技术领域
本发明涉及在行走、慢跑、赛跑、马拉松、游泳、骑自行车、有氧健身、打网球、踢足球、滑雪和滑冰等运动时抑制与运动负荷相伴的心率上升的心率上升抑制方法。进而，涉及该心率上升抑制方法中使用的抑制心率上升的组合物。
背景技术
当今，为了增进健康、预防和改善生活习惯疾病，努力习惯行走、慢跑等运动的人数正在增加。进而，虽然现在没有特别习惯运动，但想要习惯、认为应该习惯运动的潜在运动诉求者（运动预备人群）也非常多。然而，由于与运动负荷时的循环系统的活跃化相伴的身体负荷、所谓的“痛苦”，或者因为疲劳的蓄积等，在习惯运动上受挫折的人数也很多。
此外，对于所谓的运动员而言，正在日益开发和改善有效率且有效果的锻炼方法。但另一方面，出于提高竞技能力的强烈观念等而忍耐过度训练、疲劳蓄积地持续锻炼所引发的“故障”逐渐成为严重的问题。
本说明书中，以下将非运动员而出于前者那样的目的或出于兴趣而进行运动的人记作一般运动者，将后者的运动员记作竞技运动者。
对于一般运动预备人群在运动习惯化中的挫折而言，可以认为由于长时间不运动而导致的与运动时的心率上升相伴的痛苦也是一个主要因素。尤其是还可以认为：对于长期疏于运动习惯的中老年而言，即使是轻度的运动负荷，其心率的上升也明显，由此造成对运动的逃避感。
此外可以认为：对于竞技运动者的过度训练等而言，出于完成训练项目的责任感，超过现有自身的循环功能的运动强度成为常态。关于该运动强度的详情如下所述，但运动时的心率也有影响，如果能够抑制运动时的心率上升，则即使是相同的训练项目，也可期待相对地降低运动强度。
然而，截止至今，针对出于这种观点的抑制运动时的心率上升的方法尚无报告。
专利文献1开发了具有降低哺乳动物的心率的特性的使乳酸菌发酵而得到的发酵食品原料以及含有该发酵食品原料的组合物的使用。然而，专利文献1的发酵食品原料以针对具有心绞痛、高血压和动脉硬化等病态的哺乳动物进行这些病态治疗作为目的，其用于降低“安静时的心率”。
专利文献2公开了以改善精神或情绪状态作为目的的、含有柑橘类所包含的属于类黄酮的橙皮苷类而得到的心率变动调节剂、以及使用该心率变动调节剂的心率变动调整方法。但是，专利文献2公开的发明也是涉及调整安静时的心率变动的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2008-511593号公报
专利文献2：日本特开2010-59097号公报。
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，报告有为了进行病态治疗、使精神稳定、情绪稳定而降低安静时的心率或者调整心率变动的技术。但是，关于以一般运动者及其预备人群和竞技运动者作为对象的、抑制运动时的心率上升的方法和该抑制方法中使用的抑制心率上升的组合物尚属未知。
因而，本发明的课题在于，提供抑制运动时的心率上升的方法，可期待其有助于使一般运动者及其预备人群习惯运动或提高运动时的乐趣，进而通过降低竞技运动者的身体负荷而预防故障。
本发明的其它课题在于，提供在上述抑制方法中使用的经口投予用的抑制运动时的心率上升的组合物，可期待其有助于使一般运动者及其预备人群习惯运动或提高运动时的乐趣，进而通过降低竞技运动者的身体负荷而预防故障。
本发明的另一个其它课题在于，提供上述组合物的用于抑制心率上升的用途，可期待其有助于使一般运动者及其预备人群习惯运动或提高运动时的乐趣，进而通过降低竞技运动者的身体负荷而预防故障。
用于解决问题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果开发出通过对被试验者（运动者）在其运动前、运动时或者这两个时期投予特定的酪蛋白水解物或其含有成分从而抑制运动时的心率上升的方法，由此完成了本发明。
即，根据本发明，提供抑制运动时的心率上升的方法，其中，在运动开始前、运动过程中或者这两个时期经口投予含有酪蛋白水解物或该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物的组合物，所述酪蛋白水解物是将动物乳酪蛋白水解而得到的，其包含游离氨基酸和肽且平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下。
