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1、(10)申请公布号 CN 102113521 A (43)申请公布日 2011.07.06 CN 102113521 A *CN102113521A* (21)申请号 201010574932.9 (22)申请日 2010.12.06 CGMCC No.4118 2010.08.23 A01N 63/00(2006.01) A01N 43/16(2006.01) A01N 43/08(2006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01)(71)申请人 山东中烟工业有限责任公司 地址 250100 山东省济南市历城区将军路 171 号 申请人 中国农业科。
2、学院烟草研究所 (72)发明人 董小卫 申莉莉 卜晓东 王凤龙 丛亮滋 马强 王志华 赵砚棠 吴慧慧 李晓 杨金广 王永 钱玉梅 朱战营 周显升 肖协忠 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 杨琪 (54) 发明名称 一种抗植物病毒制剂及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种抗植物病毒制剂， 是由以 下组分组成的 ： 荧光假单胞菌CZ培养液， 吐温20， 其中， 荧光假单胞菌 CZ 培养液中， 荧光假单胞菌 CZ 的活菌数为 200 亿孢子 / 毫升， 吐温 20 的质量 占制剂总质量的 0 5 ； 所述荧光假单胞菌 CZ 命名为 Pseudomonas 。
3、fluorescens， 已于 2010 年 08 月 23 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理 中心， 其保藏编号为 CGMCC No.4118。本发明的抗 植物病毒制剂能够用于治疗植物病毒， 还能够对 操纵工具上的病毒进行消杀， 促进作物的生长。 本 发明的抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、 抑制 病毒复制增殖和诱导寄主抗性的能力 ； 防效 80 以上。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102113521 A1/1 页 2 1. 一种抗植物病毒制剂， 其特征在于，。
4、 是由以下组分组成的 ： 荧光假单胞菌 CZ 培养液， 吐温 20， 其中， 荧光假单胞菌 CZ 培养液中， 荧光假单胞菌 CZ 的活菌数为 200 亿孢子 / 毫 升， 吐温 20 的质量占制剂总质量的 0 5 ； 所述荧光假单胞菌 CZ 命名为 Pseudomonas fluorescens， 已于 2010 年 08 月 23 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 其保藏编 号为 CGMCCNO.4118。 2. 根据权利要求 1 所述的一种抗植物病毒制剂， 其特征在于 ： 所述吐温 20 的质量占制 剂总质量的 1 5。 3. 根据权利要求 1 所述的一种抗植物病毒制剂， 其特征在。
5、于 ： 所述吐温 20 的质量占制 剂总质量的 3。 4. 权利要求 1 或 2 或 3 所述的一种抗植物病毒制剂在治疗植物病毒病中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述制剂在抑制烟草病毒病中的应用。 6. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述制剂在抑制烟草 TMV 病毒病中的应 用。 7. 权利要求 1 或 2 或 3 所述的一种抗植物病毒制剂在杀灭植物病毒中的应用。 8. 权利要求 1 或 2 或 3 所述的一种抗植物病毒制剂在促进作物生长中的应用。 9. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述作物为烟草。 权 利 要 求 书 C。
