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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711347594.3 (22)申请日 2017.12.15 (71)申请人 河南省农业科学院小麦研究所 地址 450000 河南省郑州市金水区花园路 116号 (72)发明人 周正富 吴政卿 雷振生 刘聪聪 秦毛毛 晁岳恩 王美芳 何盛莲 李文旭 杨攀 常阳 王亚欢 徐福新 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 代理人 时立新 (51)Int.Cl. A01H 1/06(2006.01) A01H 3/04(2006.01) A01C 1/0。
2、0(2006.01) A01C 1/08(2006.01) A01N 43/90(2006.01) A01P 21/00(2006.01) (54)发明名称 一种调控小麦粒重的方法 (57)摘要 本发明属于作物栽培技术领域， 具体涉及一 种调控小麦粒重方法的专利申请事宜。 该方法包 括配制种子处理液、 催芽处理、 大田播种等步骤。 种子处理液中， 在0.5mL、 1M的Tris-Hcl缓冲液 中， 去甲基化试剂含量： 不小于0但不超过2 mM。 本申请中， 以新麦26、 郑麦366、 济麦20、 藁城8901 和西农979为例， 对其种子进行了去甲基化处理。 结果表明， 在低剂量 （0.5mM。
3、） 处理时， 均可以较好 提高粒重指标； 但在高剂量 （1mM、 2mM） 时， 则显著 降低了粒重指标。 基于这一特性， 结合DNA甲基化 或去甲基化对小麦中蛋白组成的影响， 可在提升 小麦产量同时， 实现小麦品质的改良， 因而具有 较好的应用意义。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 108142280 A 2018.06.12 CN 108142280 A 1.一种调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 该方法具体包括如下步骤： （1） 配制种子处理液， 具体而言， 将去甲基化试剂溶液作为种子处理液； （2） 种子处理， 将小麦种子消毒灭菌处理后， 置于步骤 （1） 中所配制的种子处。
4、理液中进 行催芽处理； （3） 大田播种， 将步骤 （2） 中处理后小麦种子播种田间， 正常管理。 2.如权利要求1所述调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述去甲基化试剂 采用5-氮杂-2 -脱氧胞苷。 3.如权利要求2所述调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 所述种子处理液为5-氮杂-2 - 脱氧胞苷溶液与0.5mL、 1M的Tris-HCl缓冲液的混合液； 种子处理液中， 5-氮杂-2 -脱氧胞苷溶液含量： 不小于0但不超过2 mM； 所述2 mM的5-氮杂-2 -脱氧胞苷溶液， 具体为将12 mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试 剂溶解于24.5mL水。
5、中配制而成； 所述1M的Tris-Hcl缓冲液， 具体配制方法为： 取3.025g 的Tris溶解到水中， 用HCl调节 pH到7.5， 定容至25mL。 4.如权利要求3所述调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 种子处理液中， 5-氮杂-2 -脱 氧胞苷溶液的含量不超过0.5 mM； 所述0.5 mM的5-氮杂-2 -脱氧胞苷溶液， 具体为将3 mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试 剂溶解于24.5mL水中配制而成。 5.如权利要求1所述调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 具体催芽处理方式 为： 首先， 将消毒灭菌后小麦种子置于清水中， 3037条件下预培养。
