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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410463148.9 (22)申请日 2014.09.12 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104304238 A (43)申请公布日 2015.01.28 (73)专利权人 贵州大学 地址 550025 贵州省贵阳市贵州大学花溪 北校区科技处 (72)发明人 潘学军 张文娥 甘专 王沙沙 (74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所 52100 代理人 吴无惧 (51)Int.Cl. A01N 3/00(2006.01) A01H 4/00(2006.0。
2、1) (56)对比文件 CN 103202225 A,2013.07.17, JP 昭59-98001 A,1984.06.06, 潘学军 等.葡萄胚挽救苗移栽技术的研究. 西北植物学报 .2004,第24卷(第6期),第1-77- 1082页. 赵艳华 等. 品丽珠 葡萄离体茎尖超低温 保存的研究. 园艺学报 .2001,第28卷(第1期), 第62-64页. 甘传 等.毛葡萄茎尖的离体培养与植株再 生. 西南农业学报 .2013,第26卷(第3期),第 1164-1167页. 审查员 江笑丹 (54)发明名称 毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法 (57)摘要 本发明公开了一种毛葡萄茎尖的包。
3、埋干燥 超低温保存方法， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)茎尖包埋干燥超低温冷冻保存： 取继代腋芽 饱满的组培苗， 在光照低温锻炼， 后剥取组培苗 腋芽茎尖， 制成茎尖包埋丸， 再将包埋丸在蔗糖 固体培养基中预培养， 干燥后的茎尖包埋丸置于 液氮中冷冻24 h以上； (2)解冻及恢复后再生培 养： 茎尖包埋丸冷冻保存后， 解冻， 然后取包埋丸 茎尖接种到恢复培养基上进行恢复培养和继代 培养得到再生茎尖;(3)生根培养： 取步骤二中的 再生茎尖置于生根培养基中进行生根培养； (4) 炼苗移栽： 将培养30-40d的生根苗的根部清洗， KMnO4浸根， 移栽至盛有灭菌蛭石的营养钵中用 1/8M。
4、S营养液浇灌， 然后放入培养室培养2-3 d后 浇灌杀菌剂， 待地上部叶色加深后转移到盛有营 养土的营养钵中继续温室锻炼， 生长23个月左 右， 翌年春移栽大田。 权利要求书1页 说明书3页 CN 104304238 B 2016.10.05 CN 104304238 B 1.一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 包括以下步骤： （1） 茎尖包埋干燥超低温冷冻保存： 取继代腋芽饱满的组培苗， 在光照低温锻炼， 后剥 取组培苗腋芽茎尖， 制成茎尖包埋丸， 再将包埋丸在蔗糖固体培养基中预培养， 干燥后的茎 尖包埋丸置于液氮中冷冻24 h以上； （2） 解冻及恢复后再生培养： 茎尖。
5、包埋丸冷冻保存后， 解冻， 然后取包埋丸茎尖接种到 恢复培养基上进行恢复培养和继代培养得到再生茎尖； （3） 生根培养： 取步骤二中的再生茎尖置于生根培养基中进行生根培养； （4） 炼苗移栽： 将培养30-40d的生根苗的根部清洗， KMnO4浸根， 移栽至盛有灭菌蛭石的 营养钵中用1/8MS营养液浇灌， 然后放入培养室培养2-3 d后浇灌杀菌剂， 待地上部叶色加 深后转移到盛有营养土的营养钵中继续温室锻炼， 生长23个月， 翌年春移栽大田； 步骤 （1） 中用于剥取茎尖的组培苗需继代60 d且腋芽饱满， 并需在光照条件下温度为 101锻炼14 d； 步骤 （1） 中茎尖包埋丸的制备及其预培养。
