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1、(10)申请公布号 CN 103142582 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103142582 A *CN103142582A* (21)申请号 201310112169.1 (22)申请日 2013.04.02 A61K 31/352(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市龙眠大道 639 号 (72)发明人 陈君 李萍 王一方 刘静 付钰 郑云枫 周萍 (54) 发明名称 一种黄酮化合物在制备预防或治疗肿瘤药物 中的用途 (57) 摘要 本发明涉及天然药物领域， 具体涉及黄酮化 合物 g。
2、lyurallin B 在制备预防或治疗肿瘤药物 中的用途， 特别是用于制备预防或治疗黑色素瘤、 宫颈癌、 结肠癌、 乳腺癌的药物的用途。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103142582 A CN 103142582 A *CN103142582A* 1/1 页 2 1. 黄酮化合物 glyurallin B 在制备治疗和 / 或预防肿瘤的药物中的用途。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述肿瘤为黑色素瘤。
3、、 消化道肿瘤、 妇科 肿瘤。 3. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述消化道肿瘤为结肠癌， 妇科肿瘤为宫 颈癌或乳腺癌。 4. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： glyurallin B 是从甘草中提取分离的。 5. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述药物中含有 glyurallin B 的药学上 可接受的盐。 6. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述药物通过添加药学上可接受的载体 制备成各种剂型。 7. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述剂型为片剂、 锭剂、 丸剂、 胶囊剂、 散 剂、 颗粒剂、 口服液、。
4、 悬浮液、 乳剂或注射剂、 栓剂、 贴剂。 8. 甘草黄酮在制备治疗和 / 或预防肿瘤的药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 103142582 A 2 1/6 页 3 一种黄酮化合物在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及天然药物领域， 具体涉及一种黄酮化合物用于预防或治疗肿瘤的用 途。 背景技术 0002 甘草为豆科植物甘草 Glycrrhiza uralensis Fisch， 胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat， 光果甘草 Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根及根茎。味甘、 性平， 具有清热解 毒、 缓急止痛、 调和诸药。
5、之功效。现代临床常用于胃溃疡、 十二指肠溃疡、 神经衰弱、 支气管 哮喘、 血栓静脉炎等。在抗肿瘤方面， 甘草也是一种较为理想的药物， 它既能直接杀伤癌细 胞， 又能保护正常细胞防止其癌变。有文献报道， 甘草提取物可抑制 CT-26 小鼠结肠癌的生 长， 并降低顺铂引起的肾毒性Effects of the licorice extract against tumor growth and cisplatin-induced toxicity in a mouse xenograft model of colon cancer.Biol. Pharm.Bull.， 2007， Nov30.。 0。
6、003 甘草的化学成分主要包括三萜皂苷类、 黄酮类、 香豆素类、 多糖、 生物碱、 氨基酸 及微量元素等。长期以来， 由于三萜类成分 ( 如甘草酸 ) 的含量较高且生物活性较明确， 工业化生产上主要针对甘草酸进行提取纯化工作， 而提取后的药渣则被遗弃， 导致其中多 种具有生物活性的药效组分损失 甘草废渣中黄酮成分的研究 . 中草药， 2007， 38(5) ： 671-673， 而这些成分中的黄酮类具有显著的抗溃疡、 抗肿瘤、 抗氧化、 抑菌、 抗炎等药理活 性， 因此开发甘草废渣中黄酮类成分不仅实现了资源的充分利用， 也最大限度的发挥了甘 草在药用领域的作用， 使黄酮类成分为近年来的研究热点。
