面覆土， 浇 足水； 0052 1.3春化管理： 0053 齐苗后控制水分， 待小苗长至2叶1心时， 每隔。
28、2-3天以同力施碧王水溶性肥料(同 力施碧王水溶性肥料的有效成分为： 腐殖酸30g/l； N+P2O5+K2O200g/l； 水溶性氮N 80g/l； 水溶性磷P2O5140g/l； 水溶性钾K2O140g/l。 )1000倍液喷施幼苗一次； 待苗具有 5-6片叶时， 同力施碧王水溶性肥料800倍液再喷施一次， 待苗长至10-12片叶,根茎粗1.5- 说 明 书 6/9 页 10 CN 108157177 A 10 2cm时， 将苗挖出， 放入清水池中浸泡， 心叶淹没， 9-10h后取出， 放入预先准备好的营养钵 (蔬菜专用营养土， 采用上海仁九园艺有限公司销售的丹麦品氏托普泥炭土)栽培， 白。
29、天 12h， 5000LX， 20-25， 缓苗10-15天后， 待植株完全活棵后浇灌同力施碧王水溶性肥料500 倍液， 每隔15天浇灌1次， 一直到植株心叶莲座前， 均可放入光照培养箱， 3-5， 5000LX， 处 理15-20天， 促其植株完成春化， 抽薹开花。 0054 2.芥菜、 小白菜室内春化： 0055 2.1种子处理： 0056 将芥菜、 小白菜种子于38-40下浸泡55-65min后表面盖湿布， 放入光照培养箱中 20、 培育2428h， 5000LX， 待种子萌出0.4-0.6mm长的白色根尖时， 切断根尖， 放入培养 皿， 再放入光照培养箱中2-4、 5000LX培育12。
30、15天， 等长出心叶， 完成低温春化； 0057 2.2抽薹开花： 0058 低温春化后的小苗植入预先准备好的营养钵(蔬菜专用营养土)室内栽培， 20-25 ， 12h,5000LX待幼苗完全活棵后浇灌同力施碧王水溶性肥料500倍， 每隔15天浇灌1次， 直 至植株抽薹开花。 0059 3.结球甘蓝较芥菜、 小白菜花期调节： 0060 结球甘蓝较芥菜、 小白菜早播35天， 隔7天再播一期， 芥菜、 小白菜隔5天播一期， 播 三期， 以调节开花期； 可按上述播种时间及室内春化、 抽薹开花的处理方法进行周年播种， 供小孢子培养， 且室内污染小， 易控制， 操作简便， 效率高。 同时结球甘蓝、 芥菜。
31、、 小白菜花蕾 的适期同时采集创造良好条件， 为连续周年小孢子培， 创制新材料提供新的栽培方法， 较自 然条件下结球甘蓝、 芥菜、 小白菜一年一次大大缩短了培育周期。 0061 所述将结球甘蓝苗挖出， 放入清水池中浸泡， 心叶淹没， 9-10h后取出， 放入预先准 备好的营养钵(蔬菜专用营养土)栽培， 白天12h， 5000LX， 20-25， 缓苗10-15天后， 待植株 完全活棵后浇灌同力施碧王水溶性肥料500倍， 此方法灵活使用， 可有效调节植株过量生 长， 缓苗时间拉长， 为结球甘蓝、 芥菜、 小白菜同一时间完成春化， 结球甘蓝、 芥菜、 小白菜， 同时也可通过摘心调节花期， 多措并举。
32、， 调节花期， 尽力满足小孢子采集的标准。 0062 所述结球甘蓝、 芥菜、 小白菜切断根尖是在工作台上用刀片快速切断0.4-0.6mm长 的根尖。 所述营养土是蔬菜育苗专用营养土。 所述营养液是腐殖酸的100倍液。 0063 (3)提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法， 具体步骤如下： 0064 花蕾选取:采用步骤(2)周年采集结球甘蓝、 芥菜、 小白菜花蕾供小孢子培养中 得到的花蕾， 取花序上花瓣和花药长度比为0.8的结球甘蓝、 花瓣和花药长度比为0.6的芥 菜、 花瓣和花药长度比为0.7的小白菜处于单核晚期至双核早期、 健康、 无病虫害的花蕾,分 别放入无菌培养皿中,用体积比7。
