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1、(10)申请公布号 CN 103598420 A (43)申请公布日 2014.02.26 CN 103598420 A (21)申请号 201310584256.7 (22)申请日 2013.11.20 A23K 1/16(2006.01) A23K 1/165(2006.01) A23K 1/14(2006.01) A23K 1/00(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区农业科学院农产品 加工研究所 地址 530007 广西壮族自治区南宁市大学东 路 174 号 (72)发明人 游向荣 李志春 张雅媛 付桂明 孙健 陆少峰 刘成梅 车江旅 万茵 李明娟 李丽 李昌宝 黎昌炎 卫。
2、萍 (74)专利代理机构 深圳市科吉华烽知识产权事 务所 ( 普通合伙 ) 44248 代理人 胡吉科 (54) 发明名称 一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制 备方法 (57) 摘要 本发明提供一种香蕉茎叶青贮的微生物复合 菌剂及其制备方法, 包括以下几个步骤 : 步骤 A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂 ; 步骤 B: 制备冻干产 朊假丝酵母 ; 步骤 C: 制备冻干单宁酶 ; 步骤 D : 依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、 产朊假丝酵母和 单宁酶 ; 步骤 E : 将所得到的复活菌剂充分搅拌 后制成复活水, 保持复活水中含菌量在 108cfu/ mL1010cfu/mL ; 步骤 F: 将香蕉茎。
3、叶切成 2-4cm 大 小, 处理至其含水量在 60%65% 左右, 将步骤 E 所 得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀, 装入发酵桶中, 压实、 密封后在常温下避光, 即可制得香蕉茎叶青 贮饲料。本发明采用以上方法, 可以变废为宝, 能 清除和钝化香蕉茎叶中不利于消化的单宁, 降低 纤维素含量, 开发出优质的青贮饲料, 产生巨大的 经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103598420 A CN 103598420 A 1/2 页 2 1. 一种用于。
4、香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂, 其特征在于, 包括 : 植物乳杆菌冻干菌 剂、 产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂。 2. 一种制备如权利要求 1 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征 在于, 包括以下几个步骤 : 步骤 A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂 : 将植物乳杆菌 NL4-10, 接种于 MRS 培养基中, 静置 培养至稳定期, 离心后去上清液, 菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后, 离心后重悬于无菌磷酸 盐缓冲液, 加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂, 预冻, 再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干 燥, 即可获得植物乳杆菌冻干菌剂 ; 步骤 B: 制备冻干产朊假丝酵母 : 将产朊假。
5、丝酵母 GIM2.148, 接种于麦芽汁培养基中, 静置培养至稳定期, 离心后去上清液, 菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后, 离心再重悬于无菌 磷酸盐缓冲液, 加入聚乙二醇和 L- 谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂, 预冻后进行冷冻干 燥, 即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂 ; 步骤 C: 制备冻干单宁酶 : 将黑曲霉 NC22 接种于查氏液体发酵培养基培养, 定性滤纸 过滤后得胞外单宁粗酶液, 再离心, 上清液为胞外单宁酶液, 将得到的上清液加入硫酸铵沉 淀, 再经蒸馏水透析除盐得到浓缩后的单宁酶液, 再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和 甘露醇的混合液作为保护剂, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 。