6、1224h； 然后， 将预培养后小麦种子置于步骤 （1） 所配制种子处理液中， 25、 暗培养23d进行 催芽。 6.如权利要求1所述调控小麦粒重的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述小麦为新麦 26、 郑麦366、 济麦20、 藁城8901或西农979。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108142280 A 2 一种调控小麦粒重的方法 技术领域 0001 本发明属于作物栽培技术领域， 具体涉及一种调控小麦粒重方法的专利申请事 宜。 背景技术 0002 小麦作为一种粮食作物， 约占全世界粮食种植面积的17%， 能被加工成面包、 面条、 馒头、 饼干等各式各样的食物， 是食。
7、品工业的重要原料。 统计表明， 由小麦提供的热量和蛋 白质占到人类营养成分的 20%以上。 而随着我国人口的增长和城市化进程的加快， 在人增 地减的双重压力下， 提高单位面积产量成为我国小麦生产的主要目标。 0003 小麦粒重是小麦产量的三要素之一。 解放以来， 我国小麦单产稳步提升， 从1961年 的557.48公斤/公顷到2015年的5392.7公斤/公顷， 单产增加了8.6倍， 是单产提高幅度最大 的作物， 其中小麦粒重的提升起到了关键性作用。 0004 小麦籽粒中， 其主要成分为蛋白和淀粉。 已有研究表明， 小麦籽粒中蛋白含量和淀 粉的合成途径均受到DNA甲基化的影响； 具体而言， 在。
8、大麦的胚乳中， 醇溶蛋白和低分子量 麦谷蛋白的表达量受其启动子区DNA甲基化的影响。 另有部分研究表明： 利用去甲基化试剂 5-氮杂-2 -脱氧胞苷 (5-Aza-2 -deoxycytidine) 诱导处理水稻、 甘蓝等植物后， 可以在 全基因范围内去 DNA 甲基化， 使部分基因的表达得到恢复； 而用5-氮杂-2 -脱氧胞苷处理 小黑麦可以使其DNA去甲基化修饰， 并且这种去DNA甲基化的状态可以稳定的从 F0 代遗传 到 F2 代。 0005 总之， 现有技术虽然表明去甲基化试剂可以影响、 调整小麦中相关基因表达及蛋 白表达情况， 但总体而言仍较多局限于具体蛋白、 具体基因的研究中， 与。
9、小麦产量提升、 品 质改良等实际应用仍然具有一定距离， 因而极有必要基于现有的理论研究成果， 研究、 开发 较为实用的提升小麦产量、 改善小麦品质的生产应用方法。 发明内容 0006 基于现有小麦研究理论， 尤其是DNA甲基化对小麦种子中部分蛋白影响的研究， 本 发明目的在于提供一种调控小麦粒重的方法， 从而为小麦产量提升、 品质改良奠定基础。 0007 本申请所采取的技术方案详述如下。 0008 一种调控小麦粒重的方法， 具体包括如下步骤： （1） 配制种子处理液， 具体而言， 将去甲基化试剂5-氮杂-2 -脱氧胞苷 (5-Aza-2 - deoxycytidine)与Tris-Hcl （p。
10、H =7.5） 缓冲液混合均匀作为种子处理液备用； 种子处理液中， 在0.5mL、 1M的Tris-Hcl缓冲液中， 去甲基化试剂含量： 不小于0但不超 过2 mM； 去甲基化试剂的优选含量不超过0.5 mM； 所述0.5 mM去甲基化试剂， 具体为将3 mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试剂溶解于 24.5mL水中配制而成； 所述2 mM去甲基化试剂， 具体为将12 mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试剂溶解于 说 明 书 1/4 页 3 CN 108142280 A 3 24.5mL水中配制而成； 所述1M的Tris-Hcl缓冲液， 具体配制方法为： 取3.。
11、025g 的Tris溶解到水中， 用HCl调节 pH到7.5， 定容至25mL； （2） 种子处理， 将小麦种子消毒灭菌处理后， 置于步骤 （1） 中所配制的种子处理液中进 行催芽处理； 具体处理方式可参考如下： 首先， 将消毒灭菌后小麦种子置于清水中， 3037条件下预培养1224h； 然后， 将预培养后小麦种子置于步骤 （1） 所配制种子处理液中， 25、 暗培养23d进行 催芽处理， 待种子露白后再进行种植； 所述小麦种子， 例如采用新麦26种子； （3） 大田播种， 将步骤 （2） 中处理后小麦种子播种田间， 正常管理。 0009 新麦26、 郑麦366、 济麦20、 藁城8901和西。
12、农979均为优质强筋小麦品种， 已有部分 研究表明， 这些品种中部分基因存在甲基化现象。 本申请中， 以新麦26为例， 对其种子进行 了不同浓度去甲基化试剂处理。 结果表明， 在低剂量 （0.5mM） 处理时， 可以较好提高粒重指 标， 并在其他4个优质品种中得到验证； 但在高剂量 （1mM、 2mM） 处理新麦26时， 则显著降低了 粒重指标。 基于这一特性， 结合DNA甲基化或去甲基化对小麦中蛋白组成的影响， 可在提升 小麦产量同时， 实现小麦品质改善， 因而具有较好的应用意义。 附图说明 0010 图1为使用不同浓度去甲基化试剂处理后的新麦26种子， 在原阳地区种植收获后 的千粒重检测图。
