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1、(10)授权公告号 CN 103169963 B (45)授权公告日 2014.10.15 CN 103169963 B (21)申请号 201310125911.2 (22)申请日 2013.04.12 A61K 39/205(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究 所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427 号 专利权人 哈尔滨维科生物技术开发公司 (72)发明人 步志高 王喜军 葛金英 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 王旭。
2、 CN 1632124 A,2005.06.29, CN 1632124 A,2005.06.29, 郑佳琳等 .“优化密码子以提高狂犬病病毒 糖蛋白基因在原核细胞的表达” .中国人兽共患 病学报 .2010, 第 26 卷 ( 第 5 期 ), 郑佳琳等 .“优化密码子以提高狂犬病病毒 糖蛋白基因在原核细胞的表达” .中国人兽共患 病学报 .2010, 第 26 卷 ( 第 5 期 ), 林枫等 .“表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗 的组建与鉴定” .病毒学报 .1992, 第 8 卷 ( 第 3 期 ), (54) 发明名称 狂犬病 DNA 疫苗的构建及应用 (57) 摘要 本发明提供一种作为。
3、狂犬病 DNA 疫苗的表达 按哺乳动物密码子偏嗜性优化的狂犬病病毒囊膜 糖蛋白 (G 蛋白 ) 基因的重组真核表达质粒。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 江涵 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103169963 B CN 103169963 B 1/1 页 2 1. 一种狂犬病 DNA 疫苗， 所述狂犬病 DNA 疫苗包含表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化 的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒， 其中所述按哺。
4、乳动物密码子偏嗜性优 化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如 SEG ID No.1 所示的序列。 2. 根据权利要求 1 所述的狂犬病 DNA 疫苗， 其中所述表达按哺乳动物密码子偏嗜性优 化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒具有如 SEG ID No.2 所示的序列。 3. 具有如 SEG ID No.2 所示的序列的重组真核表达质粒在制备狂犬病 DNA 疫苗中的用 途。 权 利 要 求 书 CN 103169963 B 2 1/6 页 3 狂犬病 DNA 疫苗的构建及应用 技术领域 0001 本发明涉及狂犬病疫苗领域。更具体地， 本发明涉及一种作为狂犬病 DNA 疫苗的 表达按哺乳。
5、动物密码子偏嗜性优化的 RV 囊膜糖蛋白 (G 蛋白 ) 基因的重组真核表达质粒。 背景技术 0002 狂犬病 (Rabies) 是由狂犬病病毒 (Rabies virus， RV) 引起的一种人兽共患传染 病， 在全球范围内流行， 以急性、 渐进性和致死性脑炎为特征， 一旦出现神经症状病死率几 乎高达 100 1， 2。全球每年死于狂犬病的人数高达 5.5 万， 主要发生在亚洲和非洲的发 展中国家 3， 4。自 2000 年以来， 我国狂犬病疫情又呈现快速回升的趋势， 2007 年死亡人数 高达 3,300 人 5， 随后略有下降， 但仍维持在较高水平， 2011 年造成 1,879 人死亡。
6、6， 已经 成为一个严重的公共卫生问题。据统计， 99以上人间狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬伤所 致 1。人间狂犬病控制最有效的措施是通过疫苗接种， 从源头上控制犬狂犬病。传统的狂 犬病弱毒疫苗成本低廉， 但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患 ； 灭活疫苗安全、 有 效， 但成本昂贵 7， 8。因此， 研制安全、 有效， 成本低廉的动物狂犬病疫苗， 仍具现实意义。 0003 DNA 疫苗免疫动物后， 可同时诱导体液免疫和细胞免疫， 可保护动物抵抗病原体的 攻击。同时， DNA 疫苗易于构建， 大量制备工艺简单， 生产成本低廉， 便于保存， 无需冷冻运 输， 因而引起研究人员的广泛关注 9， 1。
