技术领域
本发明涉及经大肠吸收用药物组合物，更详细而言，涉及包含特定的 生理活性物质和特定的上皮透过性亢进化合物的经大肠吸收用药物组合 物。
背景技术
通常，激素、细胞因子等肽性药品、抗体药品或siRNA、DNA质粒 等核酸药品几乎全部是水溶性且高分子量的化合物，其上皮透过性和细胞 膜透过性极低。另一方面，这些生理活性物质的靶分子(作用部位)多数情 况下存在于细胞膜、细胞内，为了将其开发成药品，将这些生理活性物质 传递至靶细胞内的技术(系统)的开发是不可或缺的。尽管至今为止正在开 发多种药物传递系统(DDS)，但将这些生理活性物质不通过注射而特异性 地传递至靶组织、特别是靶细胞内的系统尚无报道。考虑这是因为：兼具 非注射性地向体内传递药物的功能和特异性地向靶部位传递的功能这两 者的多功能DDS的开发是非常困难的。特别是，虽然口服是简便的药物 给药途径，但对于药物传递而言存在很多障碍。
本发明人等至今一直对利用内源性乳糜微粒传递抑制靶基因表达的 核酸的系统等进行研究。例如专利文献1中记载了一种靶基因的表达抑制 剂，其特征在于，其含有结合了向乳糜微粒或乳糜微粒残粒导入的导入物 质且抑制靶基因表达的核酸，并且将其在诱导内源性乳糜微粒的生产的条 件下向脊椎动物给药。但是，所述表达抑制剂主要设想的给药途径是静脉 内注射等注射给药。
医学上重要的药物之中，由消化道吸收的药物少，因此多进行注射给 药，注射疗法被指出对患者而言，不仅伴随着精神上肉体上的苦痛，还有 可能会引起过敏性反应、给药部位的组织障碍。因此，需要一种能够代替 注射剂的新型给药剂型，近年来，正在尝试开发难吸收性药物的口服或直 肠给药制剂。
例如，非专利文献1中记载了：作为使难吸收性药物的肠道透过性提 高的吸收促进物质，可以使用癸酸、油酸、亚油酸和它们的甘油单酯等脂 肪酸；脂肪酸的糖酯；脂肪酸的甘油酯；EDTA、枸橼酸等螯合剂；月桂 基硫酸钠等表面活性剂。另外，源自本发明人等的非专利文献2中记载了： 作为吸收促进作用物质，长链不饱和脂肪酸、中链脂肪酸是优异的；长链 不饱和脂肪酸与HCO-60(非离子性表面活性剂)的混合胶束是特别优异的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/069313号小册子
非专利文献
非专利文献1：D.D.BreimerandP.Speiser,Editors,“Topicsin PharmaceuticalSciences1987”,ElsevierSciencePublishersB.V.,Biomedical Division(1987),pp.445-455.
非专利文献2：药剂学（薬剤学）、Vol.53、No.3、p176～184(1993)
发明内容
本发明的课题在于提供一种经大肠吸收用药物组合物，其能够将在细 胞内具有作用部位的生理活性物质(特别是水溶性且高分子量的生理活性 物质)不通过注射给药而非侵袭性地且高特异性地传递至特定组织的细胞 内。
本发明人等针对不通过注射给药而非侵袭性地给药维生素E结合的 siRNA(VE-siRNA)的方法进行了深入研究。以往已知的是：生物体内的脂 蛋白之一即内源性乳糜微粒在小肠形成，主要透过小肠的粘膜上皮而进入 淋巴管，沿淋巴管上行，流出至静脉后通过脂蛋白脂酶(LPL)代谢为乳糜 微粒残粒(chylomicronremnant)，通过该乳糜微粒残粒输送至肝脏。因此， 本发明人等通过向小肠给药VE-siRNA以使VE-siRNA成为内源性乳糜微 粒的构成材料，形成包含VE-siRNA的内源性乳糜微粒，为了使所述内源 性乳糜微粒被小肠吸收而传递至肝脏细胞内，合并使用了具有肠粘膜上皮 透过性亢进作用的各种化合物，同时将VE-siRNA向小肠给药，但 VE-siRNA基本上不会透过小肠的粘膜上皮，无法高效地将VE-siRNA传 递至肝脏细胞内。
因此，本发明人等也研究了放弃VE-siRNA的肠道给药。这是因为可 以认为：虽然作为小肠给药以外的肠道给药能够姑且进行大肠给药，但在 大肠无法形成乳糜微粒，因此即使合并使用具有肠粘膜上皮透过性亢进作 用的各种化合物并同时将VE-siRNA向大肠给药，VE-siRNA也无法进入 内源性乳糜微粒中。但是，本发明人等尝试了VE-siRNA与具有肠粘膜上 皮透过性亢进作用的各种化合物的大肠给药。其结果，本发明人等意外地 发现了：虽然存在程度差异，但通过具有肠粘膜上皮透过性亢进作用的各 种化合物，能够将VE-siRNA有效地传递至肝脏细胞内，从而完成了本发 明。
即，本发明涉及以下内容：
(1)一种经大肠吸收用药物组合物，其特征在于，其至少含有以下的 (a)和(b)：
(a)细胞内具有作用部位、且结合有脂蛋白导入物质的生理活性物质、
(b)具有前述生理活性物质的大肠粘膜上皮透过性亢进作用的化合物；
(2)根据上述(1)所述的药物组合物，其特征在于，作为具有大肠粘膜 上皮透过性亢进作用的化合物，还含有表面活性剂；
(3)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其特征在于，脂蛋白导入物 质为向乳糜微粒或乳糜微粒残粒导入的导入物质；
(4)根据上述(3)所述的药物组合物，其特征在于，脂蛋白导入物质为 脂溶性维生素或胆固醇；
(5)根据上述(4)所述的药物组合物，其特征在于，脂溶性维生素为维 生素E或其衍生物；
(6)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其特征在于，其能够将生理 活性物质向肝脏细胞特异性传递；
(7)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其特征在于，与脂蛋白导入 物质结合了的生理活性物质的分子量处于1000～150000道尔顿的范围内；
(8)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其特征在于，生理活性物质 为抑制靶基因表达的核酸；
(9)根据上述(8)所述的药物组合物，其特征在于，核酸为选自由 siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适配体、核酶和诱饵组 成的组中的1种或2种以上核酸；
(10)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其中，具有大肠粘膜上皮 透过性亢进作用的化合物包含以下的(c)或(d)中的任一种以上：
(c)中链脂肪酸或长链不饱和脂肪酸、
(d)前述(c)记载的脂肪酸(多元不饱和脂肪酸时也包含共轭型)的盐、酯 体或醚体；
(11)根据上述(10)所述的药物组合物，其特征在于，具有大肠粘膜上 皮透过性亢进作用的化合物为亚油酸、油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸、 二十碳五烯酸、癸酸或月桂酸、或者它们的盐、酯体或醚体；
(12)根据上述(2)所述的药物组合物，其特征在于，表面活性剂为聚氧 乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯、聚乙二醇、泊洛沙姆、单酰基甘油、单酰基 山梨糖醇酐或脂肪酸蔗糖酯类；