6、即可获得单宁酶冻 干粉剂 ; 步骤 D : 依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、 产朊假丝酵母和单宁酶 : D1 : 植物乳杆菌复活 : 用水溶解 MRS 培养基, 再加入植物乳杆菌冻干剂, 常温下复活 ; D2 : 产朊假丝酵母复活 : 用水溶解麦芽汁培养基, 加入产朊假丝酵母冻干粉剂, 常温下 复活 ; D3 : 单宁酶复活 : 在柠檬酸钠盐酸缓冲液中, 加入单宁酶冻干粉剂, 常温下复活 ; 步骤 E : 将步骤 D1、 D2 和 D3 所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水, 保持复活水中 含菌量在 108cfu/mL1010 cfu/mL ; 步骤 F: 将香蕉茎叶切成 2-4cm 大小, 处理。
7、至其含水量在 60%65% 左右, 将步骤 E 所得 的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀, 装入发酵桶中, 压实、 密封后在常温下避光, 即可制得香蕉 茎叶青贮饲料。 3. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述植物乳杆菌 NL4-10 与 MRS 培养基, 产朊假丝酵母 GIM2.148 与麦芽汁培养基的质量比均 为 1:10, 冻干单宁酶与柠檬酸钠盐酸缓冲液培养基的质量比为 2:1。 4. 如权利要求 3 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述查氏液体发酵培养基含质量分数 2% 的单宁酸。 5. 如权利要求 2 所述的用于。
8、香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述步骤 A 和步骤 B 中, 静置培养的温度为 37和 28, 时间均为 36 小时。 6. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述步骤 C 中, 培养的温度为 30, 速率为 120r/min, 时间为 72 小时。 7. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述步骤 A 和步骤 B 中, 离心的温度为 4, 时间为 10 分钟, 速度为 10000g, 无菌磷酸盐的 pH 值为 6.5。 权 利 要 求 书 CN 103598420 A 2 2/。
9、2 页 3 8. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 所 述步骤 A、 B 和 C 中的预冻方法包括 : -20预冻 2 小时后, -80再预冻 8 小时, 预冻后放入 冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 冷阱温度为 -60, 真空度为 4-6Pa, 真空冷冻干燥时间为 16 小时。 9. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 步 骤 A 中, 所述脱脂乳溶液的质量浓度为 10%, 所述步骤 C 中, 硫酸铵沉淀的浓度为 2mol/mL, 与胞外单宁酶液的体积比 5%。 10. 如权利要求 2 所述的用于香蕉茎叶青贮的微。
10、生物复合菌剂的方法, 其特征在于, 步 骤 B 中的保护剂中聚乙二醇的体积比为 1%, L- 谷氨酸钠的质量分数为 7% ; 所述步骤 C 中的 保护剂中聚乙二醇和甘露醇的混合液与浓缩后的单宁酶液体积比均为 1%。 权 利 要 求 书 CN 103598420 A 3 1/4 页 4 一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物饲料添加剂领域中的复合菌剂及其制备方法, 尤其涉及一 种用于香蕉茎叶青贮饲料中的微生物复合菌剂及其制备方法。 背景技术 0002 青贮饲料就是把青 (半干) 饲料装入青贮窖内, 在厌氧条件下, 靠乳酸菌发酵制成 能长期保存的饲料。