6、N 102113521 A1/4 页 3 一种抗植物病毒制剂及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种抗植物病毒制剂及其应用。 背景技术 0002 病毒病是农作物的重要病害之一。目前， 抗植物病毒剂的防治效果或安全性还不 理想， 远远不能满足农业的需求， 急需开发新型抗病毒制剂。尽管化学农药现在仍占主体， 但从可持续发展的角度考虑， 发展能产生高效、 高活性的生物源抗病毒剂是实现产业化生 物防治中的关键任务。 0003 中国文献 ：一种细菌蛋白CZ控制烟草花叶病毒(TMV)的作用机理初探 ， 吴惠惠， 王凤龙， 申莉莉， 植物保护， 第 34 卷第 3 期 (2008)， 74-77 页， 。
7、记载了一种荧光假单胞菌 CZ 对烟草花叶病毒 (TMV) 具有拒抗作用， 但其仅是机理研究， 并未将其制成适用于工业化生 产和应用的制剂， 其实际应用存在难题。 发明内容 0004 针对上述现有技术， 本发明提供了一种抗植物病毒制剂， 及其应用。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0006 一种抗植物病毒制剂， 是由以下组分组成的 ： 荧光假单胞菌 CZ 培养液， 吐温 20， 其 中， 荧光假单胞菌 CZ 培养液中， 荧光假单胞菌 CZ 的活菌数为 200 亿孢子 / 毫升， 吐温 20 的 质量占制剂总质量的 0 5 ( 当吐温 20 的质量为 0时， 即 ： 不含有吐温 20。
8、) ； 所述荧光 假单胞菌CZ命名为Pseudomonas fluorescens， 已于2010年08月23日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏编号为 CGMCCNO.4118。 0007 优选的， 所述吐温 20 的质量占制剂总质量的 1 5， 最优选的为 3。 0008 所述抗植物病毒制剂在制备时， 将吐温20添加到荧光假单胞菌CZ培养液中， 混匀 即可。 0009 所述抗植物病毒制剂能够用于治疗植物病毒病， 特别是烟草的 TMV 病毒病。 0010 所述抗植物病毒制剂还能够对操纵工具上的病毒进行消杀， 降低病害传播。 0011 所述抗植物病毒制剂还能够促进作物。
9、的生长， 尤其是烟草。 0012 本发明所涉及的荧光假单胞菌 CZ， 其培养方法、 生物特性、 活性物质等， 已经公开， 记载在中国文献 ：拮抗TMV细菌CZ的最佳发酵条件及其活性物质的初步研究 ， 吴惠惠， 王 凤龙， 陈德鑫， 中国烟草科学， 2009， 30(1) ： 50-53 页。因此， 在此不再赘述。 0013 本发明的及抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、 抑制病毒复制增殖和诱导寄主抗 性的能 力 ； 防效 80以上。在作物 ( 烟草为主 ) 病毒病防治方面， 具有很高的应用价值。 虽然荧光假单胞菌CZ能够抗TMV的特性已经公开， 但本发明将其制备成适于工业化应用的 制剂， 配方中，。
10、 荧光假单胞菌 CZ 和吐温 20 都对 TMV 有抑制作用， 且吐温 20 可使非可培养状 态菌恢复到可培养状态， 增加菌的数量， 能够起到协同的作用。吐温 20 的用量为发明人经 大量实验筛选后得出的优选的最佳的用量， 当吐温 20 的质量占制剂总质量 3时， 其效果 说 明 书 CN 102113521 A2/4 页 4 最佳。 附图说明 0014 本发明的荧光假单胞菌 CZ 命名为 Pseudomonas fluorescens， 已于 2010 年 08 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏编号为 CGMCCNO.4118， 保藏地址为 ： 北京市朝。
11、阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所， 邮编 ： 100101。 0015 图 1 为实施例 1 中 CZ 对 TMV 的作用方式示意图。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 0017 实施例 1CZ 制剂对 TMV 的作用 0018 取 5-6 叶期三生 NN 烟， 做以下处理 ： 如图 1 所示。 0019 1( 诱导 ) ： 接种前 24h， 分别喷施 CZ、 NB、 水， 每株 10ml， 接种 TMV+ 水。 0020 2( 钝化 ) ： CZ、 NB、 水， 分别与 TMV 混合后 15min 接种。 0021 3( 抑制 ) ： 接种 TMV+ 水。