7、0。 0004 狂犬病病毒 (Rabies virus， RV) 为弹状病毒科 (Rhabdoviridae) 狂犬病毒属 (Lssavirus) 成员 11。狂犬病病毒囊膜蛋白 (RVG) 是病毒的受体结合蛋白和主要毒力因 子之一， 决定着病毒侵入神经系统或组织的路径和致病力， 也是诱导机体保护性免疫反应 的主要抗原 12。本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的 RVG 基因的重组真核表达质粒 pCAGG-RVG， 并对其在靶动物犬的免疫原性进行了评估。 发明内容 0005 本发明构建了表达按哺乳动物密码子偏嗜性优化的RVG蛋白(RVG)基因的重组真 核表达质粒pCAGG-RVG。 间接免疫荧。
8、光试验及蛋白印迹结果表明， 重组RVG在pCAGG-RVG转 染 BHK 细胞获得正确表达。将 pCAGG-RVG 按 500g 剂量经肌肉注射途径免疫比格犬， 间隔 4 周以相同剂量、 途径加强免疫一次， 并于初次免疫前、 后不同时间检测血清 RV 中和抗体。 结果， pCAGG-RVG 一次免疫即可诱导显著的中和抗体反应， 二次免疫中和抗体滴度表现出显 著地增强效果。二次免疫后， 中和抗体滴度经过短暂的下降， 即保持持续的平稳， 至初次免 疫后第 54 周， 7 只免疫犬中和抗体滴度平均为 2.88IU， 且全部高于 0.5IU， 即全部高于对强 毒攻击保护的最低中和抗体滴度要求。综上， 。
9、pCAGG-RVG 具有预防狂犬病的潜力， 是一种有 希望的狂犬病候选疫苗。 0006 具体地， 本发明提供以下各项 ： 0007 1. 一种狂犬病 DNA 疫苗， 所述狂犬病 DNA 疫苗包含表达按哺乳动物密码子偏嗜性 优化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒。 说 明 书 CN 103169963 B 3 2/6 页 4 0008 2. 根据第 1 项所述的狂犬病 DNA 疫苗， 其中所述按哺乳动物密码子偏嗜性优化的 狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如 SEG ID No.1 所示的序列。 0009 3. 根据第 1 项所述的狂犬病 DNA 疫苗， 其中所述表达按哺乳动物密码子偏嗜性优。
10、 化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重组真核表达质粒具有如 SEG ID No.2 所示的序列。 0010 4. 具有如 SEG ID No.2 所示的序列的重组真核表达质粒用作狂犬病 DNA 疫苗的用 途。 0011 5. 具有如 SEG ID No.2 所示的序列的重组真核表达质粒在制备狂犬病 DNA 疫苗中 的用途。 附图说明 0012 图 1 ： 间接免疫荧光检测 RVG 蛋白在 pCAGG-RVG 转染 BHK 细胞中的表达。A ： pCAGG-RVG 转染的 BHK 细胞 ； B ： RV 弱毒疫苗株 ERA 感染的 BHK 细胞 ； C ： pCAGGS 转染的 BHK 细胞。 00。
11、13 图 2 ： 蛋白质印迹检测 RVG 蛋白在 pCAGG-RVG 转染 BHK 细胞中的表达。以 2g 的 pCAGG-RVG 或 pCAGGS 转染铺于 6 孔板密度约为 80的 BHK 细胞， 同时用 RV 弱毒疫苗株 ERA 按 MOI 为 1 感染转染铺于 6 孔板密度约为 80的 BHK 细胞。36 小时后， 收获、 裂解细胞， 以 裂解细胞上清进行SDS-PAGE电泳， 将蛋白质转印至硝酸纤维素膜上后， 以鼠抗RV血清为一 抗进行 Western blot 分析。M ： 蛋白质分子量标准 ； A ： pCAGGS 转染的 BHK 细胞 ； B ： RV 弱毒 疫苗株 ERA 感。