7、。 0004 甘草总黄酮在体内有明显的抑瘤作用， 抑瘤机制可能与其诱导肿瘤细胞凋亡密切 相关， 是通过影响肿瘤细胞内相关凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bax 蛋白的表达实现的 甘草总黄酮 诱导肝癌细胞凋亡的实验研究.广西医科大学学报， 2005， 22(2) ： 235-237。 对其单体的活 性研究发现， 异甘草素、 异甘草苷、 甘草查尔酮 A、 甘草查尔酮 E、 刺甘草查尔酮、 甘草素、 光 甘草定、 光甘草素和甘草醇等成分均具有一定的抗肿瘤作用。甘草黄酮类成分多是广谱抗 肿瘤活性成分， 对于多种癌症均有一定的抑制作用， 如人乳腺癌、 人前列腺癌、 人宫颈癌， 人 宫颈鳞状上皮癌、 人肝癌及肺。
8、癌和急性粒细胞白血病等。 0005 但是不同结构的甘草黄酮成分抗肿瘤活性差别很大， 并且对不同类型的肿瘤细胞 的杀伤力也不相同， 对正常细胞的毒性也不相同。CN102552239A( 沈阳药科大学， 2012 年 7 月 11 日 ) 中公开了从甘草药渣中制备抗肿瘤黄酮有效成分提取物， 其主要成分是 6的甘 草查尔酮A和0.7的甘草黄酮B ； 但是该文献并没有明确甘草黄酮粗提物中起到抗肿瘤活 性的单体化合物的结构。李宏智 ( 甘草查尔酮类化合物的制备及体外抗宫颈癌活性研究， 新疆医科大学硕士毕业论文， 2010 年， 30-34 页 ) 已经公开了甘草查尔酮 A 具有抗宫颈癌的 活性， 但该研。
9、究并没有公开上述成分是否还对其他类型的肿瘤具有预防或治疗的作用。而 不同类型的肿瘤细胞对药物的耐受性不同， 虽然该化合物对宫颈癌具有抑制作用， 但其对 其他肿瘤和癌症的作用是难以预料的。US20050014819A1 中公开了具有异戊二烯基类结构 说 明 书 CN 103142582 A 3 2/6 页 4 的黄酮类化合物针对具有 PPAR 受体的活性作用， 其中包括了一系列的甘草黄酮， 然而由于 现有技术中 PPAR 受体与癌症的发病机理之间并没有直接明确的联系， 对于本领域技术人 员来说， 选取哪种黄酮治疗癌症有较好的效果是无法预料的。 0006 因此， 要从众多的甘草黄酮中筛选出抗肿瘤活。
10、性高、 抗肿瘤谱广， 并且毒性低的单 体化合物并不容易， 是目前仍未解决的技术问题。 发明内容 0007 Glyurallin B 为近年来从甘草中分离纯化得到的化合物， 对其活性报道较少， 还 没有抗肿瘤活性的报道。 申请人通过大量的试验筛选， 意外发现， 该化合物具有抗肿瘤活性 高、 抗肿瘤谱广， 并且毒性低的特点， 可作为理想的抗肿瘤药物。 0008 0009 本发明的技术方案如下 ： 0010 黄酮化合物 glyurallin B 在制备治疗和 / 或预防肿瘤的药物中的用途。 0011 上述肿瘤为黑色素瘤、 消化道肿瘤、 妇科肿瘤 ； 优选地， 上述消化道肿瘤为结肠癌， 妇科肿瘤为宫颈。
11、癌或乳腺癌。 0012 优选地， glyurallin B 是从甘草中提取分离的。glyurallin B 的药学上可接受的 盐也具有与化合物一样的功效。 0013 优选地， glyurallin B 和药学上可接受的载体一起制备成各种剂型。上述剂型为 片剂、 锭剂、 丸剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒剂、 口服液、 悬浮液、 乳剂或注射剂、 栓剂、 贴剂。 0014 本发明对甘草黄酮 glyurallin B(GR6) 进行了抗肿瘤作用的活性评价试验， 并 与 licochalcone A(GR1)、 licochalcone B(GR2)、 echinatin(GR3)、 glycycouma。
12、rin(GR4)、 5-(1， 1-二甲烯丙基)-3， 4， 4-三羟基-2-甲氧基查尔酮(5-(1， 1-dimethylallyl)-3， 4， 4 -trihydroxy-2-methoxychalcone)(GR5)、 的抗肿瘤作用进行了活性比较。其中甘草黄 酮 GR5、 GR6 对小鼠黑色素瘤细胞 B16、 人宫颈癌细胞 Hela、 人结肠癌细胞 Caco-2、 人乳腺癌 细胞 MCF-7 均有明显的抑制其增殖的作用， 并随着浓度的增加抑制作用增强， 呈明显的量 效关系。GR5 对以上四种细胞的 IC50分别为 23.52M、 20.33M、 26.70M、 26.82M， GR6 。
13、对以上四种细胞的IC50分别为8.35M、 8.28M、 7.15M、 9.80M。 从药理实验结果可知， GR6 仅需要约其他黄酮三分之一甚至更低的浓度， 就可以达到其他黄酮类似或更好的抗肿 瘤作用， 具有低毒高效的效果。其中实验所用的化合物 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 为本实 验室自制， GR5、 GR6 制备方法见实施例 1、 2， 化合物 GR1、 GR2、 GR3、 GR4 的按照现有技术所公 开的方法制备得到。化合物 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5 结构式如下。 说 明 书 CN 103142582 A 4 3/6 页 5 0015 0。