6、步骤： 茎尖投入含有2M甘油、 0.4M蔗糖和2.5% 海藻酸钠的MS溶液中， 然后吸取含有一个茎尖的液体转移到含有2M甘油、 0.4M蔗糖和0.1M CaCl2的MS溶液中， 室温下形成茎尖包埋丸， 而后将包埋丸在0.25molL-1、 0.5molL-1、 0.75molL-1、 1molL-1不同蔗糖梯度的固体培养基中各预培养1d。 2.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 步 骤 （2） 中恢复培养基为在MS培养基中每升添加1.5 mg的6-苄基嘌呤、 0.02 mg的吲哚丁酸、 20 g蔗糖和5 g琼脂粉， pH5.86.0。 3.根据权利要求1。
7、所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 步 骤 （2） 中恢复培养过程中， 先暗培养7 d， 后转移到光照条件下正常继代培养， 30d后检测茎 尖存活率和再生率， 茎尖以转变为绿色为存活、 最终能生成小植株为再生标准。 4.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 步 骤 （3） 中生根培养基为： 1/2MS培养基中每升添加0.15 mg吲哚丁酸、 0.2 mg吲哚乙酸、 20 g 蔗糖和5 g琼脂粉， pH5.86.0。 5.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 步 骤 （2）（3） 中培养温度为2。
8、51， 光照强度为40umols-1m-2， 光照时间为12 h/d。 6.根据权利要求1所述的一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 其特征在于： 步 骤 （4） 中采用的1/8MS营养液中添加吲哚乙酸。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104304238 B 2 毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法 技术领域 0001 本发明涉及农业科学领域， 尤其是基于包埋干燥法超低温冷冻保存毛葡萄茎尖的 方法。 背景技术 0002 超低温保存技术可实现植物种质的长期、 稳定保存。 自1991年以来， 葡萄品种超低 温保存的影响因素得到逐步研究， 赵艳华、 吴永杰 （ 园艺学报 2001年第1。
9、期第62页至64页） 利用包埋干燥法成功实现了欧洲葡萄 （Vitis vinifera） 酿酒品种 品丽珠 侧芽茎尖超低 温保存， 存活率达40%以上， 但不同品种、 不同基因型之间保存成活率存在较大差异， 且不同 基因型的保存技术体系存在差异， 尤其是野生葡萄资源的超低温冷冻没有研究。 0003 毛葡萄 （Vitis heyneana Roem. & Schult.） 又名绒毛葡萄、 五角叶葡萄， 在我国 华中、 华东、 西南、 华南北部、 西北的陕、 甘及华北的山西均有分布， 是分布最为广泛的野生 葡萄种类之一。 毛葡萄抗性强、 适应性好， 既是葡萄嫁接栽培的优良抗性砧木， 与栽培品种 嫁。
10、接亲和性良好， 也是酿造红葡萄酒的优良原料。 尽管我国的野生毛葡萄种类较多， 具有良 好的适应性和抗旱性， 但是由于环境变化和人类的过度开发利用， 收集与保存方式单一， 导 致毛葡萄资源流失严重， 甚至一些野生毛葡萄自然资源濒临灭绝， 这意味着其中蕴含的优 良基因及优良性状也会随之消失， 因此对野生毛葡萄种质资源的收集与保存越来越重要。 研究者虽然采用组织培养技术已经建立了毛葡萄短期离体保存的技术体系 （潘学军、 李霞、 张文娥，果树学报“离体保存对野生毛葡萄试管苗生长及叶片抗氧化酶活性的影响” ， 2013年第4期615页至620页） ， 但因在保存过程中， 需要多次继代， 耗费大量的人力物。
11、力， 且 容易发生变异， 不能达到毛葡萄长期、 安全、 稳定保存的需求。 因此， 明确毛葡萄超低温保存 的主要影响因子， 建立毛葡萄超低温保存技术体系迫在眉睫。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是： 提供一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温冷冻保存方 法， 它解决毛葡萄田间种植保存和缓慢生长法离体保存过程中耗费人力物力的缺点， 为野 生毛葡萄珍稀种质及葡萄属植物其它野生种的长期保存提供理论基础， 满足野生毛葡萄的 长期、 安全、 稳定保存。 0005 本发明的技术方案是： 一种毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 包括以下步 骤： 0006 （1） 茎尖包埋干燥超低温冷冻保存： 取继代腋芽。