前述酪蛋白水解物优选为将动物乳酪蛋白用源自曲霉的酶进行酶解而得到的分解物。
此外，根据本发明，提供在上述抑制运动时的心率上升的方法中使用的经口投予用的抑制运动时的心率上升的组合物，其含有酪蛋白水解物或该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物作为有效成分，所述酪蛋白水解物是将动物乳酪蛋白水解而得到的，其包含游离氨基酸和肽且平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下。
进而，该抑制心率上升的组合物优选以特定的比例包含生物体内难分解性肽，所述生物体内难分解性肽包含具有Xaa Pro序列的二肽和具有Xaa Pro Pro序列的三肽。
进而，根据本发明，提供经口投予用组合物的抑制运动时的心率上升的用途，所述经口投予用组合物含有酪蛋白水解物或该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物作为有效成分，所述酪蛋白水解物是将动物乳酪蛋白水解而得到的，其包含游离氨基酸和肽且平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下。
发明的效果
本发明的抑制运动时的心率上升的方法可通过投予特定的酪蛋白水解物或其含有成分来抑制运动时的心率上升，因此，可有助于使一般运动者及其预备人群习惯运动、提高运动时的乐趣。进而，在竞技运动者的训练过程中，还可有助于通过降低竞技中的身体负荷来预防故障。
附图说明
图1是实施例的酪蛋白水解物的概要制造流程图。
图2是实施例1和比较例1的运动试验中的心率变动的示意图。
具体实施方式
以下，更详细地说明本发明。
本发明的抑制运动时的心率上升的方法是在运动开始前、运动过程中或者这两个时期经口投予含有酪蛋白水解物或该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物的组合物的方法，所述酪蛋白水解物是将动物乳酪蛋白进行水解而得到的，其包含游离氨基酸和肽且平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下。此外，本发明的抑制心率上升的组合物是含有上述酪蛋白水解物或者该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物的组合物。
本发明中使用的酪蛋白水解物是将动物乳酪蛋白按照以氨基酸残基数计的平均链长达到特定范围的方式进行水解而得到的。该酪蛋白水解物包含相对于酪蛋白水解物总量优选为80重量%以上、更优选为80~90重量%的游离氨基酸和肽混合物。尤其是，该肽优选以特定的比例包含生物体内难分解性肽，所述生物体内难分解性肽包含具有Xaa Pro序列的二肽和具有Xaa Pro Pro序列的三肽。其中，肽也可以制成肽盐。
此处，平均链长可以用将相同重量的动物乳酪蛋白水解时产生的游离氨基酸与肽的总摩尔数相对于酪蛋白酸水解物的总氨基酸的摩尔数之比来表示。酪蛋白酸水解物是指将酪蛋白的蛋白质分解成氨基酸为止而得到的产物。
该平均链长可通过例如使用了与氨基反应而显色的OPA（邻苯二甲醛）试剂的OPA法来评价水解物中的摩尔浓度，并以平均链长=(酪蛋白酸水解物中的摩尔数)/(酪蛋白水解物中的摩尔数)的形式来求出。
此外，前述生物体内难分解性肽是指：被生物体的肠道吸收时，对于生物体内肽酶群的抗分解性高、且在羧基末端具有Pro的二肽Xaa Pro和三肽Xaa Pro Pro。
本发明中，将动物乳酪蛋白水解而得到的分解物的平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下、优选为1.1~2.1、特别优选为1.3~2.1。该平均链长超过2.1时，期望的二肽和三肽、进而游离氨基酸的比例降低，生物体吸收性、进而生物体内难分解性肽的含有比例降低，有可能难以获得期望的效果。