12、染的 BHK 细胞 ； C ： pCAGG-RVG 转染的 BHK 细胞。 0014 图3 ： 狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG对犬的免疫效力。 用表达RVG蛋白的重组真核表 达质粒 pCAGG-RVG 按 500g/1mL/ 只的剂量经肌肉注射途径免疫 7 只比格犬， 间隔 4 周以 相同剂量、 途径进行加强免疫。免疫前和免疫后不同时间点采集试验犬外周血， 分离血清， 通过中和试验检测血清中 RV 特异中和抗体滴度。 具体实施方式 0015 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 0016 材料和方法 0017 1. 质粒、 血清、 细胞株和毒株 0018 真核表达载体 pCAGGS 由。
13、 Y.Kawaoka 博士提供 13( 文献 13 中明确公开了载体 pCAGGS 的构建方法 ) ； 抗狂犬病病毒国际标准血清购自 OIE 狂犬病参考实验室 ( 法国 ) ； ( 仓鼠肾细胞 )BHK-21 ： ATCC NO.CCL10 ； RV 弱毒疫苗株 ERA ： CVCC NO.AV61* ； 鼠抗 RV 血清 (RV 弱毒疫苗株 ERA 按 106FFU/mL/ 只的剂量免疫 6 周龄小鼠， 间隔 3 周， 加强免疫 2 次， 第 3 次免疫后 2 周采集小鼠血液， 分离血清 ) ； RV 标准固定毒株 CVS11 的来源见参考文献 14。 0019 2. 主要试剂及实验动物 0。
14、020 限制性内切酶、 T4连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司 ； plasmid Giga Kits 购自 QIAGEN 公司 ； 脂质体 LipofectamineTM2000 转染试剂购自 Invitrogen 公司 ； 绿色荧光 素 (FITC) 标记的兔抗小鼠 IgG、 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的兔抗小鼠 IgG 均购自 Sigma 公司。比格犬购自广州医药工业研究总院实验动物研究开发中心 ( 国家犬类实验动物种子 中心 )。 说 明 书 CN 103169963 B 4 3/6 页 5 0021 实施例 1、 真核表达质粒 pCAGG-RVG 的构建与制备 0022 按。
15、哺乳动物密码子偏嗜性优化狂犬病病毒弱毒疫苗株 ERA( 其完整基因组序列见 GenBank 号 ： FJ913470) 囊膜糖蛋白 (G 蛋白 ) 的基因序列 ( 优化前的原始序列见 SEG ID No.3)。一种氨基酸均有几个密码子， 也就说这几个密码子均能翻译成一种氨基酸。哺乳 动物对密码子具有偏嗜性， 即在哺乳动物体内一种氨基酸的几个密码子的翻译效率有的高 有的低， 在本文中 “优化” 即将氨基酸的密码子全部改写为在哺乳动物体内翻译效率高的 密码子。原始序列与优化后序列的差别在于翻译成的氨基酸序列不变， 但核酸序列变化特 别大。优化后的序列见 SEG ID No.1， 人工合成该基因， 。
16、并在起始密码子前引入 Kozak 序列 (GCCGCCACC)， 两末端引入 EcoRI 和 XhoI 限制性内切酶序列 (GAATTC 和 CTCGAG)， 克隆至 pUC57 载体 (GenScript NO.SD1176)， 获得质粒 pUC57-RVG。以 BamH I 单酶切 pCAGGS， 去除 其中SV40 ori序列(SV40复制起始序列)， 连接构成质粒pCAGGSSV40 ori ； 再以EcoRI和 XhoI 限制性内切酶双酶切 pUC57-RVG， 得到 RVG 基因， 并亚克隆至 pCAGGSSV40 ori 相应 酶切位点， RVG 蛋白基因位于鸡 -actin 转。
17、录启动子下游， 获得表达 RVG 蛋白基因的真核 表达质粒 pCAGG-RVG(SEG ID No.2)。分别以 EcoRI 和 XhoI 单酶切进行鉴定， 通过 plasmid Giga Kits 大量制备质粒 pCAGG-RVG( 具体操作详见试剂盒说明书 )， 用于转染及免疫试验。 0023 EcoRI 和 XhoI 双酶切 pCAGG-RVG 得到大小约为 1650bp 和 4400bp 的两个片段， 与 预期结果相符， 表明 RVG 蛋白基因在真核表达质粒 pCAGGS 中获得重组 ( 结果未呈现 )。 0024 实施例 2、 真核表达质粒 pCAGG-RVG 的瞬时转染及间接免疫荧。
