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1、(10)申请公布号 CN 104303866 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104303866 A (21)申请号 201410654050.1 (22)申请日 2014.11.18 A01G 7/00(2006.01) A01G 7/06(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 李韬 李磊 郑飞 董晶晶 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 代理人 戴朝荣 (54) 发明名称 一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鉴定和评价小麦赤霉病扩 展抗性。
2、的方法， 该发明的基本特征是在小麦抽穗 后， 将赤霉菌孢子液注射到穗下节间茎秆内部而 非滴入小花， 根据第 1 病小穗出现的时间以及接 种后第 22-25 天的病小穗率， 综合评价小麦的赤 霉病扩展抗性。该发明最大的优点是不论在大田 或温室环境， 接种后均无需采取保湿措施， 解决了 传统单花滴注法鉴定需要套袋或喷雾、 喷水等保 湿的问题。 与传统单花滴注法相比， 该发明接种效 率更高但成本更低， 提高了发病普遍率， 并使品种 抗、 感表型差异最大化， 更有利于普通技术人员判 断小麦品种的赤霉病扩展抗性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识。
3、产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104303866 A CN 104303866 A 1/1 页 2 1. 一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 在小麦抽穗后， 将制备好 的赤霉菌孢子液接种到小麦茎秆内部， 记载接种点褐化情况， 并记载从接种到第 1 病小穗 出现的时间， 在接种后第 22-25 天统计病小穗率， 评价小麦的赤霉病扩展抗性。 2. 根据权利要求 1 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 将制备好的赤霉菌孢子液接种到茎秆内部是指利用医用注射器和注射针， 将赤霉菌孢子液 直接注射到紧临。
4、穗基部小穗下面的茎秆内腔， 在穗下节间紧靠基部小穗处用防水标签标注 接种日期和菌株名称。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所 述的赤霉菌孢子液的制备是从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器， 取 3-5 块带有赤霉菌株的 PDA 固体培养基放入 150mL 经过灭菌的绿豆汤液体培养基中， 然后 置于摇床上， 在 180rpm、 温度 25 -28的条件下摇 72-120 小时， 取样， 观察产孢情况并吸 取 1uL 孢子液， 滴到血球计数板上， 置于显微镜下测定孢子浓度， 然后将经过摇床产孢的孢 子液稀释或浓缩到 100 孢。
5、子 /mL 至 200 孢子 /mL。 4. 根据权利要求 1 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 记载接种点褐化情况是指在接种 3-5 天后观察记载接种点的褐化情况。 5. 根据权利要求 1 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 第 1 病小穗指位于接种点上面首次出现赤霉病病症的小穗。 6. 根据权利要求 1 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 在接种后第 22-25 天统计病小穗率， 具体日期根据接种之日起 20 天内的平均气温情况决 定， 当平均气温高于 25， 则在接种后第 22-23 天统计病小穗。