前述酪蛋白水解物中包含的具有Xaa Pro序列的二肽的含有比例相对于分解物中的游离氨基酸与肽的总量通常为5重量%以上、优选为5~25重量%。该含有比例低于5重量%时，期望的作用有可能降低。
前述酪蛋白水解物中包含的具有Xaa Pro Pro序列的三肽的含有比例相对于分解物中的游离氨基酸和肽的总量通常为1重量%以上、优选为1~5重量%。该含有比例低于1重量%时，期望的作用有可能降低。
对于前述酪蛋白水解物中的肽而言，具有Xaa Pro序列的二肽和具有Xaa Pro Pro序列的三肽中的Xaa可以是任意的氨基酸。例如，作为具有Xaa Pro序列的二肽，可列举出Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Pro，作为具有Xaa Pro Pro序列的三肽，可列举出Ser Pro Pro、Val Pro Pro、Ile Pro Pro、Phe Pro Pro。作为酪蛋白水解物，可优选列举出包含前述例示出的二肽和三肽中的至少1种或全部的酪蛋白水解物。
前述酪蛋白水解物除了包含肽之外还包含游离氨基酸，游离氨基酸的含有比例相对于分解物中的游离氨基酸与肽的合计通常为35~50重量%、优选为40~45重量%。
前述酪蛋白水解物中，除了包含前述游离氨基酸和肽之外，还可以包含例如市售的动物乳酪蛋白等中通常含有的脂质、灰分、碳水化合物、食物纤维、水分等10~20重量%左右，此外，根据需要也可以去除这些之中的一部分或全部适当成分。
为了制造前述酪蛋白水解物，可通过例如使用能够分解至酪蛋白水解物的平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下的酶群，将动物乳酪蛋白水解至该平均链长为2.1以下的方法来获得。
动物乳酪蛋白是包含大量Pro的食品等中使用的、安全性得以确认的蛋白质，可列举出例如牛奶、马奶、山羊奶、羊奶等的酪蛋白，可特别优选地使用牛乳酪蛋白。
将动物乳酪蛋白水解时的酪蛋白浓度没有特别限定，为了高效地生产前述水解物，优选为3~19重量%。
作为前述酶群，只要是适当选择能够分解至酪蛋白分解物的平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下的酶并组合而成的酶群即可，可优选地列举出例如包含Xaa Pro Xaa或Xaa Pro Pro Xaa的羧基末端的Pro Xaa序列能够切断的肽酶的酶群（X）。
酶群（X）优选包含在活性中心具有丝氨酸的丝氨酸类蛋白酶、或者在活性中心具有金属的金属蛋白酶。作为金属蛋白酶，可列举出中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶等，包含这些之中的至少1种从能够高效且以短时间、进而通过单阶段反应来得到期望水解物的观点出发是优选的。此外，作为前述Pro Xaa序列能够切断的肽酶，优选为等电点显示为酸性区域的酶。
作为前述酶群或酶群（X），可列举出例如源自米曲霉（Aspergillus oryzae）等曲霉的酶群。这种酶群可列举出用适当的培养基培养菌体，并对产出的酶进行水提取而得到的酶群等，可特别优选地列举出源自米曲霉的酶群之中的等电点显示为酸性区域的酶群。
作为源自米曲霉的酶群，可以利用市售品，可列举出例如スミチームFP、LP或MP（以上为注册商标、新日本化学公司制）、ウマミザイム（注册商标、天野エンザイム公司制）、Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL（以上为商品名、株式会社樋口商会制）、オリエンターゼONS（注册商标、阪急バイオインダストリー株式会社制）、デナチームAP（注册商标、ナガセ生化学公司制），特别优选使用スミチームFP（注册商标、新日本化学株式会社制）。
使用这些市售的酶群时，通常设定为最佳条件，但为了得到前述酪蛋白水解物，可以根据所用的酶群而适当变更条件、例如使用酶量、反应时间等来进行。