18、光 (IFA) 检测 0025 为了证实 pCAGG-RVG 表达 RVG 蛋白的抗原性， 以 pCAGG-RVG 转染 BHK 细胞， 转染 前准备 24 孔板生长过夜、 密度约为 80的 BHK 细胞， 通过脂质体转染方法 ( 具体操作详 见 LipofectamineTM2000 说明书 ) 转染 0.5g 的 pCAGG-RVG 转染至上述细胞、 转然后 5 CO237培养。同时， 以 RV 弱毒疫苗株 ERA 按 MOI 为 0.1 的剂量感染 BHK 细胞， 作为阳性对 照 ； 以 0.5g 的 pCAGGS 转染 BHK 细胞， 作为阴性对照。转染后 36 小时， 用 PBS 洗。
19、细胞 3 次， 以预冷的3多聚甲醛固定细胞30min ； PBS洗3次后， 1BSA封闭20min ； PBST(0.05 Tween20) 洗涤后加入 1 100 倍稀释的鼠抗 RV 血清为一抗， 室温孵育 30min ； PBST 洗涤后 加入 1 200 倍稀释 FITC 标记的兔抗鼠 IgG 二抗 (Sigma NO.F9137)， 室温孵育 30min ； PBS 洗涤后， 置于荧光显微镜 (Leica DMIRES2) 下观察。 0026 结果显示， 抗 RV 鼠血清检测 pCAGG-RVG 转染的 BHK 细胞时呈现绿色阳性荧光信号 ( 图 1A)， 检测 RV ERA 株感染 。
20、BHK 细胞时也呈现绿色阳性荧光信号 ( 图 1B)， 而检测 pCAGGS 转染的 BHK 细胞时则呈现阴性荧光信号 ( 图 1C)。结果表明， pCAGG-RVG 表达 RVG 蛋白具有 良好的反应原性。 0027 实施例 3、 蛋白印迹法 (Western blot) 分析 0028 为了分析重组真核表达质粒能否表达 RVG 蛋白， 以 2g 的 pCAGG-RVG 转染铺于 6 孔板的单层 BHK 细胞。在转染后 36 小时， 收获、 裂解细胞， 加入等体积的 2SDS 裂解缓冲 液， 煮沸 10min， 10,000g 离心 10min 后， 取上清进行 SDS-PAGE(Bio-R。
21、ad) 电泳 ； 将蛋白电 转印 (Bio-Rad) 至尼龙膜 (Ameresco) 上， 5脱脂乳封闭过夜， PBST 洗涤后加入 1 100 倍稀释的鼠抗 RV 血清为一抗， 室温作用 1h， PBST 洗涤后， 加入 1 2500 倍 PBST 稀释辣根 过氧化物酶 (HR) 标记兔抗鼠 IgG 二抗 (Sigma NO.A9044) 室温作用 1h， PBST 洗涤后， 用 DAB 进行显色。 说 明 书 CN 103169963 B 5 4/6 页 6 0029 蛋白质印迹显示出特异的 67ku 检测蛋白， 与 G 蛋白理论预期值相符 ( 图 2)。结果 表明， RVG 蛋白在 pC。
22、AGG-RVG 转染的 BHK 细胞中获得表达。 0030 实施例 4、 血清中和试验检测 DNA 免疫犬诱导中和抗体 0031 为了进一步评价真核表达质粒 pCAGG-RVG 的免疫效力， 以重组真核表达质粒 pCAGG-RVG按500g/1mL/条(不管体重如何都注射同样的量， 用磷酸盐缓冲液PBS进行稀 释 ) 的剂量经肌肉注射途径免疫 7 条 RV 中和抗体阴性比格犬 ( 所用比格犬 12 月龄， 接种 剂量与体重无关， 注射部位为后肢股四头肌 )， 间隔 4 周再以相同剂量、 途径加强免疫一次。 同时， 以 pCAGGS 为对照以相同的方法免疫 5 条 RV 中和抗体阴性比格犬， 间。
23、隔 4 周再以相同 剂量、 途径加强免疫一次。分别于初次免疫前、 后不同时间点经前肢静脉采集血液、 分离血 清， 用于中和抗体检测。 0032 RV 中和抗体的检测基本参照文献 14 在 96 孔板上进行。首先将采集的血清样品 置于 56水浴 30min 进行灭活， 再分别以不完全 DMEM(Gibson)9 倍稀释， 后连续 3 倍稀释， 每稀释度体积为50L， 与50L约含100TCID50的标准固定毒株CVS11病毒液混合， 37感 作 1h 后， 每孔加入约 105个 BHK 细胞， 同时设阳性、 阴性及细胞对照 ( 阳性对照为国际标准 血清， 起始血清稀释滴度为0.5IU/mL)， 。
24、血清每个稀释度做4个平行孔， 5CO237培养48h 后进行 IFA 检测， 后置于荧光显微镜下观察， 并计算血清 RV 中和抗体滴度。 0033 初次免疫后 4 周， pCAGG-RVG 免疫犬血清中就能检测到 RV 中和抗体， 而在 pCAGGS 免疫犬血清中检测不到 RV 中和抗体。初次免疫后 4 周， pCAGG-RVG 免疫犬血清中 RV 中和 抗体平均滴度上升到3.23IU/mL(7.9， 0.38， 1.14， 5.92， 2.6， 0.29和4.5)， 加强免疫后2周， 免疫犬血清中 RV 中和抗体平均滴度上升到峰值 8.21IU/mL(13.50， 7.79， 13.5， 4。