33、5酒精消毒60s， 质量比8的次氯酸钠溶液表面消毒 20min,再在超净工作台上用无菌水荡洗5次,备用； 0065 将40个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入20ml pH6.0NLN-13液体培养 基,采用挤压法游离小孢子,然后用450目尼龙网过滤,将滤液收集于离心管,1000r.min-1离 心5min,弃上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0NLN-13液体培养基60ml,调整小孢子密 度为2105个ml-1,并加入100 l的活性炭混合液,分装到20个直径为60mm的塑料或玻璃无 菌培养皿中,每培养皿4ml； 0066 无菌条件下,剥取无菌芥菜、 小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤。
34、得到的培 说 明 书 7/9 页 11 CN 108157177 A 11 养皿中,每培养皿分别放6个芥菜、 小白菜花蕾的完整花药(芥菜、 小白菜花蕾与结球甘蓝花 蕾数量比为3:3:1)， ,加盖后用parafilm膜封口； 0067 将步骤中得到的加盖封口的培养皿置于32.5恒温培养箱热激处理24h,再 转移到25条件下静置黑暗培养20天至肉眼可见胚状体出现后,置于摇床80rpm振荡、 25 黑暗培养10天至胚状体发育到成熟的子叶型胚状体。 0068 无菌条件下,将得到的成熟的子叶型胚状体转接至胚状体分化培养基B5培养基 中,18h.d-1、 5000Lx， 25条件下培养20天至形成愈伤组。
35、织， 再按大小将愈伤组织切成5块置 于生根培养基中生根培养形成再生植株,生根培养的条件为25、 5000Lx、 16h.d-1； 0069 步骤中得到的再生株长到含4-5片叶的健壮苗时,在培养室内开瓶炼苗,驯化 移栽到装有灭菌基质的营养钵中,于25下12h光照和12h黑暗交替静值培养,1周后营养钵 放置外界阴凉处,逐步炼苗,3周后将其移栽到大田,获得植株。 经倍性鉴定后,获得的纯合 双单倍体再生植株用于育种。 0070 根据植株的形态特点,采用田间观察的方法区分结球甘蓝植株和芥菜、 小白菜 植株取再生植株的嫩叶,观察气孔保卫细胞叶绿体数目,检测各植株倍性。 0071 除了步骤中仅取结球甘蓝生长。
36、健康、 无病虫害的花序作为小孢子培养的供体 植株之外,其它操作同 “(3)提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法” ,作为对 照1结球甘蓝； 对照2结球甘蓝+芥菜； 对照3结球甘蓝+小白菜。 0072 结果如下: 0073 第一， 本发明采用结球甘蓝低出胚基因型游离小孢子与易出胚的芥菜、 小白菜花 药按一定数目比例共培养,获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数最高达18个/ 蕾,而对照1结球甘蓝出胚率最高仅为1.5个/蕾； 而对照2结球甘蓝+芥菜出胚率最高仅为 4.5个/蕾； 而对照3结球甘蓝+小白菜出胚率最高仅为5.5个/蕾,且胚状体的质量也得到很 大改善,解决了结球甘蓝低出胚基。
37、因型小孢子胚胎发生率低的问题,提高了小孢子培养技 术的利用效率。 0074 第二， 经植株形态鉴定及气孔保卫细胞叶绿体数目观察发现,在相同的条件下混 合培养最后得到30株结球甘蓝再生植株,而对照1结球甘蓝单独培养的株数为4株； 对照2结 球甘蓝+芥菜混合培养的株数为8株； 对照3结球甘蓝+小白菜混合培养的株数为10株， 差异 显著。 0075 实施例2： 与实施例1基本相同， 所不同的是： 0076 NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、 蔗糖130g， 0.05mg 6-BA,15mg AgNO3和0.05mg 2,4-D； pH为5.8。 0077 活性炭混合液的组成为:NL。