14、016 附图说明 0017 图 1 为不同浓度的 GR5 和 GR6 作用 B16 细胞的抑制曲线图。 0018 图 2 为不同浓度的 GR5 和 GR6 作用 Hela 细胞的抑制曲线图。 0019 图 3 为不同浓度的 GR5 和 GR6 作用 Caco-2 细胞的抑制曲线图。 0020 图 4 为不同浓度的 GR5 和 GR6 作用 MCF-7 细胞的抑制曲线图。 0021 图 5 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 B16 细胞增殖的抑制作用 (CCK-8)。 0022 图 6 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 Hela 细。
15、胞增殖的抑制作用 (CCK-8)。 0023 图 7 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 Caco-2 细胞增殖的抑制作用 (CCK-8)。 0024 图 8 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 MCF-7 细胞增殖的抑制作用 (CCK-8)。 说 明 书 CN 103142582 A 5 4/6 页 6 0025 图 9 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 B16 细胞上清中 LDH 活性的影响。 0026 图 10 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 Hela 细胞上清中。
16、 LDH 活性的影响。 0027 图 11 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 Caco-2 细胞上清中 LDH 活性的影响。 0028 图 12 为 GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6 对 MCF-7 细胞上清中 LDH 活性的影响。 具体实施方式 ： 0029 实施例 1 0030 Glyurallin B( 化合物 GR6) 的制备方法 0031 乌拉尔甘草药材(干燥根和根茎)5kg， 用80乙醇回流提取三次， 每次3h， 合并提 取液， 浓缩得浸膏 ； 加适量水， 依次用石油醚和乙酸乙酯萃取 ； 取乙酸乙酯部位浸膏 100g， 进行硅。
17、胶柱层析， 以二氯甲烷-甲醇系统(1001、 501、 301、 201、 151、 101、 8 1、 4 1)， 梯度洗脱， 中压正相硅胶柱、 Sephadex LH-20 柱分离纯化， 分离得到化合物 GR6。 0032 化合物 GR6， 黄色针状晶体 (MeOH)。ESI-TOFMS 显示 m/z ： 423.1819M+H+， 分子量 为 422 ； 0033 1H-NMR(DMSO-d 6， 300MHz)(ppm) ： 1.63(3H， s， 3 -CH3)， 1.67(3H， s， 3 -CH3)， 1.62(3H， s， 3 -CH3)， 1.73(3H， s， 3 -CH3。
18、)， 3.23(2H， d， J 7.3Hz， 2 -H)， 3.23(2H， d， J 7.2Hz， 2 -H)， 5.17(1H， t， J 7.2Hz， 1 -H)， 5.28(1H， t， J 7.3Hz， 1 -H)， 6.44(1H， s， 6-H)， 6.66(1H， d， J 2.1Hz， 5 -H)， 6.88(1H， d， J 2.1Hz， 2 -H)， 8.23(1H， s， 2-H)， 8.33(1H， s， -OH)， 9.33(1H， s， -OH)， 10.83(1H， s， -OH)， 13.26(1H， s，-OH).13C-NMR(DMSO-d6， 75MH。
19、z)(ppm) ： 153.5(2-C)， 122.9(3-C)， 180.2(4-C)， 104.2(4a-C)， 161.8(5-C)， 92.7(6-C)， 158.7(7-C)， 110.9(8-C)， 155.2(8a-C)， 122.1(1 -C)， 113.9(2 -C)， 143.1(3 -C)， 144.4(4 -C)， 127.9(5 -C)， 120.4(6 -C)， 20.9(1 -C)， 121.1(2 -C)， 130.6(3 -C)， 17.6(3 -CH3)， 28.2(1 -C)， 122.5(2 -C)， 130.8(3 -C)， 25.4(3 -CH3) 。