6、率 ； 当平均气温低于 25， 则 在接种后第 24-25 天统计病小穗率。 7. 根据权利要求 6 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 在接种后第22-23天统计病小穗率， 若在接种之日的上午接种， 则在第22天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 23 天统计病小穗率。 8. 根据权利要求 6 所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 在接种后第24-25天统计病小穗率， 若在接种之日的上午接种， 则在第24天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 25 天统计病小穗率。 9. 根据权利要求 1 所述的鉴定和评。
7、价小麦赤霉病扩展抗性的方法， 其特征是 ： 所述的 评价小麦的赤霉病扩展抗性的依据是从接种当日起到第 1 病小穗出现的时间和接种后第 22-25 天统计的病小穗率。 权 利 要 求 书 CN 104303866 A 2 1/4 页 3 一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法 技术领域 0001 本发明属于植物抗病鉴定评价技术领域， 具体地说属于一种鉴定和评价小麦赤霉 病扩展抗性的方法。 背景技术 0002 目前赤霉病扩展抗性评价采用的主流方法是单花滴注法鉴定， 即在小麦扬花期对 穗部的其中一个小花注射孢子液， 标记接种时间， 然后借助套塑料袋保持湿度， 72 小时后撕 破或去掉塑料袋 ； 或借。
8、助提前安装好的喷雾或喷水设备， 在接种后定时喷雾或喷水保湿， 在 接种后 18-21 天， 统计发病率， 即病小穗占总小穗数的百分比进行抗病性评价。塑料套袋效 率极低， 同时容易损毁接种单株， 若气温很高， 导致袋内高温烧死接种麦穗， 而且套袋的塑 料不可避免造成环境污染， 因此成本高 ； 迷雾或喷雾系统一般适合在室内或温室条件下小 规模的鉴定， 后者受制于孢子浓度和环境条件， 在温湿度适宜情况下， 可能导致许多小穗同 时发病， 会造成抗病品种变感病的假象 ； 高温高湿有利于发病， 在病原菌选择压较轻或者温 湿度不适合的情况下， 往往造成感病品种变抗病的假象。因此只能分析品种抗性的大致情 况，。
9、 鉴定的一致性、 稳定性较差， 导致精确的表型鉴定非常困难， 因此往往需要多年多点的 鉴定评价， 极大消耗物力、 人力和财力， 成本高昂且往往难以成功。 发明内容 0003 本发明的目的在于克服传统单花滴注法评价赤霉病抗性中需要保湿措施、 受环境 影响明显、 评价结果重现性差等缺点， 提供一种无需保湿措施的， 可在大田和温室环境条件 下有效、 可靠的评价赤霉病抗性的方法。 本发明的方法在现有技术中均尚未有报道， 是一种 全新的可简易、 快速评价赤霉病抗性的方法。 0004 本发明的技术方案是通过在小麦抽穗后， 将制备好的赤霉菌孢子液接种到小麦茎 秆内部， 记载接种点褐化情况， 并记载从接种到第。
10、 1 病小穗出现的时间， 在接种后第 22-25 天统计病小穗率， 依据第 1 病小穗出现的时间和病小穗率来评价小麦的赤霉病扩展抗性。 0005 本发明的具体步骤、 流程和基本特征是 ： a) 从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器， 取 3-5 块带有赤霉菌 株的 PDA 固体培养基放入 150mL 经过灭菌的绿豆汤液体培养基中， 然后置于摇床上， 在 180rpm、 温度 25 -28的条件下摇 72-120 小时， 取样， 观察产孢情况并吸取 1uL 孢子液， 滴到血球计数板上， 置于显微镜下测定孢子浓度， 然后将经过摇床产孢的孢子液稀释或浓 缩到 100 孢子 /mL 至 。
11、200 孢子 /mL， 得到用于接种到小麦茎秆内部的赤霉菌孢子液。 0006 b) 在小麦抽穗后到灌浆期利用医用注射器和注射针， 将制备的赤霉菌孢子液直接 注射到穗下节间茎秆内部， 不同于单花滴注法方法的滴入小花。然后在穗下节间紧靠倒 1 小穗处贴上防水标签， 标签上记载接种日期和菌株名称。 无需借助塑料套袋或喷雾、 喷水等 措施保湿。 0007 c) 在接种 3-5 天后观察记载接种点的褐化情况。 说 明 书 CN 104303866 A 3 2/4 页 4 0008 d) 记载从接种到第 1 病小穗出现的时间。 0009 e) 接种后第 22-25 天记载病小穗率， 具体日期根据接种之日起。