(13)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其为大肠给药制剂、口服 肠溶制剂或口服药物传递系统。
根据本发明，能够提供一种经大肠吸收用药物组合物，其能够将细胞 内具有作用部位的生理活性物质(特别是水溶性且高分子量的生理活性物 质)不通过注射给药而非侵袭性且高特异性地传递至特定的组织的细胞内。
附图说明
图1是表示本发明的经大肠吸收用药物组合物的设想传递机理的概要 的图。
图2是表示VE-siRNA的化学结构的图。序列中的小写文字表示2’O- 甲基修饰，星号表示硫代磷酸酯(phosphothionate)骨架，Toc表示α-生育酚 (tocopherol)。
图3是表示用共聚焦激光显微镜观察直肠给药了荧光标记VE-siRNA 和上皮透过性亢进化合物等的、小鼠的肝脏组织的冷冻切片的结果的图。
图4是表示针对直肠给药了荧光标记VE-siRNA和上皮透过性亢进化 合物等的小鼠的淋巴液，用荧光相关光谱(FCS)进行分析的结果的图。
图5是表示针对直肠给药了荧光标记VE-siRNA和上皮透过性亢进化 合物等的小鼠的淋巴液或所述淋巴液的脂蛋白部分，用荧光相关光谱(FCS) 进行分析的结果的图。
图6是表示针对来源于直肠给药了VE-siRNA和上皮透过性亢进化合 物等的小鼠的肝脏细胞的总RNA，进行RNA印迹分析的结果的图。
图7是表示针对来源于直肠给药了VE-siRNA和上皮透过性亢进化合 物等的小鼠的肝脏细胞的总RNA，进行靶内源性基因相关的定量的 RT-PCR的结果的图。
图8是表示用蛋白免疫印迹法分析直肠给药了VE-siRNA和上皮透过 性亢进化合物等的、小鼠的血清中的apoB100和apoB48的结果的图。图 8A：是表示蛋白免疫印迹法的结果的图。图8B：是表示由图8A的结果定 量带（band）的浓度，并算出apoB100定量值与apoB48定量值的比率 (apoB100/48比)的结果的图。
图9是表示直肠给药了VE-siRNA和上皮透过性亢进化合物等的、小 鼠的血清中的中性脂肪值和LDL胆固醇值的图。
图10是表示用共聚焦激光显微镜观察直肠给药了荧光标记VE-siRNA 和各种上皮透过性亢进化合物等的、小鼠的肝脏组织的冷冻切片的结果的 图。
图11是表示用共聚焦激光显微镜观察直肠给药了含有荧光标记 VE-siRNA和上皮透过性亢进化合物等的中空栓剂等的、大鼠的肝脏组织 的冷冻切片的结果的图。
图12是表示用扫描型电子显微镜观察乙基纤维素多孔性微球的结果 的图。
图13是表示含有Cy3标记VE-siRNA/p-MS的栓剂的形状的图。
图14是表示用共聚焦激光显微镜观察直肠给药了p-MS栓剂制剂等 的、大鼠的肝脏组织的冷冻切片的结果的图。
图15是表示用共聚焦激光显微镜观察直肠给药了p-MS栓剂制剂等 的、大鼠的大肠组织的冷冻切片的结果的图。
图16是表示灌肠给药了以转甲状腺素基因为靶的VE-siRNA和上皮 透过性亢进化合物等的、小鼠的血清中转甲状腺素浓度的图。
具体实施方式
作为本发明的经大肠吸收用药物组合物(以下，也简单表示为“本发明 的药物组合物”。)，其特征在于，至少含有以下的(a)和(b)：
(a)细胞内具有作用部位、且结合有脂蛋白导入物质的生理活性物质 (以下，也简单表示为“本发明的生理活性物质”。)；
(b)具有前述生理活性物质的大肠粘膜上皮透过性亢进作用的化合物 (以下，也简单表示为“本发明的上皮透过性亢进化合物”。)。
本发明的药物组合物，通过以经由大肠肠道吸收的方式非侵袭性地向 对象给药，能够将本发明的生理活性物质高特异性地传递至特定组织的细 胞内。对于本发明的药物组合物的传递机理而设想概要，以本发明的代表 性的方式作为例子表示于图1中。即，图1表示使用“Toc-siRNA”(α-生育 酚所结合的siRNA)作为本发明的生理活性物质、使用亚油酸(LA)和表面活 性剂HCO-60的混合胶束(MM)作为本发明的上皮透过性亢进化合物、利用 内源性的乳糜微粒作为本发明的脂蛋白时的传递的概要。
如图1所示，将本发明的药物组合物(Toc-siRNA/MM)用栓剂、口服肠 溶制剂、其它口服药物传递系统等进行给药时，本发明的药物组合物中包 含的生理活性物质(siRNA)即使为难吸收性化合物，也可以在本发明的上 皮透过性亢进化合物(MM)的作用下，促进本发明的生理活性物质 (Toc-siRNA)被大肠(例如直肠)的粘膜上皮吸收。所吸收的本发明的生理活 性物质(Toc-siRNA)转移至淋巴管内，沿着淋巴液的流动而上行。另一方面， 来源于食物等的外因性脂质在小肠的粘膜上皮处转化为乳糜微粒(CM)等 脂蛋白，乳糜微粒被小肠的粘膜上皮吸收而转移至其附近的淋巴管内。在 淋巴管内上行的本发明的生理活性物质(Toc-siRNA)在小肠附近的淋巴管 内与乳糜微粒相遇，介由本发明的生理活性物质的脂蛋白导入物质部分 (Toc)而与乳糜微粒形成复合物(Toc-siRNA/CM)。该复合物(Toc-siRNA/CM) 通过静脉角而流出至静脉内，通过脂蛋白脂酶(lipopropteinlipase：LPL)而 残粒化，成为乳糜微粒残粒后，在具有残粒受体(LDL受体、LRP-1受体) 的肝脏细胞中，通过借助了所述残粒受体的胞吞作用而有效地组入肝脏细 胞内。作为本发明的药物组合物的传递机理而设想概要如上所述。
作为本发明的脂蛋白，只要是生物体内存在的脂蛋白就没有特别限 定，从能够高特异性地传递至肝脏细胞内的方面出发，可适合例示出乳糜 微粒或乳糜微粒残粒，其中，可特别适合例示出乳糜微粒。
作为前述本发明的生理活性物质，只要是细胞内具有作用部位且结合 有脂蛋白导入物质的生理活性物质、在生物体内能够发挥其生理活性，则 合成物质或天然物质均可，没有特别限定，作为所述生理活性物质，可以 使用市售品、适当制备而成的生理活性物质。作为所述生理活性物质之中 尤其优选的物质，可适合例示出分子靶化合物、细胞内受体配体化合物、 作用于细胞内细胞器的化合物，其中，可更适合例示出对生物体无有害作 用或即使有也在允许范围内的物质，其中，可进一步适合例示出亲水性较 高、难以被肠道上皮吸收的难吸收性化合物，其中，可更适合例示出多聚 核苷酸、多肽(包含肽)以及它们的修饰体或衍生物，具体而言，可进一步 适合例示出siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适配体、核 酶和DNA诱饵、质粒等核酸药物；激素、细胞因子等肽性药物；抗体药 物；等分子靶药物、生物药品，其中，可更适合例示出核酸药物，其中， 可特别适合例示出siRNA。作为以小鼠apoB基因为靶基因的siRNA，具 体而言，可例示出由以下构成的siRNA：由序列号 1(5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA-3’)构成的有义链(27mer) 与由序列号2(5’-UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3’)构成 的反义链(29mer)。此外，作为以人转甲状腺素基因为靶基因的siRNA， 具体而言，可例示出由以下构成的siRNA：由序列号 3(5’-GUAACCAAGAGUAUUCCAUUUUUACUA-3’)构成的有义链(27mer) 与由序列号4(5’-UAGUAAAAAUGGAAUACUCUUGGUUACAC-3’)构成 的反义链(29mer)。