25、.5， 5.92， 7.79 和 4.5)， 随后 RV 中和抗体水平逐渐下降。初次免疫后 27 周， 免疫犬血清中 RV 中和抗 体平均滴度下降到 3.99IU/mL(7.79， 3.24， 2.6， 2.6， 2.6， 0.87 和 1.14)， 然而初次免疫后第 54 周， 免疫犬血清中 RV 中和抗体平均滴度仍然可达 2.88IU/mL(7.79， 2.6， 2.6， 2.6， 2.6， 0.87和1.14)。 这些结果表明， pCAGG-RVG是一个具有良好免疫效力的犬狂犬病候选DNA疫 苗 ( 图 3)。 0034 讨论 0035 本研究构建了表达哺乳动物密码子优化的 RV 囊膜糖。
26、蛋白 G 基因的重组真核表达 质粒 pCAGG-RVG。间接免疫荧光试验和蛋白质印迹结果表明， RVG 蛋白在重组真核表达质粒 pCAGG-RVG转染的BHK细胞中获得表达， 且具有良好的反应原性。 应用该重组真核表达质粒 作为 DNA 疫苗免疫比格犬， 可诱导显著而持久的 RV 中和抗体反应。 0036 免疫动物血清中 RV 中和抗体水平是评价狂犬病疫苗免疫效力的一个重要指标。 Osorio等研究结果显示， 以1个剂量(100g/条)表达RV CVS株G蛋白的DNA疫苗经肌肉 注射途径免疫犬， 仅能诱导低水平的 RV 中和抗体反应 ； 然而将免疫剂量提高到 300g/ 条 时， 可增强 RV。
27、 中和抗体反应 15。这些研究结果提示， 狂犬病 DNA 疫苗免疫犬可诱导剂量依 赖性的 RV 中和抗体反应 ； 增加免疫剂量可能会获得更高水平的 RV 中和抗体反应。我们的 研究结果也证实这一推测， 以狂犬病 DNA 疫苗 pCAGG-RVG 按 500g/ 只的剂量免疫犬， 可诱 导显著的RV中和抗体， 初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗体滴度平均值可达3.23IU/ mL。 0037 另外， Perrin 等研究发现 ： 以 1 个剂量 (100g/ 只 ) 的表达 RV PV 株 G 蛋白的 说 明 书 CN 103169963 B 6 5/6 页 7 DNA 疫苗经肌肉注射途径免疫。
28、犬， 仅能诱导低水平的 RV 中和抗体反应， 但间隔一定时间进 行加强免疫可增强 RV 中和抗体反应 16。这与本研究结果一致， 我们以狂犬病 DNA 疫苗 pCAGG-RVG按500g/只的剂量免疫犬， 可诱导显著的RV中和抗体反应， 初次免疫后4周免 疫犬血清中 RV 中和抗体滴度平均值可达 3.23IU/mL ； 间隔 4 周以相同剂量、 途径进行加强 免疫， 可显著增强 RV 中和抗体反应， 加强免疫后 2 周免疫犬血清中 RV 中和抗体滴度平均值 高达 8.21IU/mL。 0038 尽管， 本研究以狂犬病 DNA 疫苗 pCAGG-RVG 免疫犬血清中 RV 中和抗体滴度峰值平 均。
29、值 (8.21IU/mL) 远远低于我们以前的研究中分别以 RVERA 疫苗株 (106FFU/ 只 )、 表达 RV G 蛋白基因的重组新城疫病毒 rLa-RVG(109.3EID50/ 只 ) 和表达 RV G 蛋白基因的重组犬瘟 热病毒 rCDV-RVG(106TCID50/ 只 ) 诱导的 RV 中和抗体滴度峰值平均值 ( 分别为 70.4IU/ mL、 96IU/mL 和 96.71IU/mL)17， 18， 然而狂犬病 DNA 疫苗 pCAGG-RVG 免疫犬血清中 RV 中和 抗体滴度下降地更为缓慢， 初次免疫后 54 周免疫犬血清中 RV 中和抗体滴度平均值仍可达 2.88IU。
30、/mL， 而 0.5IU/mL 的 RV 中和抗体滴度是能保护动物免受致死剂量 RV 街毒株攻击的 最小滴度 11， 17， 18。这一结果提示 ： pCAGG-RVG 的免疫接种能为犬提供 1 年以上的有效保护。 因此， 狂犬病 DNA 疫苗 pCAGG-RVG 是一个有希望的狂犬病候选疫苗。 0039 参考文献 0040 1.Fu Z F.Rabies and rabise research ： past，present and futureJ. Vaccine.1997， 15 Suppl ： S20-4. 0041 2.Osinubi M O V， Wu X， Franka R， et。
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