12、 20 天内的平均气 温情况决定， 当平均气温高于 25， 则在接种后第 22-23 天统计病小穗率 ； 当平均气温低于 25， 则在接种后第 24-25 天统计病小穗率。 0010 所述的在接种后第 22-23 天统计病小穗率， 若在接种之日的上午接种， 则在第 22 天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 23 天统计病小穗率。 0011 所述的在接种后第 24-25 天统计病小穗率， 若在接种之日的上午接种， 则在第 24 天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 25 天统计病小穗率。 0012 f)依据接种当日起到第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天。
13、统计的病小穗 率综合评价小麦赤霉病扩展抗性。 0013 判断赤霉病扩展抗性评价方法体系的优劣的主要技术指标有 ： 是否受温湿度等气 候环境影响大， 即评价结果的稳定性和一致性 ； 发病的普遍率， 赤霉菌是腐生菌， 只要接种 方法得当且温湿度适宜， 理论或理想发病普遍率应达 100% ； 表型差异最大化， 适宜普通技 术人员判别 ； 对受体的破坏性以及是否环境友好 ； 接种方法的易操作性、 效率和成本 ； 对比传统的单花滴注法包括结合套袋、 喷雾保湿的方法， 和本发明在上述 5 个技术指 标方面的差异， 得出本发明方法的优势和积极效果为 ： （1） 单花滴注法易受外界湿度的影响， 重复间相关系数。
14、通常介于 0.2-0.7 之间 ； 本发明 直接将孢子液注射到穗下节间茎秆内部， 发病的湿度由植株体内来保证， 无需套袋或喷雾 （水） 来保湿， 提高了稳定性和一致性， 重复间相关系数大于 0.85 ； （2） 在无保湿措施且气候干燥的条件下， 本发明接种方法穗部发病普遍率显著高于单 花滴注法， 单花滴注法普遍率一般为 50-80%， 本发明达到 90-100% ； 单花滴注法在有保湿措 施的条件下， 本发明和单花滴注法的发病普遍率没有显著差异 ； （3） 单花滴注法主要根据发病小穗数占总小穗数的百分比衡量， 因此是一种数量化度 量， 在孢子浓度高且高温高湿条件下， 即高选择压下， 单花滴注法。
15、可使抗病和感病品种的多 个小花或小穗同时感染病菌， 缩小了抗、 感品种的差异， 即容易出现抗性品种的假感性 ； 在 孢子浓度低或在气候干燥且无保湿条件下， 单花滴注法同样可使抗病和感病品种表型差异 缩小， 易导致感病品种的假抗性， 从而影响评价品种本来真实的抗性情况 ； 而本发明通过 观察接种点上部小穗是否出现病症， 出现为感， 不出现为抗， 使不同抗感品种表型差异最大 化， 更易于普通技术人员判断品种的抗性， 同时也可在接种后 22-25 天计算病小穗率 ； （4） 传统单花滴注法在塑料套袋保湿情况下， 若气温很高， 导致袋内高温烧死接种麦 穗， 同时烧死病原菌， 导致接种失败， 同时塑料袋。
16、中水分积聚充满空气， 穗头承重增加， 导致 在大风天气很容易折断接种穗， 而且袋子本身对环境存在白色污染 ； 而本发明无需套袋保 湿， 因此不存在破坏受体穗和污染环境的情况 ； （5） 传统单花滴注法往往需要结合套袋、 迷雾或大田喷雾设施进行保湿， 因此增加额外 成本 ； 而本发明无需上述设施， 因此成本低、 接种效率高， 比在用塑料套袋保湿方法快 4-5 倍， 普通技术人员培训后即可实施。 具体实施方式 0014 本发明对已知的公认的高抗赤霉病品种 NP154 和高感赤霉病品种 NP516， 在大田 说 明 书 CN 104303866 A 4 3/4 页 5 无保湿情况下使用本发明进行赤霉。