20、以上波谱数据与文 献(M.Shihano， A.Henmi， Y.Matsnmoto， et al.Studies on the index compounds for HPLC analysis of Glycyrrhiza uralensisJ.Heterocycles， 1997， 45 ： 2053-2060)报道一致， 故鉴定为 glyurallin B。 0034 实施例 2 0035 5-(1， 1-dimethylallyl)-3， 4， 4 -trihydroxy-2-methoxychalcone( 化 合 物 GR5) 的制备方法 0036 胀果甘草药材(干燥根和根茎)5。
21、kg， 用80乙醇回流提取三次， 每次3h， 合并提取 液， 浓缩得浸膏 ； 加适量水， 依次用石油醚和乙酸乙酯萃取 ； 取乙酸乙酯部位浸膏 150g， 进 行硅胶柱层析， 以氯仿-甲醇系统(1001、 501、 301、 201、 151、 101、 81、 5 1)， 梯度洗脱， 中压正相硅胶柱、 Sephadex LH-20 柱分离纯化， 分离得到化合物 GR5。化 合物 GR1 纯度经高效液相检测大于 95 ( 面积归一化 )。 0037 化 合 物 GR5 ： 黄 色 针 状 晶 体 (MeOH)mp ： 110 112 。ESI-TOFMS 显 示 m/z ： 353.1393M-。
22、H-， 355.1532M+H+， 分子量为 354 ； 0038 1H-NMR(DMSO-d 6， 300MHz)(ppm) ： 1.46(6H， s， 4 -CH3， 5 -CH3)， 3.73(3H， s， 说 明 书 CN 103142582 A 6 5/6 页 7 OCH3)， 4.95(1H， d， J 10Hz， 3 -H)， 4.96(1H， d， J 17.8Hz， 3 -H)， 6.28(1H， dd， J 10Hz， 17.8Hz， 2-H)， 6.90(2H， d， J8.8Hz， 3-H， 5-H)， 7.18(1H， s， 6-H)， 7.61(1H， d， J 1。
23、5.6Hz， -H)， 7.82(1H， d， J 15.6Hz， -H)， 7.99(2H， d， J 8.8Hz， 2 -H， 6 -H)， 8.92(1H， s， -OH)， 9.13(1H， s， -OH)， 10.3(1H， s， -OH) ； 13C-NMR(DMSO-d6， 300MHz)(ppm) ： 26.8(4 ， 5 -C)， 39.9(1 -C)， 60.0(OCH3)， 110.1(3 -C)， 115.2(3 ， 5 -C)， 116.7(6-C)， 117.7(1-C)， 118.9(C-)， 129.4(1 -C)， 130.3(3-C)， 130.7(2 ， 。
24、6 -C)， 137.8(5-C)， 138.5(-C)， 147.1(2-C)， 147.3(2 -C)， 148.5(4-C)， 161.7(4 -C)， 187.2(C O)。 0039 与甘草查尔酮 A 和甘草查尔酮 B 比较， 可以确定化合物 I 上除 A 环以外的归属， 且 A 环上的取代基有 1 个 OCH3、 2 个 OH 和一个 R(C5H9)。 0040 1)7.61(1H， d， J 15.6Hz， -H) 与 138.5(-C)、 187.2(C O) 和 117.7 远程相 关， 且 117.7 的 HSQC 谱表明 117.7 为季碳， 可将 117.7 归属为 1。
25、-C ； 0041 2)-H 的化学位移为 7.82(1H， d， J 15.6Hz， -H)， 据 HMBC 谱可知和 116.7， 118.9(C-， 147.1 相关， 说明 116.7 和 147.1 应该为 2 或 6 位 C。又知化学位移为 3.73 的 H(OCH3) 和 147.1 相关， 则可确定 147.1 的 C 上有甲氧基取代， 即 2 位或 6 位上有甲氧基取 代 ； 0042 3)从HSQC谱中可看出7.18(1H， s)和116.7的C相连， 结合HMBC谱可知7.18(1H， s)与39.9(1-C)、 138.5(-C)、 147.1(2位或6位)、 148.。
26、5远程相关， 说明R可能在116.7 的邻位 (3 位或 5 位 )。148.5 的 C 上有羟基取代， 且应该归属为距离 116.7 的 C 较近的位 置 ； 0043 4) 与甘草查尔酮 A 比较可以确定取代基 R 的结构。其中 1.46(6H， s， 4 -CH3， 5 -CH3) 除与取代基自身的 C 相关外， 可看出和化学位移为 130.3 的 C 有相关。说明取代 基 R 连在 130.3 的 C 上。 0044 药效学实验例 0045 六种甘草黄酮 (GR1、 GR2、 GR3、 GR4、 GR5、 GR6) 的抗肿瘤药效学实验及结果 ： 0046 本实施例中的甘草黄酮 GR5、。