12、饱满的组培苗， 在光照低温锻炼， 后剥取组培苗腋芽茎尖， 制成茎尖包埋丸， 再将包埋丸在蔗糖固体培养基中预培养， 干燥后 的茎尖包埋丸置于液氮中冷冻24 h以上； 0007 （2） 解冻及恢复后再生培养： 茎尖包埋丸冷冻保存后， 解冻， 然后取包埋丸茎尖接 种到恢复培养基上进行恢复培养和继代培养得到再生茎尖； 0008 （3） 生根培养： 取步骤二中的再生茎尖置于生根培养基中进行生根培养； 说 明 书 1/3 页 3 CN 104304238 B 3 0009 （4） 炼苗移栽： 将培养30-40d的生根苗的根部清洗， KMnO4浸根， 移栽至盛有灭菌蛭 石的营养钵中用1/8MS营养液浇灌， 。
13、然后放入培养室培养2-3 d后浇灌杀菌剂， 待地上部叶 色加深后转移到盛有营养土的营养钵中继续温室锻炼， 生长23个月左右， 翌年春移栽大 田。 0010 步骤一中用于剥取茎尖的组培苗需继代60 d且腋芽饱满， 并需在光照条件下低温 (101)锻炼14 d。 0011 步骤一中茎尖包埋丸的制备： 茎尖投入含有2M甘油、 0.4M蔗糖和2.5%海藻酸钠的 MS溶液中， 然后吸取含有一个茎尖的液体转移到含有2M甘油/0.4M蔗糖h和0.1M CaCl2的MS 溶液中， 室温下形成茎尖包埋丸。 0012 步骤二中恢复培养基为在MS培养基中每升添加1.5 mg的6-苄基嘌呤、 0.02 mg的 吲哚丁。
14、酸、 20 g蔗糖和5 g琼脂粉， pH5.86.0。 0013 步骤二中恢复培养过程中， 先暗培养7 d， 后转移到光照条件下正常继代培养， 30d 后检测茎尖存活率和再生率， 茎尖以转变为绿色为存活、 最终能生成小植株为再生标准。 0014 步骤三中生根培养基为： 1/2MS培养基中每升添加0.15 mg吲哚丁酸、 0.2 mg吲哚 乙酸、 20 g蔗糖和5 g琼脂粉， pH5.86.0。 0015 步骤 （2）（3） 中培养温度为251， 光照强度为40umols-1m-2， 光照时间为12 h/d； 0016 步骤四中采用的1/8MS营养液中添加吲哚乙酸。 0017 本发明的有益效果：。
15、 与现有技术相比， 本发明采用茎尖包埋干燥法成功实现了毛 葡萄茎尖的超低温冷冻保存， 使毛葡萄茎尖的保存存活率达44%以上， 再生率达17%以上， 再 生苗生根率100%， 炼苗后移栽成活率可达100%， 解决了毛葡萄短期离体保存过程中耗费人 力物力的缺点， 成功建立野生毛葡萄超低温冷冻保存技术体系， 为野生毛葡萄珍稀种质及 葡萄属植物其它野生种的长期保存提供技术基础； 本发明方法长期、 安全、 稳定、 简单， 成本 低廉， 使用效果好， 应用前景广阔。 具体实施方式 0018 本发明的实施例1： 毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 包括以下步骤， 0019 步骤一、 茎尖包埋干燥超低温冷冻。
16、保存： 取继代60 d的毛葡萄 “花溪-9” 腋芽饱满 的组培苗， 在光照培养箱中以培养温度(101)条件下低温锻炼14 d， 在超净工作台上利 用解剖镜无菌剥取组培苗2 mm大小腋芽茎尖， 投入含有2.5% （w/v） 海藻酸钠的MS溶液(无 Ca2+， 加有2 M甘油， 0.4 M蔗糖)中， 然后吸取含有一个茎尖的液体转移到含有0.1 M CaCl2 的MS溶液 （含有2 M甘油， 0.4 M蔗糖） 中， 室温下30 min形成直径约4 mm左右的茎尖包埋丸， 后用无菌滤纸吸干包埋丸表面的液体， 再将包埋丸在0 .25molL-1、 0 .5molL-1、 0.75molL-1、 1mol。
17、L-1不同蔗糖梯度的固体培养基中各预培养1d， 后将包埋丸置于无菌 滤纸上吸取表面糖液， 在超净工作台上无菌条件下以风速0.6 ms-1干燥3 h， 再将干燥后 的茎尖包埋丸10个一组置于1.8 mL冷冻管中， 最后快速置于液氮中冷冻24 h以上； 0020 步骤二、 解冻及恢复后再生培养： 茎尖冷冻保存24 h后， 从液氮中快速取出冷冻 管， 在40水浴锅中解冻3 min， 然后于超净工作台上直接取包埋丸茎尖接种到MS+BA1.5 mgL-1+IBA0.02 mgL-1的培养基上进行恢复培养和继代增殖培养。 恢复培养过程中， 先 说 明 书 2/3 页 4 CN 104304238 B 4 。
