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1、(10)申请公布号 CN 103652320 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103652320 A (21)申请号 201210342459.0 (22)申请日 2012.09.17 A23K 1/00(2006.01) A23K 1/16(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院饲料研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 滕达 王建华 王秀敏 管庆丰 (54) 发明名称 一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种饲用防腹泻酵母的高密度 发酵及其保护冻干的活菌制剂的制备方法， 属 于农业生物技术领域。
2、。原始出发菌株布拉酵母 (Saccharomyces boulardii， ATCC MYA-796)1 株 经过活化， 接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养 基中， 30， 200-250rpm， 培养 12-16h， 作为种子 液 ； 在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基 中， 以 10的接种量接种种子液， 30， 800rpm， 培养 12h， 然后流加 25葡萄糖 6h， 流加量为 20ml/h/L 发酵液 ； 离心收集菌体加入保护剂 (8 甘油， 7.5脱脂奶粉， 7.5海藻糖和 0.9氯化 钠)， 保护剂与菌体混合比例为21， 混匀后静置 平衡 1h ； -80预冷 12h， 然后置。
3、于真空冷冻干燥 机中冻干菌体， 称取冻干菌粉进行活菌计数， 其活 菌计数达 1.41010CFU/g。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 103652320 A CN 103652320 A 1/1 页 2 1. 一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 其步骤为 ： a. 原始出发菌株布拉酵母 (Saccharomyces boulardii) 划线在马铃薯葡萄糖琼脂斜 面培养上， 30， 静置培养 48h 进行活化 ； b. 从斜面上挑取一环菌体， 接种。
4、到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 30， 200-250rpm， 培养 12-16h， 作为种子液， 在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 以 10的接种量接种种子液， 30， 800rpm， 培养 12h， 然后流加 25葡萄糖 6h， 流加量为 20ml/h/L 发酵液 ； c.5000rpm， 30min， 收集菌体， 加入保护剂混， 保护剂与菌体混合比例为 2 1， 混匀后 静置平衡 1h ； d.-80预冷 12h， 然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体， 称取冻干菌粉进行活菌计数。 2. 根据权利要求 1 所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 其步骤 a 所述的 活化菌。
5、体的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基， 是由 200g 去皮马铃薯洗净切块， 加水 800ml 煮 沸 30min， 四层纱布过滤， 再加 20g 葡萄糖和 20g 琼脂， 搅拌混匀后， 定容至 1000ml， 分装试 管， 121蒸汽灭菌 20 分钟后取出试管摆斜面制得。 3. 根据权利要求 1 所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 其步骤 a 所述的 菌种为布拉酵母 (ATCC MYA-796)1 株。 4. 根据权利要求 1 所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 步骤 b 所述的 酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基， 是由 10g 酵 母浸出粉，。
6、 20g 蛋白胨于 900ml 水中， 121蒸汽灭菌 20min， 加入 115蒸汽灭菌 15min 的 100ml 20葡萄糖溶液制得。 5. 根据权利要求 1 所述的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 其步骤 c 所述的 保护剂， 是由 8甘油， 7.5脱脂奶粉， 7.5海藻糖和 0.9氯化钠制得。 6. 根据权利要求 1-5 任一项所述的饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法制作的酵母 活菌制剂其活菌计数达 1.41010CFU/g。 权 利 要 求 书 CN 103652320 A 2 1/3 页 3 一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种。
7、饲用防腹泻酵母的高密度发酵及其保护冻干的活菌制剂的制备 方法， 属于农业生物技术领域。 ( 二 ) 背景技术 0002 布拉酵母 (Saccharomyces boulardii) 是在印尼荔枝中分离得到的的一种适温 的、 非毒性酵母菌， 为酿酒酵母亚种。 与酿酒酵母在代谢、 生理和遗传特性方面又有所不同。 常规微生态制剂易受抗生素、 胃酸、 胆汁的影响， 应用受到限制， 酵母生物学特性与细菌完 全不同， 布拉酵母是一种生理性真菌制剂， 不会被胃酸、 胆酸、 抗生素等所破坏， 因此其应用 相对广泛。同时酵母对 pH 值变化有较好的耐受性， 在 pH7 8 时生长良好， 即使在 pH 值低 至1。
8、.5时仍能存活， 且发挥活性的最适温度为37， 其细胞体积为细菌的10倍， 使得酵母更 适宜用作益生菌。使用细菌作为益生菌的最大危险是致病菌的耐药性问题， 而酵母不存在 类似的问题。 0003 布拉酵母菌的防腹泻作用主要表现在 ： 第一， 预防和治疗梭菌感染和抗生素引起 的肠炎 ； 第二， 预防和治疗霍乱弧菌感染 ； 第三， 布拉酵母菌能拮抗肠道病原菌、 抑制毒素 产生、 降解毒素及毒素受体、 增强肠道黏膜的免疫功能。 0004 随着养殖业的发展， 抗生素的应用越来越广泛， 其对畜禽疾病的防治起了重要作 用的同时又破坏了畜禽肠道菌群的微生态平衡， 导致菌群失调， 引起肠上皮细胞的代谢调 节水平。