将前述动物乳酪蛋白水解时的酶群的添加量是例如溶解有动物乳酪蛋白的水溶液中的酶群/动物乳酪蛋白以重量比计达到1/1000以上、优选达到1/1000~1/10、特别优选达到1/100~1/10、进一步优选达到1/40~1/10的比例那样的量。
反应条件可根据酶群以能够得到目标酪蛋白水解物的方式进行适当选择。例如，反应温度为25~60℃、优选为45~55℃，pH可以设为3~10、优选设为5~9、特别优选设为5~8。此外，酶反应时间可以设为2~48小时、优选设为7~15小时。
酶反应的结束可通过使酶失活来进行，通常可以以60~110℃使酶失活来停止反应。
酶反应停止后，优选根据需要离心分离去除、通过各种过滤器处理来去除沉淀物。进而，通过在酶反应停止后冷却至5℃~10℃，能够生成更多的沉淀物。
此外，根据需要，也可以从所得水解物中去除具有苦味、臭味的肽。这种苦味成分、臭味成分的去除可以使用活性炭或疏水性树脂来进行。例如，可通过向所得水解物中添加相对于所用的酪蛋白量为1~20重量%的活性炭，并使其反应1~10小时来实施。使用的活性炭的去除可通过离心分离、膜处理操作等公知方法来进行。
所得包含酪蛋白水解物的反应液可以直接添加至液体制品而制成饮料、例如清凉饮料和功能性饮料等的形态。此外，为了提高上述酪蛋白水解物的通用性，通过将上述反应液浓缩后进行干燥而制成粉末的形态，能够制成用于制备各种形态的经口投予用组合物的原料成分。
为了改善营养的均衡、口味等，也可以使这种粉末中含有各种辅助添加剂。可列举出例如各种碳水化合物、脂质、维生素类、矿物质类、甜味剂、香料、色素、结构（texture）改善剂。
本发明的抑制运动时的心率上升的方法以及该抑制方法中使用的抑制心率上升的组合物中，其有效成分如上述说明的那样，是平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下的酪蛋白水解物、或者该水解物中包含的游离氨基酸和肽混合物。此外，酪蛋白水解物中的游离氨基酸和肽的量如上所述地优选为80重量%以上。
本发明中，关于抑制运动时的心率上升的组合物的投予量，例如，在体重为50kg的人的情况下，优选的是，平均运动1次（单位运动）以上述有效成分计为0.04~100g（0.8~2000mg/kg体重）、优选为0.2~20g（4~400mg/kg体重）、进一步优选为0.3~4g（6~80mg/kg体重）左右。该单位体重的投予量对于儿童、成人均可以相同。
作为投予的时机，是运动开始前、运动过程中、或者这两个时刻，从效果的观点出发，优选至少在运动开始前投予。此外，可以在运动结束后继续投予。
作为本发明的抑制心率上升的组合物的制品形态，只要含有上述有效成分就没有特别限定，可以是固态或粉末食品形态、或者饮料形态中的任一者。进而，可以为功能性食品、功能性饮料和营养辅助食品之类的形态。
作为上述食品和饮料的例子，可例示出流食、果冻、曲奇、饼干和巧克力、以及各种果汁饮料、乳酸菌饮料、运动饮料和碳酸饮料等。此外，这些饮料食品形态中，根据需要也可以添加饮料食品中使用的其它成分、例如糖类、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、香料或它们的混合物等添加物。
进而，作为以功能性食品、功能性饮料和营养辅助食品的形式投予时的形态，可列举出例如片剂、丸剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊、散剂、颗粒剂、液体制剂等。
关于制剂化，例如可适当根据需要使用可允许使用的载体、辅助剂、赋形剂、形状辅助剂、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、缓冲剂、增粘剂、凝胶化剂、保存剂、润滑剂、抗氧化剂等，以通常认可的制剂实施所要求的单位用量形态来制造。