13、； 新麦26A为对照组 （A缓冲液） 处理后的新麦26千粒重， 新麦26B1为经0.5mM 5-Aza-2 -deoxycytidine （B1缓冲液） 处理后的新麦26千粒重， 新麦26B2为经1mM 5-Aza- 2 -deoxycytidine （B2缓冲液） 处理后的新麦26千粒重， 新麦26B3为经2mM 5-Aza-2 - deoxycytidine （B3缓冲液） 处理后的新麦26千粒重； 结果表明， 新麦26的千粒重在低浓度 0.5mM试剂处理下， 相比于对照组有显著提升； 但是增加该试剂浓度， 则有显著性的降低现 象， 尤其在浓度为2mM时， 达到极显著水平； 图中 “*” 。
14、表示千粒重在对照组与处理组之间具有 显著差异， 图中 “*” 表示千粒重在对照组与处理组之间具有极显著差异； 图2为在不同地区种植的新麦26千粒重图； 其中A代表对照组 （A缓冲液） ， B1为0.5mM 5- Aza-2 -deoxycytidine （B1缓冲液） ； 从图中可以看出， 经0.5mM去甲基化试剂处理的分别在 3个地区种植的新麦26的粒重均有不同程度的增加， 其中在商丘地区种植的种子粒重提高 最多， 达到极显著水平， 在原阳与开封地区种植的则达到显著水平； 结果表明， 使用低浓度 （0.5mM） 去甲基化试剂处理可以使新麦26的粒重得到提升； 图3为在原阳地区种植不同品种的千。
15、粒重图； 其中实验品种分别是郑麦366、 济麦20 、 藁城8901和西农979等优质强筋小麦； A代表对照组 （A缓冲液） ， B1为0.5mM 5-Aza-2 - deoxycytidine （B1缓冲液） ； 从图中可以看出， 经0.5mM去甲基化试剂处理后4个品种的粒重 均有不同程度的增加， 且均达到了极显著水平。 具体实施方式 0011 下面结合实施例对本发明技术方案进一步详细的说明。 0012 实施例1 说 明 书 2/4 页 4 CN 108142280 A 4 本实施例以新麦26 （一种优质强筋小麦品种） 为例， 对其小麦粒重进行了调控， 具体实 验过程简介如下。 0013 （。
16、一） 小麦种子去甲基化试剂处理 （1） 配制种子处理液， 具体而言， 将去甲基化试剂5-氮杂-2 -脱氧胞苷 (Sigma公司产 品)与Tris-Hcl （pH =7.5） 缓冲液混合均匀作为种子处理液备用； 为确定去甲基化试剂5-氮 杂-2 -脱氧胞苷最为合适的处理浓度， 设置实验组别对照组 （A） 与处理组 （B） 如下， 具体而 言： 对照组 （A） ： 0.5mL、 1M 的Tris-Hcl （pH 7.5） +24.5mL水； 处理组 （B1） ： 0.5mM的5-Aza-2 -deoxycytidine+0.5mL、 1M 的Tris-Hcl （pH 7.5） ； 处理组 （B2）。
17、 ： 1mM的5-Aza-2 -deoxycytidine+0.5mL、 1M 的Tris-Hcl （pH 7.5） ； 处理组 （B3） ： 2mM 的5-Aza-2 -deoxycytidine+0.5mL、 1M 的Tris-Hcl （pH 7.5） ； 所述0.5mM的5-Aza-2 -deoxycytidine溶液： 3mg的5-Aza-2 -deoxycytidine溶解于 24.5mL无菌水； 所述1mM的5-Aza-2 -deoxycytidine溶液： 6mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试剂溶解于 24.5mL无菌水； 所述2mM的5-Aza-2 -deox。
18、ycytidine溶液： 12mg的5-Aza-2 -deoxycytidine试剂溶解 于24.5mL无菌水； 所述1M的Tris-Hcl （pH 7.5） ： 取3.025g 的Tris溶解到无菌水中， 用HCl调节pH到7.5， 定容至25mL。 0014 （2） 种子处理， 将小麦种子进行消毒灭菌处理， 具体消毒灭菌程序为： 先将种子用 75%酒精浸泡2min， 然后洗涤3次； 再用10% H2O2浸泡30min， 最后洗涤不少于5次确保清洗干 净。 0015 将消毒灭菌后种子晾干后， 移入灭菌容器中， 加适量无菌水， 37预培养18h使其 充分吸收水分。 0016 将上述预培养后种子。