17、病接种和抗性评价情况。根据接种后第 1 病小穗出现的 时间以及统计的病小穗率两个指标上评价其抗性材料间的抗性差异。 0015 为了更好的理解该发明实施方式， 我们列出了该发明的实验材料信息 ： NP154 是 中国高抗赤霉病品种， 该品种携带赤霉病抗性基因， 而 NP516 是美国引进的感赤霉病病品 种， 不携带任何已知抗赤霉病基因。在单花滴注法且有保湿的情况下， NP154 的病小穗率介 于 0.05-0.16， 而 NP516 后者介于 0.75-1.00 间。 0016 本发明鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法的步骤是 ： 从经过活化的赤霉菌株 固体平板培养基上利用圆盘取样器， 取 3-。
18、5 块带有赤霉菌株的 PDA 固体培养基放入 150mL 经过灭菌的绿豆汤液体培养基中， 然后置于摇床上， 在 180rpm、 温度 25 -28的条件下摇 72-120 小时， 取样， 观察产孢情况并吸取 1uL 孢子液， 滴到血球计数板上， 置于显微镜下测 定孢子浓度， 然后将经过摇床产孢的孢子液稀释或浓缩到 100 孢子 /mL 至 200 孢子 /mL， 得 到用于接种到小麦茎秆内部的赤霉菌孢子液。 在小麦抽穗后到灌浆期利用医用注射器和注 射针， 将制备的赤霉菌孢子液直接注射到穗下节间茎秆内部， 然后在穗下节间紧靠倒 1 小 穗处贴上防水标签， 标签上记载接种日期和菌株名称， 无需借助。
19、塑料套袋或喷雾、 喷水等措 施保湿。在接种 3-5 天后观察记载接种点的褐化情况。记载从接种到第 1 病小穗出现的时 间。接种后第 22-25 天记载病小穗率， 具体日期根据接种之日起 20 天内的平均气温情况决 定， 当平均气温高于 25， 则在接种后第 22-23 天统计病小穗率 ； 当平均气温低于 25， 则 在接种后第 24-25 天统计病小穗率。所述的在接种后第 22-23 天统计病小穗率， 若在接种 之日的上午接种， 则在第 22 天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 23 天统计 病小穗率。 所述的在接种后第24-25天统计病小穗率， 若在接种之日的上午接种， 则。
20、在第24 天统计病小穗率 ； 若在接种之日的下午接种， 则在第 25 天统计病小穗率。依据接种当日起 到第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天统计的病小穗率综合评价小麦赤霉病扩展 抗性。 0017 在大田无保湿情况下使用本发明进行赤霉病接种和抗性评价情况， 根据接种后第 1 病小穗出现的时间以及统计的病小穗率两个指标上评价其抗性材料间的抗性差异， 经过 实验验证， 得到的结果是 ： （1） 接种点褐化时间 ： 接种点褐化情况是衡量接种是否成功的重要指标， 接种成功的话 则出现褐化， 接种失败则不出现褐化， 后者情况下不再记载第 1 病小穗出现的时间以及统 计后续的病小穗率， NP154 。
21、和 NP516 均在接种后第 4-5 天接种点出现褐化情况， 品种间无差 异。 0018 （2） 接种后第 1 病小穗出现的时间 ： 抗病品种 NP154 从接种之日起到接种后第 24 天， 均未有病小穗出现 ； 而 NP516 在接种后第 12-15 天在穗部出现病小穗 ； 因此从第 1 病小 穗出现的时间可有效区分抗病品种 NP154 和感病品种 NP516 在赤霉病扩展抗性方面的差 异， 使得抗、 感品种差异表型最大化。 0019 （3） 接种后第 24 天的病小穗率 ： 抗病品种 NP154 从接种之日起到接种后第 24 天， 均未有病小穗出现， 因此病小穗率等于 0 ； 而感病品种 NP516 病小穗率则介于 0.21-0.33 之 间， 因此对抗感品种进行数量化度量， 仍可有效区分 NP154 和 NP516 之间的差异。 0020 上述实验结果证明， 本发明鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法便于实施， 实 验过程快速， 鉴定方便， 使不同抗感品种表型差异最大化， 更易于普通技术人员判断品种的 说 明 书 CN 104303866 A 5 4/4 页 6 抗性， 并且无需保湿措施， 环境友好， 能够在大田和温室环境条件下准确、 有效、 可靠的评价 赤霉病抗性。 说 明 书 CN 104303866 A 6 。