另外，作为上述核酸药物中的核酸，优选为在生物体内以难以分解的 方式进行过修饰的核酸，特别是，核酸为RNA时，优选进行甲基化处理、 硫代磷酸化处理等抗RNase处理，以使其难以因细胞内的RNase而分解， 进一步优选核酸的核糖的2’位的甲基化处理、核酸骨架的键的硫代磷酸化 处理。进行甲基化、硫代磷酸化的核苷酸的数量、位置有时会对核酸所具 有的表达抑制活性造成一定影响，因此进行甲基化、硫代磷酸化的核苷酸 的数量、位置等的形态具有优选的形态。该优选的形态因作为修饰对象的 核酸序列而异，因此无法一概而论，但通过确认修饰后的核酸的表达抑制 活性，可以容易地调查优选的形态。例如，作为由前述序列号1和2构成 的siRNA中的优选的抗RNase处理的形态，可例示出对有义链(序列号1) 的核苷酸编号2、5、11、15、21、24和25的核苷酸以及反义链(序列号 2)的核苷酸编号1、2、5、12、14、21、24、25和26的核苷酸中的核糖的 2’进行甲基化，另外，对有义链(序列号1)的核苷酸编号26与27的核苷酸 之间的键进行硫代磷酸化，进而，针对反义链(序列号2)的核苷酸编号3、 4、6、27、28的核苷酸，将其核糖的2’进行甲基化并将其骨架的键进行硫 代磷酸化。
上述核酸药物中的核酸为抑制靶基因的表达的核酸时，所述核酸所具 有的“抑制靶基因的表达的活性”，是指将上述核酸导入细胞内时，与未 进行导入时相比，使其靶基因的细胞内的表达降低的活性。靶基因的细胞 内的表达的降低，通过对该靶基因的mRNA进行定量或对该靶基因所编码 的蛋白进行定量等来调查。作为本发明中使用的核酸抑制靶基因的表达的 程度，可例示出：将0.1～50mg/kg的该核酸导入规定的肠道内时，与未导 入时相比，传递组织细胞内(优选为肝脏细胞内)的靶基因的mRNA水平或 蛋白质水平的表达为80%以下，更优选为60%以下，进一步优选为40%以 下，再进一步优选为20%以下。
上述核酸为siRNA时，有义链和/或反义链的核苷酸数也可以为21， 但大于21时，由于上述脂蛋白导入物质和siRNA的一部分与siRNA(核苷 酸数为21)之间被细胞内的Dicer切断，核苷酸数21的siRNA可以有效地 发挥表达抑制效果，因而优选。
抑制上述靶基因的表达的核酸，可以基于靶基因的序列、其转录因子 能够结合的部分的序列等信息通过公知的方法进行设计。例如，若为 siRNA则可以使用日本特开2005-168485号中记载的方法、若为核酸适配 体则可以使用Nature,1990,346(6287):818-22中记载的方法、若为核酶则可 以使用FEBSLett,1988,239,285.；若为タンパク質核酸酶,可以使用1990, 35,2191.；NuclAcidsRes,1989,17,7059.中记载的方法等，来设计抑制靶 基因的表达的核酸。另外，反义寡核苷酸、antagomir、DNA诱饵可以基 于各自的靶基因的序列及其转录因子能够结合的序列的信息而容易地设 计。
上述核酸可以使用公知的方法等制备。例如，反义寡核苷酸、核酶可 以如下制备：基于靶基因的cDNA序列或基因组DNA序列来决定mRNA 或早期转录产物的靶序列，使用市售的DNA/RNA自动合成机(Applied BiosystemsInc、BeckmanCoulter,Inc.等)，合成与其互补的序列，从而制 备；另外，DNA诱饵、siRNA可以如下制备：用DNA/RNA自动合成机 分别合成有义链和反义链，在适当的退火缓冲液中以约90～约95℃进行约 1分钟左右的改性，然后以约30～约70℃进行约1～约8小时退火等，从而 制备。另外，核酸适配体可以通过日本特开2007-014292号中记载的方法 等来制备。
作为前述的本发明中的脂蛋白导入物质，只要是与前述的脂蛋白具有 亲和性的疏水性化合物或具有疏水性区域的化合物就没有特别限定，可适 合例示出与脂蛋白结合的、优选为特异性结合的、天然或合成脂溶性分子 以及它们的衍生物，其中，可更适合例示出对生物体无有害作用或即使有 也在允许的范围内的物质，其中，可进一步适合例示出甘油酯、胆固醇、 糖脂质、脂肪酸等脂质；维生素A、维生素E、维生素D、维生素K等脂 溶性维生素；酰基肉碱、酰基CoA等中间代谢物；以及它们的衍生物；其 中，从安全性更高的观点出发，可更适合例示出维生素E、胆固醇，可特 别适合例示出维生素E。此外，上述脂蛋白导入物质也可以组合2种以上 来使用。
作为上述维生素E，可适合例示出下述通式(1)所示的生育酚类或通式 (2)所示的生育三烯酚类、或者含有这些化合物中的2种以上的混合物。
[化合物1]
[化合物2]
(式中，R1、R2表示氢原子或甲基，R3表示氢原子或羧酸残基。)。 这些之中，优选α-生育酚(通式(1)中，R1=甲基、R2=甲基、R3=氢原子)、β- 生育酚(通式(1)中，R1=甲基、R2=氢原子、R3=氢原子)、γ-生育酚(通式(1) 中，R1=氢原子、R2=甲基、R3=氢原子)、δ-生育酚(通式(1)中，R1=氢原子、 R2=氢原子、R3=氢原子)、α-生育三烯酚(通式(2)中，R1=甲基、R2=甲基、 R3=氢原子)、β-生育三烯酚(通式(2)中，R1=甲基、R2=氢原子、R3=氢原子)、 γ-生育三烯酚(通式(2)中，R1=氢原子、R2=甲基、R3=氢原子)、δ-生育三烯 酚(通式(2)中，R1=氢原子、R2=氢原子、R3=氢原子)、以及它们的醋酸酯、 琥珀酸酯。特别优选α-生育酚、γ-生育酚。另外，作为维生素E，对d体、 l体、dl体的区别不做限定。
上述脂蛋白导入物质与上述生理活性物质的结合可以是直接结合，也 可以是期间介由其它物质进行的间接结合，优选用共价键、离子键、氢键 等化学键直接键合，其中，从可以得到更稳定的结合的方面出发，可特别 优选地例示出共价键。
作为使脂蛋白导入物质与生理活性物质结合的方法，没有特别限定， 例如，在生理活性物质为核酸的情况下，使核酸与脂蛋白导入物质共价键 合时，优选使脂蛋白导入物质与核酸按照TetrahedronLetters33;2729-2732. 1992.中记载的方法进行共价键合；而利用离子键、氢键时，优选的是，使 具有正电荷的精氨酸残基与脂蛋白导入物质结合，利用精氨酸残基的该正 电荷与siRNA等核酸所具有的负电荷的离子键、氢键而结合。此外，结合 于脂蛋白导入物质的精氨酸残基的数量，从得到其与核酸的更稳定的结合 的观点出发，优选为2以上，更优选为3以上，进一步优选为4以上。
作为与脂蛋白导入物质进行结合的生理活性物质的分子量，只要能够 获得本发明的效果就没有特别限定，从能够特别显著地享受到基于本发明 优点的观点出发，可适合例示出所述分子量处于1000～150000道尔顿的范 围内，其中，可更适合例示出处于5000～100000道尔顿的范围内，其中， 可进一步适合例示出处于5000～50000道尔顿的范围内。
