技术领域
本发明涉及食品灭菌领域，尤其是涉及一种基于柑橘柚皮素与高强脉冲电场协同杀灭金黄色葡萄球菌的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，食品受其污染的机会很多。而且金黄色葡萄球菌生存能力很强，具有很好的耐盐性，耐干燥性。它能够在肉制品、奶制品、饮料等食品中大量繁殖，产生肠毒素，从而引起消费者恶心、呕吐、腹泻等。美国疾病控制中心报告指出全球由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病占第二位，仅次于大肠杆菌。除了产生肠毒素引起食物中毒之外，金黄色葡萄球菌还具有侵染性，不仅会引起人体产生轻微的皮肤感染，甚至可能导致感染性心内膜炎、性筋膜炎、骨髓炎和肺炎等等。因此寻求安全可靠、有效的手段杀灭金黄色葡萄球菌仍然是食品工业和消费者面临的一个重要性问题。目前，杀灭食品中金黄色葡萄球菌的方法多采用添加化学食品添加剂，也有采用等离子放电，超高压，微波等物理方法。
高强脉冲电场(Pulsed Electric Field，PEF)是近年来发展起来的一种非热灭菌技术，该技术的工作原理是高电场能导致微生物细胞膜通透性增加或者直接穿孔，引起细胞内容物流出，从而导致微生物失活。与传统灭菌技术相比，其能克服传统热灭菌会造成热敏性营养物质(维生素、具有生物活性功能的蛋白质和色素等)破坏、挥发性风味物质损失、天然色泽和质构改变等缺点。
中国发明专利申请CN103653126A公布了一种脉冲电场对草莓汁进行灭菌的方法，脉冲条件为：强度20～35kV/cm，脉冲宽度2μs，脉冲频率200Hz下，草莓汁杀菌处理100～300μs；中国发明专利申请CN1014854484A公布了一种脉冲电场对浓缩苹果汁进行灭菌的方法，脉冲强度为5～100kV/cm，脉冲频率1～120Hz，脉冲数2～150个；中国发明专利申请CN1718031A公开了一种采用脉冲电场杀菌技术生产无糖茶饮料的方法，在脉冲场强为15～45kV/cm，处理40～160μs可较好的保留茶饮料的品质。以上三个现有技术的虽然均能较好的杀灭食品中的微生物，但是实施条件能耗高，受电导率的影响大，同时造成物料发热。
中国发明专利申请CN105581219A公开了一种枸杞干果的联合脉冲电场和其他物理技术的杀菌方法；美国专利US005690978A公开了一种脉冲电场杀灭液态食品中的微生物的方法；该方法采用串联脉冲处理室对物料进行联合处理增强杀灭效果。但这两个方法中杀菌效果只是单一灭菌效果线性相加，而没有发挥多种手段的协同作用，而且能耗没有降低。中国发明专利申请CN103876241A公布了一种协同脉冲电场和超声波场的液态食品灭菌装置，该技术利用超声波的空化效应，加大脉冲电场对细胞壁和细胞膜的电穿孔效果。但该方法实验规模小，要实现工业化应用仍有很多的不足之处。
综上所述，现有杀灭金黄色葡萄球菌的不足之处在于：
1)化学法有残留，且抑菌物质加入到食品中会带来二次污染和食品安全问题；热灭菌方法能耗高，造成热敏营养成分的损失和风味外观的变化。
2)单纯脉冲电场灭菌法不彻底，能耗大，对设备条件高，实现完全灭菌所需的电场强度通常较高或者处理时间加大，显著增加设备的负载，减低部件使用寿命。并且引起能量的过度损耗，以及可能导致处理的物料发热严重，破坏热敏性营养成分。
3)单一手段灭菌方法对革兰氏阳性菌杀灭作用有限，特别是金黄色葡萄球菌等具有厚厚的外膜，需要寻求高效低耗的协同灭菌手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于柑橘柚皮素与高强脉冲电场协同杀灭金黄色葡萄球菌的方法，旨在进一步增强现有高强脉冲电场对金黄色葡萄球菌的灭菌效率，降低脉冲电场条件，且减少亚致死菌数量，实现有效低温灭菌。
本发明实现协同灭菌的原理在于：
在灭菌操作之前在溶液中添加一定量的柚皮素进行预处理，柚皮素能够导致金黄色葡萄球菌细胞膜脂肪酸成分一定程度上改变，引起金黄色葡萄球菌细胞膜中支链脂肪酸isoC15:0和anteisoC15:0含量增加，饱和的直链脂肪酸C16:0和C18:0含量降低，使得细胞膜流动性和通透性增加，促进了脉冲电场的击穿膜的效果。根据金黄色葡萄球菌的迭代繁殖时间，选择繁殖1-2代进入对数生长期为最佳时机，因为此时所加入的柚皮素已经对细胞膜脂肪酸进行了修饰，改变了其流动性。
第二，高强脉冲电场能够导致金黄色葡萄球菌细胞膜穿孔，促进柚皮素的进入；柚皮素的跨膜行为发生后，能够进行细胞内靶向作用，结合至生物大分子并发生相互作用，引起基因组DNA和关键酶的结构和功能发生改变，影响细胞生长繁殖和分裂，导致金黄色葡萄球菌细胞死亡。
本发明目的通过如下技术方案实现：
柑橘柚皮素与高强脉冲电场协同杀灭金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：
1)在待灭菌的含金黄色葡萄球菌的液态食品中加入柚皮素预处理；
2)对步骤1)经柚皮素预处理后的物料采用高强脉冲电场进行灭菌。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述步骤(1)中待灭菌的液态食品为牛奶或果汁。
优选地，所述柚皮素添加浓度为12.5～125mg/L。
优选地，所述预处理时间为0.5～1.0h。
优选地，所述高强脉冲电场强度为20～50kV/cm。