18、暗培养7 d， 后转移到光照条件下正常继代培养， 培养温度为251， 光照强度为40 umols-1m-2， 光照时间为12 h/d。 30d后茎尖存活率为44%， 再生率为17%。 0021 步骤三、 生根培养： 取步骤二中的再生茎尖置于再生芽适宜生根的培养基1/2MS+ IBA0.15 mgL-1+IAA0.2 mgL-1上进行生根， 培养温度为251， 光照强度为40 umol s-1m-2， 光照时间为12 h/d； 30 d后生根率可达100%； 0022 步骤四、 炼苗移栽： 将培养3040 d的生根苗的根部用自来水清洗干净， 然后在超 净工作台上用0.1% KMnO4浸根10 s。
19、， 移栽至盛有灭菌蛭石的营养钵中用1/8 MS营养液浇灌 （以后每隔7 d浇1次） ， 每次100 mL， 并加盖与营养钵同样大小的塑料杯以保持湿度， 然后放 入培养室培养23 d后浇灌杀菌剂 （以后每隔7 d浇1次） 。 培养室温度为251， 培养过 程中以塑料杯开口大小来调节培养湿度， 待地上部叶色加深后转移到盛有营养土的营养钵 中继续温室锻炼， 生长23个月左右， 翌年春移栽大田， 成活率100%。 0023 本发明的实施例2： 毛葡萄茎尖的包埋干燥超低温保存方法， 包括以下步骤， 0024 步骤一、 茎尖包埋干燥超低温冷冻保存： 取继代60 d的毛葡萄 “花溪-4” 腋芽饱满 的组培苗。
20、， 在光照培养箱中以培养温度(101)条件下低温锻炼14 d， 在超净工作台上利 用解剖镜无菌剥取组培苗2 mm大小腋芽茎尖， 投入含有2.5% （w/v） 海藻酸钠的MS溶液(无 Ca2+， 加有2 M甘油， 0.4 M蔗糖)中， 然后吸取含有一个茎尖的液体转移到含有0.1 M CaCl2 的MS溶液 （含有2 M甘油， 0.4 M蔗糖） 中， 室温下30 min形成直径约4 mm左右的茎尖包埋丸， 后用无菌滤纸吸干包埋丸表面的液体， 再将包埋丸在0 .25molL-1、 0 .5molL-1、 0.75molL-1、 1molL-1不同蔗糖梯度的固体培养基中各预培养1d， 后将包埋丸置于无。
21、菌 滤纸上吸取表面糖液， 在超净工作台上无菌条件下以风速0.6 ms-1干燥3 h， 再将干燥后 的茎尖包埋丸10个一组置于1.8 mL冷冻管中， 最后快速置于液氮中冷冻24 h以上； 0025 步骤二、 解冻及恢复后再生培养： 茎尖冷冻保存24 h后， 从液氮中快速取出冷冻 管， 在40水浴锅中解冻3 min， 然后于超净工作台上直接取包埋丸茎尖接种到MS+BA1.5 mgL-1+IBA0.02 mgL-1的培养基上进行恢复培养和继代增殖培养。 恢复培养过程中， 先 暗培养7 d， 后转移到光照条件下正常继代培养， 培养温度为251， 光照强度为40 umols-1m-2， 光照时间为12 。
22、h/d。 30d后茎尖存活率为49%， 再生率为22%。 0026 步骤三、 生根培养： 取步骤二中的再生茎尖置于再生芽适宜生根的培养基1/2MS+ IBA0.15 mgL-1+IAA0.2 mgL-1上进行生根， 培养温度为251， 光照强度为40 umol s-1m-2， 光照时间为12 h/d； 30 d后生根率可达100%； 0027 步骤四、 炼苗移栽： 将培养3040 d的生根苗的根部用自来水清洗干净， 然后在超 净工作台上用0.1% KMnO4浸根10 s， 移栽至盛有灭菌蛭石的营养钵中用1/8 MS营养液浇灌 （以后每隔7 d浇1次） ， 每次100 mL， 并加盖与营养钵同样大小的塑料杯以保持湿度， 然后放 入培养室培养23 d后浇灌杀菌剂 （以后每隔7 d浇1次） 。 培养室温度为251， 培养过 程中以塑料杯开口大小来调节培养湿度， 待地上部叶色加深后转移到盛有营养土的营养钵 中继续温室锻炼， 生长23个月左右， 翌年春移栽大田， 成活率100%。 0028 “花溪-9” 及 “花溪-4” 均是从野外收集的贵州野生毛葡萄优良单株， 与栽培葡萄品 种相比， 果粒小， 含糖量较低、 含酸量较高， 风味独特， 抗病性及抗旱性强， 蕴含丰富的抗性 基因， 既可作为酿酒葡萄栽培， 也可作为抗性砧木利用。 说 明 书 3/3 页 5 CN 104304238 B 5 。