9、和生理功能发生紊乱， 从而使畜禽体内病原菌或条件致病菌过度增殖而造成感染性 腹泻。腹泻后， 又会进一步加重肠道菌群的紊乱而形成恶性循环， 因此， 在抗感染治疗过程 中。选择可有效防止肠道菌群失调又无毒副作用的生物制剂， 成为畜牧业的研究热点。 0005 布拉酵母菌作为微生态制剂的一种， 具有天然、 无毒副作用、 安全可靠、 无残留等 优点， 同时它属于真菌制剂， 不被常用抗生素降解， 可以与抗生素同时使用， 口服后不会被 胃酸和胆酸灭活， 并在肠道内保持稳定的有效活菌浓度， 预防使用抗生素带来的菌群失调。 布拉酵母菌作为一种新型微生态制剂， 在畜牧业中必将有广阔的应用前景。 0006 本发明技。
10、术主要针对上述的畜禽腹泻的关键问题， 通过研究布拉酵母的高密度发 酵工艺、 保护剂参数以及冻干工艺， 最终获得一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法。 为 解决畜禽腹泻特别是幼龄动物的腹泻问题提供了技术支撑。 ( 三 ) 发明内容 0007 本发明的目的在于研究布拉酵母的高密度发酵工艺、 保护剂参数以及冻干工艺， 提供一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 解决畜禽腹泻特别是幼龄动物的腹泻问 题。 0008 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。 0009 本发明提供的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法， 其步骤如下 ： 0010 a. 原始出发菌株布拉酵母 (Saccharomyces bo。
11、ulardii) 划线在马铃薯葡萄糖琼 说 明 书 CN 103652320 A 3 2/3 页 4 脂斜面培养上， 30， 静置培养 48h 进行活化 ； 0011 b. 从斜面上挑取一环菌体， 接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 30， 200-250rpm， 培养 12-16h， 作为种子液， 在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 以 10的接种量接种种子液， 30， 800rpm， 培养 12h， 然后流加 25葡萄糖 6h， 流加量为 20ml/h/L 发酵液 ； 0012 c.5000rpm， 30min， 收集菌体， 加入保护剂混， 保护剂与菌体混合比例为 2 1， 混。
12、 匀后静置平衡 1h ； 0013 d.-80预冷 12h， 然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体， 称取冻干菌粉进行活菌 计数。 0014 本发明 a 中所述的马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基， 是由 200g 去皮马铃薯洗净切 块， 加水800ml煮沸30min， 四层纱布过滤， 再加20g葡萄糖和20g琼脂， 搅拌混匀后， 定容至 1000ml， 分装试管， 121蒸汽灭菌 20 分钟后取出试管摆斜面制得。 0015 本发明 a 中所述的菌种为布拉酵母 (ATCC MYA-796)1 株。 0016 本发明 b 中所述的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大酵母浸出粉胨葡 萄糖液体培养基， 是由 。
13、10g 酵母浸出粉， 20g 蛋白胨于 900ml 水中， 121蒸汽灭菌 20min， 加 入 115蒸汽灭菌 15min 的 100ml 20葡萄糖溶液制得。 0017 本发明c中所述的保护剂， 是由8甘油， 7.5脱脂奶粉， 7.5海藻糖和0.9氯 化钠制得。 0018 本发明具有以下有益效果 ： 0019 本发明所制备的防腹泻酵母活菌制剂的有效活菌数达 1.41010CFU/g。与其他制 备方法比较， 本发明所用的方法对酵母菌体的影响与破坏较小。 ( 四 ) 具体实施方式 0020 本发明提供的一种饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法的具体实施方式如下 ： 0021 本实施例所用的菌株为布。
14、拉酵母 (Saccharomyces boulardii)， 保藏于美国模式 培养物保藏中心 (ATCC MYA-796)。 0022 a.200g 去皮马铃薯洗净切块， 加水 800ml 煮沸 30min， 四层纱布过滤， 再加 20g 葡 萄糖和20g琼脂， 搅拌混匀后， 定容至1000ml， 分装试管， 121蒸汽灭菌20分钟后取出试管 摆斜面制得马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基 ； 0023 b. 原始出发菌株布拉酵母划线在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养上， 30， 静置培养 48h 进行活化 ； 0024 c.10g 酵母浸出粉， 20g 蛋白胨于 900ml 水中， 121蒸汽灭菌 20min。
15、， 加入 115蒸 汽灭菌 15min 的 100ml 20葡萄糖溶液制得酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基和液体扩大 酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基 ； 0025 d. 从斜面上挑取一环菌体， 接种到酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 30， 200-250rpm， 培养 12-16h， 作为种子液， 在液体扩大酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中， 以 10的接种量接种种子液， 30， 800rpm， 培养 12h， 然后流加 25葡萄糖 6h， 流加量为 20ml/h/L 发酵液 ； 0026 e.5000rpm， 30min， 收集菌体， 加入保护剂混， 保护剂与菌体混合比例为 2 1， 混 说 明 书 CN 103652320 A 4 3/3 页 5 匀后静置平衡 1h ； 0027 f.-80预冷 12h， 然后置于真空冷冻干燥机中冻干菌体， 称取冻干菌粉进行活菌 计数 ； 0028 g. 由上所述的饲用防腹泻酵母活菌制剂的制备方法制作的酵母活菌制剂其活菌 计数达 1.41010CFU/g。 0029 表 1 不同保护剂配方参数对冻干粉活菌数的影响 0030 说 明 书 CN 103652320 A 5 。