作为片剂化等中使用的赋形剂，可列举出例如乳糖、白糖、D-甘露醇、D-山梨糖醇、淀粉、α化淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯树胶、茁霉多糖、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁等。此外，作为润滑剂，可列举出例如蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等糖酯类、硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂醇、粉末植物油脂等固化油脂、白蜂蜡等蜡类、滑石、硅酸、硅等。
接着，针对本发明中提及的运动和竞技进行说明。本发明的对象运动和竞技没有特别限定，可列举出例如行走、慢跑、赛跑、马拉松、游泳、有氧健身、划船、棒球、网球、乒乓球、足球、篮球、排球、舞蹈、射箭、骑自行车、自行车竞速、滑雪、滑冰、滑板、环山跑、登山、潜水、跳伞等。进而，也可例示出在实施过程中对身体的负荷匹敌于高强度的运动竞技、且根据情况心率有时上升至接近最大心率的摩托车竞速、汽车竞速等。
这些运动、竞技中，在一般运动者的情况下，例如有可能因心率上升导致的疲劳感、痛苦感的上升而记住对运动的逃避感。此外，在竞技运动者的情况下，不仅有可能因不合理的蓄积而导致故障，还担心因竞技中的疲劳蓄积而导致反射神经的降低、判断力的降低，认为还有可能导致竞技中的受伤。
通过在运动时实施本发明的抑制运动时的心率上升的方法，即在运动开始前、运动过程中或者这两个时刻投予该抑制方法中使用的本发明的抑制心率上升的组合物，从而能够抑制运动时的心率上升，可期待能够规避上述各种不良情况的可能性。以下，有时将该抑制心率上升的方法和抑制心率上升的组合物简称为本发明的抑制方法和本发明的组合物。
应予说明，在运动开始前进行投予时，优选在运动开始前3小时以内进行投予，更优选在1小时前~即将运动之前进行投予，特别优选在45分钟前~15分钟前进行投予。此外，在前述投予的基础上，可以在运动结束后继续投予。
本发明的运动/竞技的种类如上述例示的那样，关于对身体造成的负荷、换言之运动负荷，可以用以下说明的运动强度来表示。本发明的运动强度按照卡氏法通过下式（1）来求出。
运动强度（%）=[（运动时心率-安静时心率）÷（最大心率-安静时心率）]×100 （1）。
应予说明，式（1）的最大心率因人而异，此外，其难以测定且不实用，因此可以用下式（2）所示的推测最大心率来代替。即，式（1）的最大心率是指式（2）的推测最大心率。其中，可以正确地测定各人的最大心率，使用该最大心率来求出运动强度。
推测最大心率 = 220-年龄 （2）。
根据“山本哲史、山崎元、运动处方的最新见解、庆应义塾大学体育医学研究中心期刊、p33-39、1999年”，上述运动强度用0%来表示安静状态，分别用低于20%表示极轻度、用20~39%表示轻度、用40~59%表示中度、用60~84%表示强度、用85%以上表示极强度，100%时达到最大。换言之，低于40%表示轻等级的运动，40%以上且低于80%表示略重等级的运动~非常重等级的运动，80%以上表示接近极限的运动。
应予说明，根据运动的种类，运动时的心率有时大幅变动，但式（1）中的运动时心率使用该运动时的一定时间的平均值。此外，安静时心率也同样地使用运动前安静时的一定时间的平均值。
此外，通过本发明的抑制方法和本发明的组合物抑制运动时的心率上升的程度还因运动种类和运动量、以及成为对象的各个人而异，因此无法一概而论，与不实施本发明的抑制方法的情况相比，可以至少以超过0%的比例来降低运动时的心率。
用运动强度来评价运动对身体造成的负荷的理由是该负荷因人而异。即，即使是相同的运动量，对身体造成的负荷也会因年龄、性別、运动习惯的有无、一般运动者或竞技运动者等的差异而明显不同。例如，即使对于竞技运动者而言是运动强度为“极轻度”的运动量，在没有运动习惯的老年人的情况下，运动强度有时也成为“强度”、“极强度”。
作为投予本发明的组合物来实施本发明的抑制方法时的运动强度，没有特别限定，只要是超过0%的运动强度即可。从抑制心率上升的效果的真实感的观点出发，优选在运动强度超过0%且为60%以下的运动时应用本发明的方法，更优选在运动强度为20~40%的运动时应用本发明的方法。