19、转移至新的无菌容器中， 分为对照组和处理组， 分别加入适 量步骤 （1） 中的种子处理液， 25、 黑暗培养23d进行催芽。 0017 （3） 大田播种， 待步骤 （2） 中的种子有露白 （大约23cm） 时， 移入大田种植。 为检验 该方法是否有地区适应性， 大田种植时选择了3个地区： 原阳、 开封和商丘。 正常田间管理， 待小麦成熟后， 收集不同地区种植的对照组与处理组成熟种子。 为便于描述， 将对照组的材 料编号为新麦26A； 处理组的材料编号为新麦26B。 0018 （二） 材料千粒重的测定 对步骤 （一） 中所收集的3个地区的小麦种子进行千粒重测定， 并进一步进行统计学分 析， 以评。
20、估相关去甲基化处理后结果， 具体过程简介如下。 0019 （1） 种子千粒重的测定 收集3个地区的成熟种子， 进行千粒重测定， 具体测定步骤如下： 选用自动数粒仪进行计数， 设置预置数为1000； 选取纯净干燥种子放置于电磁振动盒， 使种子逐粒排队螺旋； 随着螺旋槽上升的种子， 到达落料口落下， 通过LED显示屏显示实际 粒数； 当设定数与实际粒数相符时， 停止送料； 将数粒后的种子放置于100g天平 （上海越平） 上称重， 每一样品至少3次称重。 说 明 书 3/4 页 5 CN 108142280 A 5 0020 （2） 统计学中的T-test检验 进行统计学中T-test检验时， 具体。
21、方法如下： 对3个地区种植的处理与未处理 （对照） 种子的千粒重进行分类； 分别计算其平均数 （AVERAGE） 与标准偏差 （STDEV） ； 进行数据分析， 选用双样本异方差假设检验； 根据统计结果 查看P-value判断两样本之间是否有差异； 若P0.01， 则两样本之间差异性极显著； P 0.05， 则两样本之间差异性显著； 若P0.05， 则两样本之间无差异。 0021 最后， 利用GraphPad Prism5软件依据千粒重结果作图， 结果如图1、 图2所示。 0022 对图1进行分析可以看出， 经0.5mM的种子处理液处理后， 千粒重有显著提升； 但是 增加试剂浓度后， 粒重有显。
22、著性的降低现象， 在2mM时达到极显著水平。 0023 对图2分析可以看出， 相同浓度 （0.5mM） 处理时， 在3个地区种植的新麦26的粒重均 有不同程度的增加， 表明这一处理方法不具有地域依赖性， 相反具有普适性。 0024 实施例2 本实施例分别以郑麦366、 济麦20、 藁城8901和西农979等4种优质强筋小麦品种为例， 对其小麦粒重进行了调控， 具体实验过程简介如下。 0025 （一） 小麦种子去甲基化试剂处理 （1） 配制种子处理液， 参考实施例1所述， 选取去甲基化试剂5-氮杂-2 -脱氧胞苷 (0.5mM)与Tris-Hcl （pH =7.5） 缓冲液混合均匀作为种子处理液。
23、备用； （2） 种子处理， 具体处理过程同实施例1； （3） 大田播种， 待步骤 （2） 中的种子有露白 （大约23cm） 时， 移入原阳地区进行大田种 植， 正常田间管理， 待小麦成熟后， 收集不同地区种植的对照组与处理组成熟种子。 为便于 描述， 将对照组的材料编号为A； 处理组的材料编号为B1。 0026 （二） 材料千粒重的测定 对步骤 （一） 中所收集的原阳地区的郑麦366、 济麦20、 藁城8901和西农979的小麦种子 进行千粒重测定， 并进一步进行统计学分析， 以评估相关去甲基化处理后结果， 具体过程参 照实施例1， 结果如图3所示。 0027 对图3进行分析可以看出， 相同浓。
24、度 （0.5mM） 处理时， 郑麦366、 济麦20、 藁城8901和 西农979的粒重均有不同程度的增加， 其中西农979增加最为显著， 表明采用去甲基化处理 时具有一定普适性， 但具体改善效果因品种差异而具有一定差异性。 0028 综合上述实施例情况可以看出， 使用较低浓度去甲基化试剂可以使新麦26、 郑麦 366、 济麦20、 藁城8901和西农979中部分甲基化现象受到抑制， 从而影响部分基因的表达， 可提高小麦粒重指标。 基于此特性， 结合去甲基化对小麦蛋白组分的影响， 可为小麦品种改 良奠定良好的理论基础和应用基础。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108142280 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 108142280 A 7 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 108142280 A 8 。