作为本发明的药物组合物中包含的、本发明的上皮透过性亢进化合 物，只要是具有使本发明的生理活性物质在大肠粘膜上皮的透过性亢进的 作用的化合物，就没有特别限定，其中，可适合例示出使本发明的生理活 性物质在大肠粘膜上皮的细胞间隙透过性亢进的化合物，其中，可更适合 例示出与本发明的脂蛋白导入物质亲和性高的化合物，其中，可进一步适 合例示出不妨碍本发明的生理活性物质与本发明的脂蛋白在生物体内形 成复合物的化合物(优选为促进的化合物)，其中，可更适合例示出不妨碍 本发明的生理活性物质的淋巴移动性的化合物(优选为促进的化合物)，其 中，可进一步适合例示出其有效给药量对生物体为无害且不妨碍本发明的 生理活性物质的生理作用的化合物(优选为无生理活性的物质)，其中，可 更适合例示出对大肠粘膜的伤害性低的化合物(优选为对大肠粘膜无伤害 作用的化合物)，其中，可进一步适合例示出与本发明的生理活性物质形成 复合物的化合物，其中，可更适合例示出对对象给药时或透过对象的大肠 粘膜上皮时，能够与本发明的生理活性物质形成胶体分散体系(优选为混合 胶束、乳液、更优选为混合胶束)的化合物。作为本发明的上皮透过性亢进 化合物，具体而言，可适合例示出与本发明的脂蛋白导入物质的亲和性高、 且具有使本发明的生理活性物质在大肠粘膜上皮的透过性亢进的作用的 化合物(以下，也简单表示为“化合物A”。)、与上皮细胞间隙的紧密连接 或粘接相关的分子、或者与调节该分子的分子作用的化合物(以下，也简单 表示为“化合物B”。)，作为上述化合物A，可适合例示出天然或合成脂 质及其衍生物、表面活性剂以及肽等，其中，可更适合例示出中链脂肪酸、 长链不饱和脂肪酸、甘油单酯-二甘油酯和它们的衍生物(优选为盐、酯体 或醚体)或它们的混合物，其中，从上皮透过性亢进作用优异的观点出发， 可进一步适合例示出中链脂肪酸、长链不饱和脂肪酸和它们的衍生物(优选 为盐、酯体或醚体)，其中，从不仅上皮透过性亢进作用优异、而且还具有 促进脂蛋白形成作用或提高淋巴流速作用的观点出发，可特别适合例示出 长链不饱和脂肪酸和它们的衍生物(优选为盐、酯体或醚体)，作为上述化 合物B，可适合例示出紧密连接蛋白-4调节因子、EDTA、枸橼酸等螯合 化合物及其衍生物。
上述的中链脂肪酸是指碳原子数8～12的脂肪酸，作为所述中链脂肪 酸，包含辛酸(octanoicacid)、壬酸(nonanoicacid)、癸酸(decanoicacid)、 月桂酸(十二烷酸)，其中，可适合例示出癸酸、月桂酸，其中，可更适合 例示出癸酸。另外，上述的长链不饱和脂肪酸是指碳原子数12以上(优选 为12以上且30以下、更优选为12以上且24以下、进一步优选为14以 上且20以下)的不饱和脂肪酸，可以是一元不饱和脂肪酸，也可以是多元 不饱和脂肪酸(优选为二元～八元的不饱和脂肪酸、更优选为二元～六元的 不饱和脂肪酸、进一步优选为二元～四元的不饱和脂肪酸)，作为所述长链 不饱和脂肪酸，例如可适合例示出肉豆蔻脑酸(9-十四碳烯酸)、棕榈油酸(9- 十六碳烯酸)、油酸(顺-9-十八烯酸)、反油酸(反-9-十八烯酸)、异油酸(11- 十八烯酸)、亚油酸(顺,顺-9,12-十八碳二烯酸)、α-亚麻酸(9,12,15-十八碳三 烯酸)、γ-亚麻酸(6,9,12-十八碳三烯酸)、松油酸(5,9,12-十八碳三烯酸)、桐 油酸(9,11,13-十八碳三烯酸)、亚麻油酸(6,9,12,15-十八碳四烯酸)、鳕油酸 (9-二十碳烯酸)、二十烯酸(11-二十碳烯酸)、8,11-二十碳二烯酸、5,8,11- 二十碳三烯酸、花生四烯酸(5,8,11,14-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸 (5,8,11,14,17-二十碳五烯酸：EPA)、芥酸(13-二十二烯酸)、二十二碳二烯 酸(13,16-二十二碳二烯酸)、肾上腺酸(7,10,13,16-二十二碳四烯酸)、花生 五烯酸(4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸)、鱼油酸(二十二碳六烯酸：DHA)、 神经酸(顺-15-二十四碳烯酸)、二十四碳五烯酸(9,12,15,18,21-二十四碳五 烯酸)，其中，可更适合例示出油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸、 二十碳五烯酸，其中，可特别适合例示出亚油酸。
作为前述的表面活性剂，只要是具有使本发明的生理活性物质在大肠 粘膜上皮的透过性亢进的作用的表面活性剂，就没有特别限定，可例示出 HCO-60(聚氧乙烯氢化蓖麻油)、聚山梨酯、聚乙二醇、泊洛沙姆、单酰基 甘油、单酰基山梨糖醇酐、脂肪酸蔗糖酯类、聚氧乙烯烷基醚等非离子性 表面活性剂；月桂基硫酸钠等阴离子性表面活性剂；等等，其中，可适合 例示出聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯、聚乙二醇、泊洛沙姆、单酰基甘 油、单酰基山梨糖醇酐、脂肪酸蔗糖酯类、聚氧乙烯烷基醚等非离子性表 面活性剂，其中，可更适合例示出聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯、聚乙 二醇、泊洛沙姆、单酰基甘油、单酰基山梨糖醇酐、脂肪酸蔗糖酯类，其 中，可特别适合例示出聚氧乙烯氢化蓖麻油。
此外，本发明的上皮透过性亢进化合物可以组合使用2种以上，例如， 使用长链不饱和脂肪酸作为本发明的上皮透过性亢进化合物时，为了使长 链不饱和脂肪酸和本发明的生理活性物质形成复合物(优选为胶体分散体 系，更优选为混合胶束、乳液，进一步优选为混合胶束)，优选合并使用表 面活性剂。另外，使用中链脂肪酸作为本发明的上皮透过性亢进化合物时， 即使不组合使用表面活性剂也会与本发明的生理活性物质形成复合物，但 为了更充分地形成复合物(优选为胶体分散体系，更优选为混合胶束、乳液， 进一步优选为混合胶束)，优选组合使用表面活性剂。
作为前述的大肠粘膜上皮中的大肠，可适合例示出结肠(上行结肠、横 行结肠、下行结肠、S状结肠)、直肠，其中，可特别适合例示出直肠。
作为本发明的药物组合物或其制剂的剂型，只要是经大肠吸收用剂就 没有特别限定，可适合例示出栓剂、灌肠剂等大肠给药制剂；口服肠溶制 剂或パルシンキャップ(注册商标)(国际公开号1990/009168)、オロス(注册 商标)(F.ティーウェス、“OROS(R)浸透圧システムの発展”薬剤開発産業 と薬理学、9(7)、1331-1357(1983)、F.ティーウェス“誘発·脈動·プログ ラム化薬剤送達”新規な薬剤送達とその治療適用、L.F.プレスコット和 W.S.ニモス编、(ワイリー、ニューヨーク、1989)323-340页)、GI-MAPS(注 册商标)(日本特开2005-272416)等的口服药物传递系统(口服药物传递制 剂)。此外，这里经大肠吸收是指：除了在包括结肠、直肠等的大肠吸收之 外，还包括在小肠下部(回肠)的吸收。