38、N液体培养基1L、 琼脂糖6g、 活性炭6g。 0078 胚状体分化培养基组成为:B5培养基1L、 蔗糖35g、 琼脂8g,6-BA 0.2mg， 活性炭2g， pH为5.8。 0079 所述生根培养基组成为:1/2MS培养基1L、 蔗糖25g、 琼脂10g、 0.15mg NAA、 0.15mg IBA、 活性炭2g， pH为5.8。 0080 提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法中的步骤中， 取花序上花 瓣和花药长度比为0.5的结球甘蓝、 花瓣和花药长度比为0.4的芥菜、 花瓣和花药长度比为 0.6的小白菜处于单核晚期至双核早期、 健康、 无病虫害的花蕾,作为小孢子培养的供体， 。
39、芥 说 明 书 8/9 页 12 CN 108157177 A 12 菜、 小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为4:4:1共培养,结果如下： 0081 第一， 获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数最高达20个/蕾,而对照1 结球甘蓝出胚率最高仅为2.1个/蕾； 而对照2结球甘蓝+芥菜出胚率最高仅为5.5个/蕾； 而 对照3结球甘蓝+小白菜出胚率最高仅为6.5个/蕾,且胚状体的质量也得到很大改善,解决 了结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率低的问题,提高了小孢子培养技术的利用效 率。 0082 第二， 经植株形态鉴定及气孔保卫细胞叶绿体数目观察发现,在相同的条件下混 合培养最后得到40株结球甘。
40、蓝再生植株,而对照1结球甘蓝单独培养的株数为5株； 对照2结 球甘蓝+芥菜混合培养的株数为10株； 对照3结球甘蓝+小白菜混合培养的株数为11株， 差异 显著。 0083 实施例3： 与实施例1基本相同， 所不同的是： 0084 NLN-13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、 蔗糖128g， 0.05mg 6-BA,15mg AgNO3和0.05mg 2,4-D； pH为6.2。 0085 活性炭混合液的组成为:NLN液体培养基1L、 琼脂糖10g、 活性炭5g。 0086 胚状体分化培养基组成为:B5培养基1L、 蔗糖38g、 琼脂11g,6-BA 0.2mg， 活性炭 3g， pH为。
41、6.1。 0087 所述生根培养基组成为:1/2MS培养基1L、 蔗糖28g、 琼脂11g、 0.20mg NAA、 0.20mg IBA、 活性炭3g， pH为6.1。 0088 提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法中的步骤中， 取花序上花 瓣和花药长度比为1.0的结球甘蓝、 花瓣和花药长度比为0.8的芥菜、 花瓣和花药长度比为 0.9的小白菜处于单核晚期至双核早期、 健康、 无病虫害的花蕾,作为小孢子培养的供体， 芥 菜、 小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为5:5:1共培养,结果如下： 0089 第一， 获得的结球甘蓝低出胚基因型小孢子平均出胚数最高达19个/蕾,而对照1 结球甘蓝。
42、出胚率最高仅为2.5个/蕾； 而对照2结球甘蓝+芥菜出胚率最高仅为4.8个/蕾； 而 对照3结球甘蓝+小白菜出胚率最高仅为5.5个/蕾,且胚状体的质量也得到很大改善,解决 了结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率低的问题,提高了小孢子培养技术的利用效 率。 0090 第二， 经植株形态鉴定及气孔保卫细胞叶绿体数目观察发现,在相同的条件下混 合培养最后得到38株结球甘蓝再生植株,而对照1结球甘蓝单独培养的株数为5株； 对照2结 球甘蓝+芥菜混合培养的株数为8株； 对照3结球甘蓝+小白菜混合培养的株数为10株， 差异 显著。 0091 本发明按照上述实施例进行了说明， 应当理解， 上述实施例不以任何形式限定本 发明， 凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案， 均落在本发明的保护范围之内。 说 明 书 9/9 页 13 CN 108157177 A 13 。