11、。这种饲料能有效地保存青绿植物的营养成分, 保证原料青绿时的鲜嫩 汁液, 气味芳香, 质地柔软, 适口性强, 采食量高, 内含营养物质的消化利用率最高。实践证 明, 青贮饲料是科学养畜, 特别是饲养反刍家畜必不可少的基础饲料。 0003 青贮饲料经过厌氧微生物发酵后, 营养物质得以保存, 而且在发酵过程中微生物 的活动可以产生很多动物所需要的小分子营养物质。微生物菌体本身可提供菌体蛋白, 添 加一定的微生物可以降解原料中的纤维素成分转化为小分子的单糖、 寡糖或者低聚糖, 所 以微生物菌剂与化学添加剂相比, 有着安全、 易操作、 无污染等优点, 近年来被广泛采用。 0004 常用青贮原料有玉米、。
12、 苜蓿、 甘薯和南瓜等, 但香蕉茎叶作为青贮饲料原料比较少 见。香蕉的茎叶是香蕉生产的主要副产品, 长期以来这些茎叶、 果轴等产物往往被作为废 弃物处理, 不仅污染环境, 也造成了很大的浪费。研究发现, 香蕉果轴中含有大量的纤维素 和半纤维素, 香蕉茎叶中含有蛋白质、 脂肪、 纤维素等营养物质, 如香蕉茎叶干物质中含有 23.7%的粗纤维, 6.4%的粗蛋白, 0.8%的粗脂肪和56%的无氮浸出物。 与其他农作物秸秆相 比, 其无氮浸出物含量丰富, 粗纤维含量低, 营养价值和能量高, 可作为优质的饲料资源。 0005 如将香蕉茎秆加工成青贮饲料, 对充分利用农作物资源, 促进畜牧业的科学发展,。
13、 扩大饲料资源、 降低饲料成本, 循环发展农牧业, 减少环境污染, 提高农民增收等一系列国 计民生都有着巨大的现实意义和深远的战略意义。 0006 香蕉茎叶中含有大量有毒性的聚合程度小而活性大的单宁 (鞣酸) , 它不但影响适 口性, 而且能抑制多种酶的活性, 随动物的采食量增加而使消化率下降, 同时它还影响到对 其它饲料蛋白质的吸收, 因此, 将新鲜的香蕉茎叶直接作为饲料资源是不科学的, 而如何除 去单宁是开发利用香蕉茎叶的关键。 0007 香蕉茎叶的粗蛋白很低, 制约着它的深加工发展。另外, 香蕉茎叶富含纤维素、 半 纤维素和木质素, 很难被降解, 近几十年来国内外都采用物理、 化学等处理。
14、方法, 但降解率 仍然很低, 故营养价值提高幅度不大, 制约着其发展。 0008 并且, 香蕉栽培在北纬 30 以内, 广西尤其是香蕉主产区, 有着丰富的资源, 如果 能把香蕉茎叶作为青贮饲料的技术难题克服, 无疑对广西甚至全国的香蕉种植产业有巨大 的经济效益和社会效益。 发明内容 0009 本发明针对香蕉茎叶作为饲料本身单宁含量高、 粗纤维多、 粗蛋白含量少等不足, 提供一种微生物复合菌剂, 使青贮饲料具有更好的适口性、 更低的纤维素含量和更高的蛋 说 明 书 CN 103598420 A 4 2/4 页 5 白含量, 全面提升其营养价值。 0010 本发明提供一种用于香蕉茎叶青贮的微生物复。
15、合菌剂, 包括 : 植物乳杆菌冻干菌 剂、 产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂。 0011 本发明还提供一种制备用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法, 包括以下几 个步骤 : 步骤 A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂 : 将植物乳杆菌 NL4-10, 接种于 MRS 培养基中, 静置 培养至稳定期, 离心后去上清液, 菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后, 离心后重悬于无菌磷酸 盐缓冲液, 加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂, 预冻, 再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干 燥, 即可获得植物乳杆菌冻干菌剂 ; 步骤 B: 制备冻干产朊假丝酵母 : 将产朊假丝酵母 GIM2.148 接种量, 接种于麦芽汁培 养基。
16、中, 静置培养至稳定期, 离心后去上清液, 菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后, 离心再重 悬于无菌磷酸盐缓冲液, 加入聚乙二醇和 L- 谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂, 预冻后进行 冷冻干燥, 即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂 ; 步骤 C: 制备冻干单宁酶 : 将黑曲霉 NC22 接种于查氏液体发酵培养基培养, 定性滤纸 过滤后得胞外单宁粗酶液, 再离心, 上清液为胞外单宁酶液, 将得到的上清液加入硫酸铵沉 淀, 再经蒸馏水透析除盐得到浓缩的单宁酶液, 再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和甘 露醇的混合液作为保护剂, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 即可获得单宁酶冻干 粉剂。 0012 步骤 D 。