将本发明的药物组合物制成制剂时，可以在本发明的生理活性物质和 本发明的上皮透过性亢进化合物中适当地配合药学上允许的载体，例如， 赋形剂、粘合剂、溶剂、助溶剂、悬浊化剂、乳化剂、等张剂、缓冲剂、 稳定化剂(优选为本发明的生理活性物质的稳定化剂)、pH调节剂、胶体稳 定剂、无痛化剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂、凝胶化剂、着色剂、润滑 剂、崩解剂、润湿剂、吸附剂、甜味剂、稀释剂等任意成分。所述任意成 分之中，从能够使本发明的药物组合物在大肠粘膜上皮的透过性更强烈地 亢进的观点出发，可适合例示出本发明的生理活性物质的稳定化剂、pH 调节剂、胶体稳定剂、抗氧化剂、增稠剂、凝胶化剂。另外，作为任意成 分，若还含有来自细胞内的核内体的脱出剂，则在能够增强本发明的生理 活性物质向细胞内靶分子的靶向方面是优选的。
作为本发明的药物组合物或其制剂的优选的形态，可适合例示出本发 明的生理活性物质与本发明的上皮透过性亢进化合物形成复合物，其中， 可更适合例示出形成胶体分散体系，其中，可进一步适合例示出形成混合 胶束或乳液，其中，可特别适合例示出形成混合胶束。若为所述形态，则 能够获得大肠粘膜上皮透过性特别优异的本发明的药物组合物。
另外，作为上述的大肠给药制剂等的适合的一例，可例示出将负载有 本发明的药物组合物的多孔性微粒制成栓剂而得到的制剂(以下，表示为 “含有多孔性微粒的栓剂”。)。所述栓剂具有如下优点：制造简便的优点、 能够获得对本发明的药物组合物的保护效果的优点、大肠给药时能够降低 本发明的药物组合物的过度稀释的优点。
本发明中的含有多孔性微粒的栓剂，只要是负载有本发明的药物组合 物的多孔性微粒就没有特别限定，其制造方法也可以使用以往公知的任何 制法(例如将市售的栓剂用基质与药物组合物混合的方法等)，但从制造更 为简便、且能够获得更优异的对药物组合物的保护效果、或者大肠给药时 能够进一步降低药物组合物的稀释的观点出发，作为本发明者所开发的以 下“含有多孔性微粒的粘膜适用栓剂的制造方法”中的“粘膜适用化合物 或药物组合物”(以下，也表示为“粘膜适用化合物等”。)，可适合例示出 利用了“灌肠用化合物或药物组合物”(以下，也表示为“灌肠用化合物等”。) 的制造方法。
作为含有上述的多孔性微粒的粘膜适用栓剂(以下，也表示为“含有多 孔性微粒的粘膜适用栓剂”。)的制造方法，为以下方法：将具有疏水基的 极性化合物即粘膜适用化合物等溶解在溶剂中，使该溶解液含浸由疏水性 高分子化合物形成的海绵状多孔性微粒，从而使粘膜适用化合物等亲和于 多孔性微粒内的空隙中，以给药后所述粘膜适用化合物等能够释放至粘膜 上的程度进行负载。上述的粘膜适用化合物为具有疏水基的极性化合物， 所述生理活性物质，可适合例示出细胞内具有作用部位、且结合有脂蛋白 导入物质的生理活性物质，作为上述的粘膜适用药物组合物，可适合例示 出包含所述生理活性物质的组合物。前述的生理活性物质可以是极性化合 物加成有疏水基的物质。另外，作为上述的疏水性高分子，可适合例示出 甲基纤维素、乙基纤维素等烷基纤维素，除此之外，还可例示氨基烷基甲 基丙烯酸酯共聚物、丙烯酸乙酯·甲基丙烯酸甲酯·甲基丙烯酸三甲基氯 化铵乙酯的共聚物、醋酸邻苯二甲酸纤维素、甲基丙烯酸共聚物、羟丙基 甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯和羧甲基乙基 纤维素等，其中，可更适合例示出烷基纤维素，其中，可进一步适合例示 出乙基纤维素。作为上述的多孔性微粒的形状、粒径，只要能够负载上述 的粘膜适用化合物等，就没有特别限定，作为形状，可适合例示出柱状、 立方体状、球状，作为粒径，可适合例示出0.5μm～500μm的范围，其中， 可更适合例示出5μm～50μm的范围。作为上述的疏水基，可适合例示出作 为前述的脂蛋白导入物质而例示出的化合物(例如胆固醇、脂溶性维生素)， 作为上述的生理活性物质，可适合例示出作为前述的生理活性物质而例示 出的化合物(例如多聚核苷酸、多肽)。另外，为了达到控制含有多孔性微 粒的粘膜适用栓剂的从多孔性微粒中的粘膜适用化合物等的释放、释放后 的分散、向粘膜的吸收的目的，也可以使表面活性剂、吸收促进剂等与粘 膜适用化合物等共同负载在多孔性微粒内的空隙中，另外，为了提高栓剂 的保存性，还可以使适合的保存剂等与粘膜适用化合物等共同负载在多孔 性微粒内的空隙中。含有多孔性微粒的粘膜适用栓剂的制造方法，除了使 用负载有粘膜适用化合物等的多孔性微粒来代替粘膜适用化合物等之外， 还可以使用通常的粘膜适用栓剂的制造方法，例如，可以使用市售的栓剂 用基质。作为所述栓剂用基质，例如可以根据用途适宜使用Gattefosse公 司制的栓剂用基质。另外，作为上述的含有多孔性微粒的粘膜适用栓剂的 制造方法的制造对象，只要是粘膜适用栓剂就没有特别限定，可适合例示 出直肠栓剂等大肠栓剂、阴道栓剂、尿道栓剂等。此外，使用由水溶性高 分子形成的多孔性微粒时，粘膜使用化合物等则使用极性化合物，所述多 孔性微粒与其粘膜适用化合物等亲和性高、能够确保在栓剂中的分散性， 但难以区别控制从给药后的栓剂中的多孔性微粒的释放和从多孔性微粒 中的粘膜适用化合物等的释放。因此，通过多孔性微粒来保护在消化道等 的粘膜上不稳定的粘膜适用化合物等的作用不仅不被认可或不充分，而且 通过所述粘膜适用化合物在给药粘膜上被稀释而导致被动运送的吸收还 会降低。与此相对，在使用由疏水性高分子形成的多孔性微粒与具有疏水 基的极性化合物(粘膜适用化合物等)的情况下，对粘膜适用化合物等的疏 水基进行选择-调整等，来调整多孔性微粒与粘膜适用化合物等的亲和性， 从而在多孔性微粒从给药后的栓剂中释放后，粘膜适用化合物等也可以得 到来自多孔性微粒的保护效果，另外，还可以降低在给药粘膜上的稀释。
作为本发明的药物组合物中的本发明的生理活性物质、本发明的上皮 透过性亢进化合物的含量，可在能够控制制剂中的释放量的机理(例如，释 放控制膜等)的基础上做任何设定，只要能够获得本发明的效果就没有特别 限定，可适合例示出消化道内的浓度分别独立地优选为0.1μM～1000mM的 范围内、更优选为10μM～50mM，本发明的药物组合物为液体制剂时，例 如在上述的基础上，可适合例示出优选为0.1μM～1000mM的范围内、更优 选为10μM～50mM。
作为本发明的药物组合物中含有的本发明的生理活性物质与本发明 的上皮透过性亢进化合物的摩尔比率，只要能够获得本发明的效果就没有 特别限定，可适合例示出1:1000～1000:1的范围内，可更适合例示出 1:100～100:1的范围内，可进一步适合例示出1:10～10:1的范围内。
从提高本发明的生理活性物质的向组织细胞内的传递效率、获得更好 的本发明的生理活性物质的生理活性的观点出发，本发明的药物组合物优 选在体内已诱导内源性脂蛋白(优选为乳糜微粒)产生的条件下向脊椎动物 给药。作为已诱导内源性脂蛋白(优选为乳糜微粒)的产生的条件，只要能 够实现该目的就没有特别限定，优选为从对脊椎动物口服给药脂质开始12 小时以内(例如10小时以内、8小时以内、6小时以内、4小时以内、2小 时以内、1小时以内)的条件。脂质的口服给药可以是直接给药脂质，也可 以是以包含脂质的食物的形式的给药。更优选在诱导内源性脂蛋白(优选为 乳糜微粒)的产生之前使给药对象通过绝食等处于饥饿状态。通过给药脂 质、进而在之前使给药对象处于饥饿状态，本发明的生理活性物质向细胞 内的组入效率会提高的详细作用机理尚不明确。然而若考虑到已知脂蛋白 组入相关的肝脏细胞的LRP-1受体因脂质的口服摄取或胰岛素而在细胞 膜处的表达量增加，并被活化(MolPharmacol.2007Jul3；17609417)，则 可以认为：通过摄取脂质等，脂蛋白组入相关的受体的表达量增加或被活 化，其结果，肝脏细胞的脂蛋白(优选为乳糜微粒)导入增加，其结果，脂 蛋白导入物质结合的本发明的生理活性物质向肝脏细胞内的组入效率提 高。此外，上述饥饿状态是指在一定时间内未摄取饮食(其中，不包括无卡 路里的水等饮食)的状态，包含例如6小时以上、优选为8小时以上、更优 选为12小时以上、进一步优选为24小时以上不对给药对象配给食物的状 态。