此外，只要运动强度超过0%，则其运动时间没有特别限定。例如，在行走50m那样的短距离行走的情况下，运动时间为数秒，在普通市民赛跑者进行全程马拉松的情况下，运动时间有时可长达5~8小时。这样的短距离行走、长距离行走均是本发明的对象运动，因此如上所述，运动时间没有特别关系，可以对运动强度超过0%的运动应用本发明的抑制方法和组合物。
应予说明，运动时间超过30分钟时，即使在运动开始前投予了本发明的组合物的情况下，也可以在运动过程中进行投予。
关于本发明抑制方法的实施和本发明组合物的投予，在竞技运动者的情况下，优选在监督者、教练或专业训练员等的指导、指示下进行。这是因为其能够冷静地观察并判断竞技运动者的状况。
此外，对于一般运动者而言，在其隶属于各种官方体育俱乐部或普通体育俱乐部或体育健身房等的情况下，优选根据该俱乐部、健身房的教练、训练员或指导员等的指导、指示进行投予。这是因为其毕竟能够冷静地观察并判断一般运动者的状况。
或者，在附带与本发明的组合物的投予方法相关的指南等信息的情况下，可以按照该信息凭借一般运动者和竞技运动者个人的判断来进行摄取。此外，也可以根据本发明的权利人或得到权利人许可的人所发出的电子邮件或者提供的主页等源自因特网的信息，凭借个人的判断来进行摄取。进而，还可以拼接个人独自的判断来摄取本发明的组合物或者实施本发明的抑制方法。
实施例
以下通过实施例来说明本发明，但本发明不限定于它们。
首先，说明实施例中使用的、将动物乳酪蛋白水解而得到的包含游离氨基酸和肽且平均链长以氨基酸残基数计为2.1以下的酪蛋白水解物的制造例。应予说明，以下在没有特别限定的情况下，成为酪蛋白水解物时，是指以下说明的制造例中制造的酪蛋白水解物。
1. 酪蛋白水解物的制造例
图1示出酪蛋白水解物的概略制造流程。
将源自牛奶的酪蛋白（酪蛋白钠、日本NZMP公司制）4.5g添加至调整为约80℃的蒸馏水100g并充分搅拌后，添加1N氢氧化钠（和光纯药公司制）溶液而制成pH7.0，此外，将温度调整至20℃来制备基质溶液。通过将该基质溶液以95℃加热10分钟来进行杀菌。
向杀菌后的基质溶液中以酶/酪蛋白的重量比达到1/25的方式添加源自米曲霉且至少包含金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶I、中性蛋白酶II和亮氨酸氨基肽酶的市售酶（注册商标“スミチームFP”、新日本化学工业公司制），以50℃使其反应11小时。接着，以95℃加热10分钟而使酶失活，得到酪蛋白水解物溶液。将酪蛋白水解物溶液冷却至5℃为止，然后将析出物与上清液通过离心分离（离心分离条件：3000rpm、20分钟）进行分离，将去除该析出物后的上清液以95℃加热10分钟来进行杀菌。通过将杀菌后的上清液用喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥，从而得到酪蛋白水解物的粉末。
进行所得酪蛋白水解物中的含有成分的分析。蛋白质利用凯式法进行测定，关于氨基酸利用氨基酸分析装置进行测定。此外，从该蛋白质量中减去氨基酸而得到的量记作肽量。进而，脂质利用酸分解法进行测定，灰分利用直接灰化法进行测定，水分利用常压加热干燥法进行测定。此外，从100%中减去各成分而得到的残余记作炭水化物量。其结果，氨基酸为38.5重量%、肽为43.8重量%、水分为5.8重量%、脂质低于0.1重量%、灰分为4.1重量%且炭水化物为7.8重量%。
2. 酪蛋白水解物中的游离氨基酸和肽的平均链长
通过上述1得到的酪蛋白水解物中包含的游离氨基酸和肽的平均链长利用与其中包含的游离氨基酸和肽的氨基发生反应的OPA试剂来测定摩尔数，利用其与同样测定的酪蛋白酸水解物的摩尔数之比进行评价。
使邻苯二甲醛（荧光分析用特级试剂、ナカライテスク公司制）40mg溶解于甲醇1mL，添加β-巯基乙醇100μL。使用向预先制备的100mM四硼酸钠溶液25mL中添加20%十二烷基硫酸钠2.5mL而得到的产物，将上述溶解的邻苯二甲醛稀释至25mL，进一步用蒸馏水使其50mL，从而制备OPA试剂。