27、 GR6 由发明人制备， 其纯度经高效液相检测均大于 95 ( 面积归一化 )。 0047 实验例 1 0048 MTT 法评价两种甘草黄酮成分对肿瘤细胞增殖的抑制作用 0049 取对数生长期状态良好的细胞， 按 5000 个 / 孔取细胞悬液接种至 96 孔板， 置于细 胞培养箱中培养 (B16、 Hela 及 Caco-2 培养 12 小时， MCF-7 培养 24 小时 )， 弃上清， 然后按 以下分组给药， 设不加药组和加药组 (GR5 取 1.5 60M ； GR6 取 0.5 30M)， 每组设 3 个复孔， 培养24小时， 弃上清， 然后每孔加入150L含20MTT的培养基， 3。
28、7下继续培养 4 小时。弃上清， 每孔加入 100LDMSO( 二甲亚砜 )， 放置于微型振荡仪振荡 10min， 再置于 酶标仪上 570nm 处检测 OD 值。以细胞抑制率为纵坐标， 药物浓度的对数位横坐标， 绘制细 胞抑制曲线， 结果如图 1 图 4， 并用 SPSS 软件计算药物的 IC50值 ( 表 1)。 0050 从 表 1 可 看 出 GR5 对 B16、 Hela、 CaCo-2、 MCF-7 细 胞 株 的 24 小 时 作 用 的 IC50 25M， GR6 对上述四种肿瘤细胞株的 24 小时作用的 IC50 8M， 说明两种甘草黄 酮皆具有良好的抗肿瘤活性， 并且 GR。
29、6 的 IC50远低于其他黄酮。 说 明 书 CN 103142582 A 7 6/6 页 8 0051 表 1 GR5 及 GR6 对不同细胞的 IC50(M) 0052 0053 图 1 图 4 为两种甘草黄酮在不同给药浓度下 (GR5 分别取 1.5， 3， 6， 10， 15， 20， 30， 40， 50， 60M ； GR6 分别取 0.5， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 20， 30M) 对 B16、 Hela、 CaCo-2、 MCF-7 细 胞株作用 24 小时的生长抑制情况， 结果显示， 随着浓度的增加， 与相应不加药组比较， B16、 Hela、 CaCo-2、 。
30、MCF-7 的细胞增殖活性分别下降， 提示甘草黄酮 GR6 呈浓度依赖性抑制肿瘤 细胞细胞增殖。 0054 实验例 2 0055 CCK-8 法评价六种甘草黄酮成分对肿瘤细胞增殖的抑制作用 0056 取对数生长期状态良好的细胞， 按 5000 个 / 孔取细胞悬液接种至 96 孔板， 置于细 胞培养箱中培养 (B16、 Hela 及 Caco-2 培养 12 小时， MCF-7 培养 24 小时 )， 弃上清， 然后按 以下分组给药， 设不加药组和加药组 (GR5 取 6.25 50M ； GR6 取 2.5 10M)， 每组设 3 个复孔， 培养 24 小时， 每孔加入 CCK-8 溶液 1。
31、0L， 37下继续培养 4 小时。450nm 波长下 检测各孔 OD 值。 0057 图 5 图 8 为用 CCK-8 法评价六种甘草黄酮对 B16、 Hela、 CaCo-2、 MCF-7 细胞株 生长的抑制作用， 从结果中可以看出， 随着浓度的增加， 与相应不加药组比较， B16、 Hela、 CaCo-2、 MCF-7 的细胞增殖活性分别下降， 从另一方面印证了甘草黄酮 GR6 对肿瘤的抑制作 用具有浓度依赖性。 0058 实施验 3 0059 六种甘草黄酮成分对肿瘤细胞上清液中乳酸脱氢酶 (LDH) 活性的影响 0060 取对数生长期状态良好的细胞， 按 5000 个 / 孔取细胞悬液。
32、接种至 96 孔板， 置于细 胞培养箱中培养 (B16、 Hela 及 Caco-2 培养 12 小时， MCF-7 培养 24 小时 )， 弃上清， 然后按 以下分组给药， 设不加药组和加药组 (GR1 取 6.25 50M ； GR2 取 2.5 10M)， 每组设 3 个复孔， 培养 24 小时， 吸取细胞上清液， 用于检测上清液中 LDH 活性， 按试剂盒 ( 南京建成 生物工程研究所 ) 说明书操作。 0061 图 9 图 12 为六种甘草黄酮对 B16、 Hela、 Caco-2、 MCF-7 四种肿瘤细胞上清液中 LDH 活性的影响， 结果显示， 随着给药浓度的增加， 与相应不加药组比较， 细胞上清液中 LDH 的活性逐渐增高， 提示细胞上清中的 LDH 含量增加， 细胞受损增加， 说明甘草黄酮 GR6 具有 良好的抗肿瘤作用。 说 明 书 CN 103142582 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103142582 A 9 2/4 页 10 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103142582 A 10 3/4 页 11 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103142582 A 11 4/4 页 12 图 10 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103142582 A 12 。