另外，本发明的药物组合物为经由大肠肠道吸收的药物组合物，根据 前述的剂型，可以口服或非口服地给药。即，口服肠溶制剂等口服DDS 制剂可以内服，栓剂、灌肠剂等大肠给药制剂可以从肛门插入或注入。
本发明的药物组合物的给药量，根据给药对象的年龄、体重、症状、 给药对象罹患的疾病的种类、该药物组合物中所含的本发明的生理活性物 质的种类等而异，例如可以一日分1～3次给药0.1～30mg/kg。
作为本发明的药物组合物的对象疾病，是因某些生理活性的异常(优选 为亢进或降低)而导致的疾病，只要是本发明的生理活性物质能够改善的疾 病就没有特别限定，作为因生理活性的异常而导致的疾病的例子，可适合 例示出因变异转甲状腺素基因的表达而导致的家族性淀粉样神经病，作为 因特定基因的亢进而导致的疾病的例子，可适合例示出因肝炎病毒基因的 表达亢进而导致的病毒性肝炎、肝癌。
作为本发明中的给药对象，只要是动物就没有特别限定，可适合例示 出脊椎动物，可更适合例示出属于哺乳类或鸟类的动物，其中，可进一步 适合例示出属于哺乳类的动物，其中，可更适合例示出人、大鼠、小鼠、 猪、兔、狗、猫、猴、马、牛、山羊、羊，其中，可特别适合例示出人。
另外，本发明的药物组合物还可以用作大肠给药制剂或口服肠溶制剂 的有效成分。
作为将本发明的生理活性物质传递至特定的组织细胞内的方法(以下， 也称为“本发明的传递方法”。)，只要具有将前述的本发明的药物组合物 以经由大肠肠道吸收的方式向脊椎动物给药的工序(X)，就没有特别限定， 从提高本发明的生理活性物质向组织细胞内的传递效率、更好地获得本发 明的生理活性物质的生理活性的观点出发，优选在体内已诱导内源性脂蛋 白(优选为乳糜微粒)的产生的条件下进行所述给药。
作为上述工序(X)中的给药方法，可以通过与上述本发明的药物组合 物同样的方法进行给药。
作为能够通过本发明的传递方法传递本发明的生理活性物质的组织 和细胞，只要是本发明中的脂蛋白在体内移动的组织和细胞，就没有特别 限定，脂蛋白为乳糜微粒或乳糜微粒残粒时，能够高特异性地向肝脏组织 细胞内(优选为肝实质细胞内)、肝细胞癌细胞内传递，从这一点出发可作 为特别适合的形态而例示出。
此外，本发明的传递方法通过适用于疾病动物或疾病患者，还可以用 作治疗本发明的疾病的方法。
作为本发明的其它形态，还可例示出：用于制备本发明的经大肠吸收 用药物组合物(或疾病治疗剂)的、本发明的生理活性物质和本发明的上皮 透过性亢进化合物的用途；疾病的治疗中的、本发明的生理活性物质和本 发明的上皮透过性亢进化合物的用途。
以下通过实施例来详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施 例。
实施例1
[维生素E结合小分子干扰RNA(VE-siRNA)的合成]
作为本发明的生理活性物质的1例，制作以小鼠apoB基因为靶基因 的siRNA。具体而言，合成由以下构成的siRNA：由序列号 1(GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA)构成的有义链(27mer)和由 序列号2(UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC)构成的反义链 (29mer)，并施加适当的化学修饰。在该siRNA的反义链5’末端用磷酸键 共价键合属于维生素E的天然型同分异构体之一的α-生育酚(Toc)来作为 脂蛋白导入物质，得到VE-siRNA(图2)。
实施例2
[荧光标记VE-siRNA向肝组织的传递试验1]
为了调查通过本发明能否有效地将生理活性物质向肝组织传递，进行 了下述试验。
(1)制剂的制备
作为透过性亢进剂，准备了亚油酸(LA)(和光纯药工业株式会社制)， 作为表面活性剂，准备了HCO-60(日光化学株式会社制)。使用 HCO-60(3.0w/w%)和RNAsefree的磷酸缓冲液(PBS)进行调节，以使LA 的最终给药浓度达到10mM，然后，通过超声波仪进行超声波处理，制备 成用时混合胶束。此外，该用时混合胶束用0.1NNaOH将pH调节至7.4。 将用时制备的混合胶束与荧光(Cy3)标记VE-siRNA(0.3mg/head)用移液管 充分混合，制备了用于传递试验的实施例制剂(HCO-60/LA/VE-siRNA)(制 剂E)。
另外，作为对照，分别制备：PBS(制剂A)；前述的用时混合胶束与 PBS混合而成的制剂(HCO-60/LA/PBS)(制剂B)；前述的用时混合胶束与荧 光(Cy3)标记siRNA(0.3mg/head)混合而成的制剂(HCO-60/LA/siRNA)(制剂 C)；使用HCO-60和PBS制备的用时混合胶束与荧光(Cy3)标记 VE-siRNA(0.3mg/head)混合而成的制剂(HCO-60/PBS/VE-siRNA)(制剂D)。
(2)向动物的直肠给药的制剂
作为给药通过前述的实施例2(1)制备的制剂的对象动物，准备了小鼠 (ICR、9周龄)。使该小鼠绝食一晚后，分三次每隔30分钟每次0.4ml口 服给予乳脂肪5%牛奶，从而促进乳糜微粒的形成。在最后一次给予牛奶 开始30分钟后，用戊巴比妥钠对小鼠实施麻醉，洗净肠道后，将前述的 任一种的制剂(约200μL)作为灌肠剂从肛门部给药(直肠给药)，接着，将肛 门部结扎。从单次给药制剂开始每隔2小时去除肠内残留药剂后，重新追 加给药同用量的制剂，合计进行3次给药。另外，针对实施例制剂(制剂 E)以及其它制剂，在绝食后不事先给予牛奶，并同样地进行制剂E的直肠 给药(Milk(-)HCO-60/LA/VE-siRNA)、在绝食后同样地事先给予牛奶，并 在直肠给药制剂E的30分钟之前，从尾静脉给药用生理盐水稀释的 Triton-X100(Sigma公司制)的溶液(20mg/kg)(Triton-Xprei.V. HCO-60/LA/VE-siRNA)。
(3)利用共聚焦显微镜观察siRNA的肝分布