12、， 24h 后， 分别喷施 CZ、 NB、 水， 每株 10ml。 0022 接种后 3-5 天， 统计各处理枯斑数， 计算枯斑抑制率。结果如表 1 所示。 0023 0024 表 1CZ 对 TMV 的作用方式测定 ( 防效 ) 0025 0026 通过表 1 看出， CZ 对 TMV 的作用方式， 以钝化作用最为显著， 防效为 99.08， 诱导 作用次之， 防效 95.39 ； 抑制作用防效最低也有 88.42。 0027 实施例 2CZ 制剂对剪刀的消毒作用 0028 灭菌的剪刀在 80 倍的 TMV 汁液中 (1g 病叶研磨， 加入 80ml 无菌水 ) 浸泡 30s， 取 出后分别。
13、在 CZ、 NB、 水中浸泡 10s， 在 5-6 叶期普通烟 NC89 上， 剪上部 3 片叶。每个处理 9 株， 3 次重复， 每剪一株浸泡一次病毒汁液和处理液， 15 天后调查病情指数， 结果如表 2 所 示。 0029 表 2CZ 制剂对剪刀的消毒作用 0030 说 明 书 CN 102113521 A3/4 页 5 0031 通过表2看出， CZ制剂对剪刀均有消毒作用， 病情指数分别为0.41， 均低于无菌水 处理 8.64 ； 发病率为 3.70， 防效为 95.25， 明显高于 NB 培养基和无菌水处理。 0032 实施例 3CZ 制剂对烟草促生作用 0033 4-5 叶期 NC。
14、89， 小花盆移栽缓苗 5d， 做以下处理 ： 分别用清水、 NB 培养基、 CZ 制剂 10ml 灌根， 连续灌根 3 次， 每次间隔 5d， 每处理 6 株， 3 次重复。15d 后测量鲜重及最大叶长 宽， 结果如表 3 所示。 0034 表 3CZ 制剂对 NC89 的促生作用 0035 0036 由表 3 可见， CZ 灌根对 NC89 有促生作用， 最大叶长、 宽、 鲜重均高于清水对照， 差 异极显著。 0037 实施例 4CZ 制剂的配制 0038 CZ、 NB、 水， 分别添加吐温 20， 吐温 20 终浓度分别为 5、 3、 1、 0。5-6 叶期 三生 NN 烟， 接种前 2。
15、4h 喷施上述处理， 每株 10ml， 统计枯斑抑制率， 结果如表 4、 表 5 所示。 0039 表 4 吐温 20 对 CZ 发酵液抑制 TMV 作用效果的影响 ( 平均枯斑数 ) 0040 0041 表 5 吐温 20 对 CZ 发酵液抑制 TMV 作用效果的影响 ( 枯斑抑制率 ) 0042 说 明 书 CN 102113521 A4/4 页 6 0043 通过表 4 看出， 添加吐温 20， 本身对 TMV 有抑制作用， 水中添加吐温终浓度 5时， 枯斑数为 52.3， 而不添加吐温 20 枯斑数为 170， ( 表 4)。可见吐温本影响了病毒粒子的侵 入。 0044 CZ 发酵液中。
16、添加吐温 20， 并不影响 CZ 对 TMV 的作用， 可以考虑 CZ 菌体发酵液制 剂工艺中， 采用吐温 20 为扩展剂。吐温 20 是结合月桂酸的聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯， 为非离子型的表面张力物质， 是常见的助溶剂。它是一类大分子， 分子上既有亲水的部门， 又有亲油的部门， 能增进植物吸收在水中不能消融的大分子， 也能帮助水分透过一些含脂 高的生物膜。农药制剂中加入吐温 20， 起湿润分散作用， 使其他物质在溶液中均匀分散， 增 加乳剂的稳定性。 在溶液中可干扰抑菌剂的作用， 使非可培养状态菌恢复到可培养状态， 增 加菌的数量， 起到稳定菌的作用， 且对菌所产生的蛋白起到保护作用。 0。
17、045 吐温 20 终浓度为 5时， 叶片有轻微药害， 因此， 用吐温做菌剂扩展剂的时候， 吐 温 20 终浓度控制在 5以下。所以最终确定添加吐温 20 终浓度为 3制成 CZ 菌体制剂。 0046 以上实施例中， CZ 制剂、 CZ 发酵液中， 荧光假单胞菌 CZ 的活菌数为 200 亿孢子 / 毫升， CZ 制剂、 CZ 发酵液的获得， 均是通过现有技术得到的， 如采用 “中国文献 ：拮抗 TMV 细菌 CZ 的最佳发酵条件及其活性物质的初步研究 ， 吴惠惠， 王凤龙， 陈德鑫， 中国烟草科 学， 2009， 30(1) ： 50-53 页” 中的方法即可得到， 因此在此不再赘述。 说 明 书 CN 102113521 A1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 。