将通过上述1得到的酪蛋白水解物粉末以适当的浓度溶解于适当的溶剂，以15000rpm进行10分钟的离心分离，分取上清50μL。接着，添加上述OPA试剂1mL并充分搅拌，在室温下放置5分钟后，利用吸光光度计（商品名Ubest-35、日本分光公司制）测定340nm的吸收。
关于标准曲线，使用制备1%的酪蛋白酸水解物并适当稀释而得到的产物，根据同样测定的结果求出吸光度与摩尔浓度的关系。并且，根据下式来计算平均链长。其结果，平均链长为2.1。
平均链长=（1%酪蛋白酸水解物的摩尔浓度）/（1%酪蛋白水解物的摩尔浓度）。
3. 酪蛋白水解物中的肽的定量
使用各种化学合成标准肽按照常规方法来求出通过上述1得到的酪蛋白水解物中的二肽和三肽的量。将结果示于表1。应予说明，各肽的量用1g酪蛋白水解物中的mg数来表示。
[表1]
*1 1g酪蛋白水解物中的各肽的含量。
如上所述，由于酪蛋白水解物中的氨基酸量为38.5重量%、肽量为43.8重量%，因此，酪蛋白水解物中包含的具有Xaa Pro序列的二肽的含有比例相对于分解物中的游离氨基酸与肽的总量为10.2重量%。此外，具有Xaa Pro Pro序列的三肽的含有比例相对于分解物中的游离氨基酸与肽的总量为2.0重量%。
实施例1
按照以下示出的条件，利用空白对照双重盲检交叉试验来实施运动试验，测定抑制运动时的心率上升的效果。
[1] 被试验者
没有运动习惯的40岁~74岁的健康男性14人（平均年龄为53.1岁）。
[2] 运动种类和运动量
使用踏板车按照下坡道（-5°）方式进行30分钟的时速5km的步行运动。
[3] 抑制心率上升的组合物
将通过基于上述“1. 酪蛋白水解物的制造例”的方法制造的酪蛋白水解物粉末与赋形剂、润滑剂一同压片，制备药品（片剂）。该药片1片的重量为0.35g，药片中的酪蛋白水解物含量为25~30重量%。
[4] 试验方法
1）在运动开始30分钟前，对被试验者投予4片药片（1.4g），利用心电图测定来开始测定心率。自开始投予药品起至运动开始为止的期间维持安静。
2）自开始投予药片起30分钟后实施上述[2]的运动。在运动过程中，利用心电图测定来继续测定心率。
3）在运动后静止30分钟，结束试验。
4）通过上述式（1）和（2），由心率的测定结果算出各被试验者的运动强度。
将14名被试验者的运动开始前的安静时心率、运动时心率和运动强度示于表2。对于表2中的安静时平均心率而言，平均值表示14名被试验者的安静时30分钟的心率的平均值，标准偏差表示14名被试验者的安静时平均心率的标准偏差。
对于表2中的运动时平均心率而言，平均值表示14名被试验者的运动时30分钟的心率的平均值，标准偏差表示14名被试验者的运动时平均心率的标准偏差。
对于表2中的运动强度而言，平均值表示由上述安静时和运动时的平均心率求出的14名被试验者的运动强度的平均值，标准偏差表示14名被试验者的运动强度的标准偏差。
此外，将试验中的心率变动示于图2。图2中的各经过时间处的心率表示14名被试验者的每隔5分钟的平均值。图2中，自经过时间30分钟起开始上述[2]的运动。
比较例1
投予包含25~30重量%的酪蛋白钠、且通过与实施例1相同的方法制备的药片来作为空白，用以代替包含酪蛋白水解物粉末的实施例1的药片，除此之外，与实施例1同样操作，实施试验。此外，14名被试验者全部设为同一人。应予说明，比较例1的试验与实施例1的试验在不同的日期实施。
将结果示于表2和图2。表2中的各平均值和各标准偏差与实施例1同样求出。此外，图2中的各经过时间处的心率与实施例1同样地表示14名被试验者的每隔5分钟的平均值。
[表2]
如表2和图2所示，实施例1与比较例1相比，运动时的心率在全部运动时间内降低约3.7次/分钟，关于抑制运动时的心率上升，可观察到统计学上的显著性差异（P<0.05）。此外，如表2所示，通过抑制心率上升的效果，即使是相同运动量，运动强度也降低约4.2%（降低率为13.8%），可期待降低对身体的负荷。
另一方面，关于自投予药片起至开始运动为止的30分钟的安静时平均心率，实施例1与比较例1观察不到差异，表示本申请的效果与安静时的效果不同。