在前述的实施例2(2)中，从最后给药制剂开始2小时后，在麻醉下用 4℃的生理盐水对小鼠进行回流，接着，摘出肝脏。将摘出的肝脏用4%多 聚甲醛(和光纯药工业株式会社制)固定一晚后，用30%蔗糖(和光纯药工业 株式会社制)固定一晚，接着，用O.C.T.Compound(SakuraFinetek公司制) 包埋，利用常规方法制作了冷冻切片。对于冷冻切片，使用TO-PRO(注册 商标)-3(MolecularProbe公司制)、Fluorescein(FITC)-phalloidin(Invitrogen 公司制)对各细胞核、细胞纤维进行染色。将用共聚焦激光显微镜观察这些 冷冻切片的结果示于图3。图3A表示给药制剂A时的结果，图3B表示 给药制剂B时的结果，图3C表示给药制剂C时的结果，图3D表示给药 制剂D时的结果，图3E表示给药制剂E时的结果，图3F表示绝食后不 事先给予牛奶而给药制剂E时的结果，图3G表示给药Triton-X100溶液 后给药制剂E时的结果。另外，图3A～G的各面板分为4部分，分别为： 左上表示TO-PRO(注册商标)-3的蓝色荧光的检测结果，右上表示 FITC-phalloidin的绿色荧光的检测结果，左下表示Cy3的红色荧光的检测 结果，右下表示将左上、右上和左下的荧光的检测结果重合而得的结果。
作为对照，给药制剂A(PBS)的A组、给药制剂B(HCO-60/LA/PBS) 的B组中，几乎未观察到基于Cy3的荧光(图3A和图3B)。与此相对， 给药HCO-60/LA(上皮透过性亢进化合物)和荧光(Cy3)标记VE-siRNA的混 合胶束即制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)的E组中，观察到基于Cy3的显 著的荧光(图3E)。这表示通过制成本发明中的经肠道吸收用药物组合物， 能够高效地将生理活性物质即siRNA经肠道传递至肝实质细胞内。
另外，给药从实施例制剂即制剂E中去除了LA的制剂 D(HCO-60/PBS/VE-siRNA)的D组中，几乎未检测到基于Cy3的荧光(图3 D)。这表示上皮透过促进剂即HCO-60/LA中的脂肪酸LA是VE-siRNA从 肠道传递至肝脏细胞内所必须的因子之一。
另外，给药使用荧光(Cy3)标记siRNA来代替实施例制剂即制剂E中 的荧光(Cy3)标记VE-siRNA的制剂C的C组中，几乎未检测到基于Cy3 的荧光(图3C)。这表示使siRNA与脂蛋白导入物质即VE结合是siRNA 从肠道传递至肝脏细胞内所必须的因子之一。
进而，即使在绝食后不事先给予牛奶，并直肠给药实施例制剂E的F 组(Milk(-)HCO-60/LA/VE-siRNA)中，也检测到了基于Cy3的荧光，但其 荧光不及事先给予牛奶的E组等的荧光显著(图3F)。若考虑到事先给予牛 奶会促进乳糜微粒的形成，则通过增加乳糜微粒的形成量，显示出 VE-siRNA从肠道向肝脏细胞内的传递效率提高。这表示生物体内的乳糜 微粒的形成是siRNA从肠道传递至肝脏细胞内所必须的因子之一。
另外，进行了Triton-X100的前给药处理的G组(Triton-Xprei.V. HCO-60/LA/VE-siRNA)中，几乎未检测到基于Cy3的荧光(图3G)。即，G 组中，不管是否进行事先给予牛奶，与E组相比，都会明显抑制VE-siRNA 从肠道向肝脏细胞内的传递。若考虑到Triton-X100具有抑制由乳糜微粒 形成残粒的活性，则该结果启示了siRNA的肝移动性与作为残粒的乳糜微 粒的肝移动性之间存在相关关系。因此，由乳糜微粒形成残粒是siRNA从 肠道传递至肝脏细胞内所必须的因子之一。
实施例3
[荧光标记VE-siRNA向小鼠的淋巴液组入的确认试验1]
为了调查本发明的生理活性物质向肝组织的传递机理，进行了下述试 验。
准备了小鼠(ICR、9周龄)。使该小鼠绝食16小时后，分三次每隔30 分钟每次0.4ml口服给予乳脂肪5%牛奶，从而促进乳糜微粒的形成。从最 后一次给予牛奶开始30分钟后，用戊巴比妥钠对小鼠实施麻醉，洗净肠 道后，将约200μL的前述实施例2的制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)作为 灌肠剂从肛门部给药(直肠给药)，接着，将肛门部结扎。从单次给药前述 的制剂开始2小时后，从该小鼠的肠道淋巴管中采取淋巴液。使用荧光相 关光谱(FCS)求出该淋巴液中的经Cy3标记的分子的扩散时间。另外，作 为对照，使用荧光(Cy3)标记VE-siRNA来代替制剂 E(HCO-60/LA/VE-siRNA)，同样地进行FCS。将这些FCS的结果示于图4。
由图4的结果可知，与给药对照时相比，给药制剂E时，基于Cy3 的荧光的扩散时间显著增加，为2500微秒左右。这启示了：荧光(Cy3)标 记VE-siRNA通过HCO-60/LA(上皮透过性亢进化合物)更多地组入到与小 鼠的淋巴液内的乳糜微粒大小相当的分子中。
实施例4
[荧光标记VE-siRNA向小鼠的淋巴液组入的确认试验2]
准备了小鼠(ICR、9周龄)。使该小鼠绝食16小时后，分三次每隔30 分钟每次0.4ml口服给予乳脂肪5%牛奶，从而促进乳糜微粒的形成。从最 后一次给予牛奶开始30分钟后，用戊巴比妥钠对小鼠实施麻醉，洗净肠 道后，结扎肠道的远端侧或肛门，制作肠袢，从袢的肛门部给药10mg/kg 的前述实施例2中的制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)。
从最终给药2小时后，从小鼠的肠道淋巴管采取淋巴液。使用荧光相 关光谱(FCS)求出经Cy3标记的分子的扩散时间。此外，用高效液相色谱 法(HPLC)从采取自无处置小鼠的淋巴液中分离脂蛋白部分，同样地求出扩 散时间并加以比较。将其结果示于图5。
图5的结果中，Cy3所结合的颗粒的扩散时间约为3000μs，与通过 HPLC分离淋巴液时的乳糜微粒部分的扩散时间一致。这表示通过直肠给 药的VE-siRNA被吸收而进入淋巴管，并在淋巴管内与乳糜微粒结合。
实施例5
[检测直肠给药的VE-siRNA的反义链的RNA印迹分析]
为了调查本发明的生理活性物质向肝组织的传递机理，接着，进行了 如下的RNA印迹分析。
首先，作为给药对象即小鼠，除了野生型的小鼠之外，还准备了将相 对于乳糜微粒的主要受体的相关蛋白质敲除（knockout）的3种小鼠。即， 准备了野生型小鼠(Wildtype)、LDL受体敲除的小鼠(LDLRKO)、受体结 合蛋白质(ReceptorAssociatedProtein：RAP)敲除的小鼠(RAPKO)、ApoE 敲除的小鼠(ApoEKO)。相对于乳糜微粒的主要受体有LDL受体和LRP-1 受体，RAP具有对LRP-1受体的拮抗阻碍作用。另外，ApoE为LRP-1受 体的天然配体之一，存在于乳糜微粒中而非细胞膜中。
对前述的各小鼠每隔2小时共计3次直肠给药VE-siRNA与混合胶束 (HCO-60/LA)的混合物(HCO-60/LA/VE-siRNA)，在最终给药的2小时后从 各小鼠中摘出肝脏。直肠给药的方法和肝脏摘出的方法按照实施例2中记 载的方法进行。此外，针对LDL受体敲除的小鼠，除了直肠给药 HCO-60/LA/VE-siRNA的组外，还设置了在所述直肠给药之前静脉注射 RAP的组。
按照常规方法从前述摘出的肝脏的细胞中提取总RNA。将该总 RNA(10μg)用14%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，转印至尼龙膜。另一方面， 作为与所给药的VE-siRNA的反义链进行杂交的探针，准备与VE-siRNA 的有义链为同一序列的探针，使用GeneImages3’-Oligolabelling Kit(AmershamBiosciences公司制)用荧光素对所述探针进行荧光标记。使 该荧光标记探针与前述的尼龙膜反应后，使用GeneImagesCDP-star detectionKit(AmershamBiosciences社制)，检测荧光素的荧光。将该结果 示于图6。