17、: 依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、 产朊假丝酵母和单宁酶 : D1 : 植物乳杆菌复活 : 用水溶解 MRS 培养基, 再加入植物乳杆菌冻干剂, 常温下复活 ; D2 : 产朊假丝酵母复活 : 用水溶解麦芽汁培养基, 加入产朊假丝酵母冻干粉剂, 常温下 复活 ; D3 : 单宁酶复活 : 在柠檬酸钠盐酸缓冲液中, 加入单宁酶冻干粉剂, 常温下复活 ; 步骤 E : 将步骤 D1、 D2 和 D3 所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水, 保持复活水中 含菌量在 108cfu/mL1010 cfu/mL ; 步骤 F: 将香蕉茎叶切成 2-4cm 大小, 处理至其含水量在 60%65% 左右, 将步。
18、骤 E 所得 的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀, 装入发酵桶中, 压实、 密封后在常温下避光, 即可制得香蕉 茎叶青贮饲料。 0013 优选的, 所述植物乳杆菌 NL4-10 与 MRS 培养基, 产朊假丝酵母 GIM2.148 与麦芽汁 培养基的质量比均为 1:10, 冻干单宁酶与柠檬酸钠盐酸缓冲液培养基的质量比为 2:1。 0014 优选的, 所述查氏液体发酵培养基含质量分数 2% 的单宁酸。 0015 优选的, 所述步骤 A 和步骤 B 中, 静置培养的温度为 37和 28, 时间均为 36 小 时。 0016 优选的, 所述步骤 C 中, 培养的温度为 30, 速率为 120r/min, 时。
19、间为 72 小时。 0017 优选的, 所述步骤 A 和步骤 B 中, 离心的温度为 4, 时间为 10 分钟, 速度为 10000g, 无菌磷酸盐的 pH 值为 6.5。 0018 优选的, 所述步骤 A、 B 和 C 中的预冻方法包括 : -20预冻 2 小时后, -80再预冻 8 小时, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 冷阱温度为 -60, 真空度为 4-6Pa, 真空 冷冻干燥时间为 16 小时。 说 明 书 CN 103598420 A 5 3/4 页 6 0019 优选的, 步骤 A 中, 所述脱脂乳溶液的质量浓度为 10%, 所述步骤 C 中, 硫酸铵沉淀 的浓度为 2mo。
20、l/mL, 与胞外单宁酶液的体积比 5%。 0020 优选的, 步骤 B 中的保护剂中聚乙二醇的体积比 1% 和 L- 谷氨酸钠的质量分数为 7% ; 所述步骤 C 中的保护剂中聚乙二醇和甘露醇的混合液与浓缩后的单宁酶液体积比均为 1%。 0021 本发明采用以上方法, 可以变废为宝, 能清除和钝化香蕉茎叶中不利于消化的单 宁, 降低纤维素含量, 开发出优质的青贮饲料, 产生巨大的经济效益。 0022 具体实施方式 0023 下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明 : 实施例 1 : 1、 微生物复合菌剂制作 1.1 制备植物乳杆菌冻干菌剂 将植物乳杆菌 NL4-10 按 1% 接种量,。
21、 接种于 MRS 培养基中, 37静置培养 36 小时至稳 定期。在 4时, 10000g 离心 10 分钟, 去上清液, 菌泥用浓度为 60mM、 pH 值为 6.5 的无 菌磷酸盐缓冲液洗涤 2 次后, 再 10000g 离心 10 分钟, 重悬于 200mL 无菌磷酸盐缓冲液, 加入等体积的浓度为 10%(m/v) 的脱脂乳溶液作为保护剂, -20预冻 2 小时后, -80再预 冻 8 小时, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 冷阱温度为 -60, 真空度为 4-6Pa, 真 空冷冻干燥时间为 16 小时, 即可获得植物乳杆菌冻干菌剂。 0024 其中, 植物乳杆菌NL4-10的制备。