优选地，所述步骤(2)中脉冲宽度为10～40μs，脉冲频率为0.1～1.0kHz。
优选地，所述步骤(2)中物料接受高强脉冲电场的处理时间为60～1000μs。
优选地，所述采用高强脉冲电场进行灭菌后的物料进行无菌分装保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明需要操作简单，易控制，只需要在传统的脉冲电场灭菌操作之前加入柚皮素预处理，诱导培养金黄色葡萄球菌即可。
(2)脉冲场强小，时间短，效率高。柚皮素能够使脉冲电场在更低场强和更短的时间内击穿细胞膜，造成细胞生长所需营养物质流出。另一方面，脉冲电场的膜穿透效果增强柚皮素的跨膜行为，解决的杀菌后金黄色葡萄球菌在贮藏期间继续繁殖的问题，使食品的栅栏因子增加，更加安全。
(3)低温，产热少，灭菌效果好。本发明方法解决了单一脉冲电场灭菌能耗大以及可能存在的发热问题，减少了能量的输入，使食品在低温的情况下有效杀灭金黄色葡萄球菌。
附图说明
图1为实施例1经柚皮素预处理1.0h后橙汁中金黄色葡萄球菌的菌落总数。
图2为实施例1橙汁中金黄色葡萄球菌的减少值与场强和柚皮素协同作用。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
新鲜的橙汁接种金黄色葡萄球菌使其菌落数达到108～109CFU/mL数量级；进行脉冲电场处理，其中脉冲电场处理的参数为：电场强度为45.0kV/cm，脉宽为40μs，频率为1.0kHz，时间500μs；
按照在橙汁中浓度计，柚皮素的使用量为50.0mg/L(从葡萄柚皮中提取，纯度约为95％)。
处理方式：添加柚皮素预处理1.0h后，进行脉冲灭菌。
为说明本发明的方法的效果，本实施例将本发明的方法与以下方法的杀菌效果进行对比：
处理条件：脉冲电场强度分别为0，15.0，30.0和45.0kV/cm；不加柚皮素，处理500μs；
处理条件：脉冲电场强度分别为0，15.0，30.0和45.0kV/cm，加柚皮素，浓度为12.5，25.0，37.5和50.0mg/L，处理500μs。
利用平板计数法测定橙汁中的金黄色葡萄球菌的菌落数，并通过对数法(log)分析金黄色葡萄球菌的减少量。
对比结果如图1和图2所示。从图1可知，脉冲电场强度分别为0，柚皮素浓度为12.5～50.0mg/L条件下，橙汁中金黄色葡萄球菌的菌落数没有显著的减少，说明这个浓度下的柚皮素几乎没有灭菌作用。从图2可知，不添加柚皮素条件下，脉冲电场灭菌效果随着场强的增加，在45.0kV/cm条件下达到最大，菌落数由8.6降至4.2。与单独的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的脉冲电场混合柚皮素杀菌方法对金黄色葡萄球菌的杀灭效果显著增加。当柚皮素浓度为50.0mg/L时，脉冲电场在强度为45.0kV/cm条件下杀灭效果增加3.1个对数级，金黄色葡萄球菌菌落数由8.6降至1.1。说明了两者的混合作用显著增强了灭菌效果。柚皮素的加入不仅抑制亚致死细胞的恢复，并且增加了金黄色葡萄球菌细胞膜流动性和通透性促进了脉冲电场的灭菌效果。这种混合作用对于增强脉冲电场的灭菌效果和减少能量损耗等方面重要意义。
实施例2
新鲜的芒果汁接种金黄色葡萄球菌使其菌落数达到108～109CFU/mL数量级，加入柚皮素；立即进行脉冲电场处理，其中脉冲电场处理的电参数为：电场强20.0kV/cm，脉宽为40μs，频率为0.1kHz，时间1000μs；
按照在芒果汁中浓度计，柚皮素的使用量为125.0mg/L(从葡萄柚皮中提取，纯度约为95％)。
处理方式：添加柚皮素预处理1.0h后，进行脉冲灭菌。
为说明本发明的方法的效果，本实施例将本发明的方法与以下方法的杀菌效果进行对比：
处理条件：脉冲电场强度为0，柚皮素浓度为125.0mg/L；脉冲电场强度为20.0kV/cm；不加柚皮素，处理1000μs；
利用平板计数法测定芒果汁中的金黄色葡萄球菌的菌落数，并通过对数法(log)分析金黄色葡萄球菌的减少量。
与单独的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的经过与柚皮素混合处理的脉冲电场杀菌方法对金黄色葡萄球菌的杀灭效果增加3.5个对数级。
实施例3
新鲜的牛奶中接种金黄色葡萄球菌，达到108～109CFU/mL数量级；立即进行脉冲电场处理或者加入一定浓度的柚皮素，其中脉冲电场处理的电参数为：电场强度为50.0kV/cm，脉宽为10μs，频率为1.0kHz，时间60μs；
按照在牛奶中浓度计，柚皮素的使用量为12.5mg/L(从葡萄柚皮中提取，纯度约为95％)。
处理方式：添加柚皮素预处理0.5h后，进行脉冲灭菌。
为说明本发明的方法的效果，本实施例将本发明的方法与以下方法的杀菌效果进行对比：
处理条件：脉冲电场强度为0，柚皮素浓度为12.5mg/L；脉冲电场强度为50.0kV/cm；不加柚皮素，处理60μs；
利用平板计数法测定牛奶中的金黄色葡萄球菌的菌落数，并通过对数法(log)分析金黄色葡萄球菌的减少量。
与单独的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的经过与柚皮素混合处理的脉冲电场杀菌方法对金黄色葡萄球菌的杀灭效果增加3.8个对数级。
本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。