22、方法 : 称取50g新鲜香蕉叶, 剪成0.5cm小块后装 入 3cm20cm 的无菌试管中, 加入无菌水至没过所有物料, 30、 120r/min 振荡 30min, 取 悬浮液用于 MRS 固体培养基平板划线进行分离纯化。挑取单菌落用 MRS 液体培养基进行培 养至培养基浑浊, 培养液继续用平板划线进行分离纯化, 多次划线分离直至平板菌落无其 他杂菌出现。 0025 1.2 制备冻干产朊假丝酵母 将产朊假丝酵母 GIM2.148 按 1% 接种量, 接种于麦芽汁培养基中, 28恒温静置培养 36 小时至稳定期, 在 4时, 10000g 离心 10 分钟, 去上清液, 菌泥用浓度为 60mM。
23、、 pH 值 为 6.5 的无菌磷酸盐缓冲液洗涤 2 次后, 再 10000g 离心 10 分钟, 重悬于 200mL 无菌磷酸 盐缓冲液, 加入 1% 聚乙二醇和 7%L- 谷氨酸钠作为保护剂, -20预冻 2 小时后, -80再预 冻 8 小时, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥, 冷阱温度为 -60, 真空度为 4-6Pa, 真 空冷冻干燥时间为 16 小时, 即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂。 0026 其中, 产朊假丝酵母 GIM2.148 保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心, 产朊假 丝酵母 GIMCC 编号 : GIM2.148。 0027 1.3 冻干单宁酶 将黑曲霉 NC22。
24、 按 1% 接种量, 接种于含 2% 单宁酸的查氏液体发酵培养基, 在 30、 120r/min 条件下培养 72 小时, 定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液, 粗酶液在 4环境中 10000g 离心 30 分钟, 上清液为胞外单宁酶液。上清液以体积比 5% 的 2mol/mL 硫酸铵沉 淀, 蒸馏水透析除盐得到浓缩的单宁酶液。单宁酶液按体积比加入 1% 聚乙二醇和 1% 甘露 说 明 书 CN 103598420 A 6 4/4 页 7 醇作为保护剂, -20预冻 2 小时后, -80再预冻 8 小时, 预冻后放入冷冻干燥机中进行冷 冻干燥, 冷阱温度为-60, 真空度为4-6Pa, 真空冷冻干。
25、燥时间为16小时, 即可获得单宁酶 冻干粉剂。 0028 其中, 黑曲霉 NC22 的制备方法 : 称取 20g 新鲜香蕉叶, 粉碎后加入 90mL 0.1% 的 蛋白胨水溶液中, 30、 120r/min 振荡 30min, 过滤得到分离原液, 将分离原液进行梯度稀 释后涂布于马丁氏琼脂培养基, 挑取生长较好的单菌落, 接种于 PDA 培养基, 多次划线分离 直至得到该黑曲霉菌株。 0029 2、 使用方法 : 2.1 植物乳杆菌复活 : 取 MRS 培养基 100g 以 500mL 42水溶解, 加入冻干植物乳杆菌 冻干剂 10g, 常温下复活 30 分钟 ; 2.2 产朊假丝酵母复活 :。
26、 取麦芽汁培养基 50g 以 42水溶解, 加入产朊假丝酵母冻干 粉剂 5g, 常温下复活 30 分钟 ; 2.3 单宁酶复活 : 在 5g 柠檬酸钠盐酸缓冲液中, 加入单宁酶冻干粉剂 10g, 常温下复活 30 分钟 ; 2.4 将步骤 2.1-2.3 所复活菌剂充分搅拌后制成复活水, 保持复活水中含菌量在 108cfu/mL1010 cfu/mL ; 2.5 将 200kg 香蕉茎叶切成 2-4cm 左右大小, 处理至含水量在 60%65% 左右, 将步骤 2.4 所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀, 装入 50L 的发酵桶中, 压实、 密封后在常温下避光 培养 25 天, 即可制得复合要求的。
27、香蕉茎叶青贮饲料。 0030 经过上述工艺青贮发酵以后制得的香蕉茎叶青贮料具有良好的酸香味、 颜色亮、 质地柔软, 且具固形物和粗蛋白分别提高了 14.39% 和 38.33%, 纤维素和单宁分别降低了 21.22% 和 19.9%, 菌种在生长过程中利用可溶性化合物从而降低了 17.01%, 但是氨态氮比 对照组降低了 15.60%, 说明在青贮发酵过程中蛋白质破坏小, 营养价值高, 达到优等青贮料 的品质要求。 0031 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明, 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说, 在 不脱离本发明构思的前提下, 还可以做出若干简单推演或替换, 都应当视为属于本发明的 保护范围。 说 明 书 CN 103598420 A 7 。