对野生型小鼠直肠给药HCO-60/LA/VE-siRNA时的泳道(1)(Wildtype) 中，清晰地检测出在21核苷酸(nt)优势位存在21nt和29nt的2条带。考 虑到所给药的VE-siRNA的反义链为29mer，并被细胞质内的切酶(Dicer) 切断和出现21mer的成熟的siRNA的反义链时，该结果表示所给药的 VE-siRNA被组入至肝脏细胞的细胞质内。
另一方面，对将相对于乳糜微粒的主要受体的相关蛋白质敲除的3种 小鼠进行直肠给药时的泳道(3)(LDLRKO)、泳道(4)(RAPKO)、泳道 (5)(ApoEKO)中，与泳道(1)相比，可观察到带浓度的降低。特别是，对静 脉注射了具有对LDL受体、LRP-1受体的拮抗阻碍作用的RAP的、LDL 受体敲除的小鼠(LDLRKO)进行直肠给药时的泳道(2)中，带基本消失。可 以认为这些结果表示了直肠给药的HCO-60/LA/VE-siRNA介由LDL受体 和LRP-1受体而组入了肝脏细胞内。
在该实施例5的结果的基础上，合并考虑前述实施例2～4的结果时， 可以认为其为如下所述的传递机理。VE-siRNA作为混合胶束进行直肠给 药时，通过LA的上皮透过性亢进作用而透过肠道上皮。其后，VE-siRNA 向淋巴管移动，在淋巴管内上行。此时，VE-siRNA与小肠上皮细胞中所 产生的并向淋巴管内分泌的乳糜微粒相遇，介由脂蛋白导入物质即VE修 饰部分与乳糜微粒形成复合物。该VE-siRNA-乳糜微粒复合物通过静脉角 而流出至静脉内，通过脂蛋白脂酶(lipopropteinlipase：LPL)而残粒化，成 为乳糜微粒残粒后，组入到具有残粒受体(LDL受体、LRP-1受体)的肝脏 细胞内。
实施例6
[用于确认给药了VE-siRNA的序列特异性基因表达抑制效果的定量 RT-PCR]
为了调查本发明的生理活性物质是否被传递至肝组织、并在细胞内实 际地发挥功能，进行了如下所述的定量RT-PCR。
对小鼠每隔2小时共计3次直肠给药HCO-60/LA/VE-siRNA，在最终 给药的24小时后摘出小鼠的肝脏。直肠给药的方法和肝脏摘出的方法按 照实施例2记载的方法进行。按照常规方法从前述摘出的肝脏的细胞中提 取出总RNA。其总RNA之中，使用2μg合成与其互补的DNA(cDNA)。 以该cDNA为模型，使用前述VE-siRNA的靶即基因(apoB基因)的引物- 探针，按照常规方法进行定量RT-PCR。另一方面，作为内源性对照，对 不会成为前述VE-siRNA的靶的内源性基因也进行了同样的定量RT-PCR。 另外，用仅直肠给药混合胶束(HCO-60/LA)来代替HCO-60/LA/VE-siRNA， 并用同样的方法进行定量RT-PCR。从这些定量RT-PCR的结果求出各小 鼠个体中的靶基因的表达量与内源性基因的表达量的比率(相对靶mRNA 水平)。在给药了VE-siRNA的小鼠(混合胶束＋VE-siRNA)与仅给药混合胶 束的小鼠(混合胶束单独)之间，比较相对靶mRNA水平的值。将其结果示 于图7。
由图7的结果可知，给药了HCO-60/LA/VE-siRNA的组中，与仅给药 了混合胶束(HCO-60/LA)的组相比，能够抑制约40%的靶基因的表达(图 7)。该结果表示本发明的生理活性物质在直肠给药后被传递至肝组织中， 并在细胞内实际地发挥功能(生理活性)。
实施例7
[用于确认给药了VE-siRNA的序列特异性基因表达抑制效果的蛋白 免疫印迹法分析]
为了调查本发明的生理活性物质是否被传递至肝组织、并在细胞内实 际地发挥功能，进行了如下所述的蛋白免疫印迹法分析。
对小鼠每隔2小时共计3次直肠给药HCO-60/LA/VE-siRNA。直肠给 药的方法按照实施例3记载的方法进行。在最终给药的24小时后采取小 鼠血清并用匀浆缓冲液(0.1%SDS、1%TritonX、1%去氧胆酸钠(sodium deoxycholate)、1mMPMSF)进行调整，制成样品。作为1次抗体，将sc11795 goatanti-ApoB(Santacruz公司制)稀释500倍后使用。此外，作为2次抗体， 将sc2020donkeyanti-goat(Santacruz公司制)稀释2000倍后使用。用 SupersignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(Thermo公司制)进行 荧光显色，用ChemiDocXRS-J(BIORAD公司制)进行拍摄。由检测结果 定量带的浓度，并求出apoB100/48比。在给药了VE-siRNA的小鼠与仅给 药了混合胶束的小鼠之间比较apoB100/48比。将这些结果示于图8的A、 B。
由图8的A、B的结果可知，给药了HCO-60/LA/VE-siRNA的组中， 与仅给药了混合胶束的组相比，靶基因表达的蛋白质减少了约74%。该结 果表示即使是蛋白质的水平，本发明的生理活性物质在直肠给药后也被传 递至肝组织，并在细胞内实际地发挥功能。
实施例8
[用于确认给药了VE-siRNA的序列特异性基因表达抑制效果的血清 中的中性脂肪、LDL胆固醇值的测定]
为了调查本发明的生理活性物质是否被传递至肝组织、并在细胞内实 际地发挥功能，继续进行了如下所述的分析。
对小鼠每隔2小时共计3次直肠给药HCO-60/LA/VE-siRNA。直肠给 药的方法按照实施例3记载的方法进行。在最终给药的24小时后采取小 鼠血清，测定中性脂肪值和LDL胆固醇值。将其结果示于图9。
由图9的结果可知，给药了HCO-60/LA/VE-siRNA的组中，与仅给药 混合胶束的组相比，血清中的中性脂肪值和LDL胆固醇值均降低约40%。 该结果表示本发明的生理活性物质在直肠给药后被传递至肝组织，并在细 胞内实际地发挥功能，作为抑制血清中脂质的药物而起到有效作用。
实施例9
[荧光标记VE-siRNA向肝组织的传递试验2]
为了调查即使使用HCO-60/LA以外的上皮透过性亢进化合物时，生 理活性物质是否也会有效地向肝组织传递，进行了下述试验。
在前述实施例2的(3)中，使用将制剂E的“LA”变更为“DHA”(Cayman chemical公司制)而成的制剂(DHA/HCO-60/VE-siRNA)(图10的A)来代替 制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)、使用利用了癸酸钠(Sigma公司制、最终 浓度15mM)的制剂(SodiumCaprate/VE-siRNA)(图10的B)来代替制剂E的 “HCO-60/LA”、使用利用了枸橼酸(nacalai公司、最终浓度20mM)的制剂 (Citricacid/VE-siRNA)(图10的C)来代替制剂E的“HCO-60/LA”、使用利 用了表面活性剂Labrasol(注册商标)(GATTEFOSSE公司制；2w/v%)即 PEG-8辛酸/癸酸甘油酯的制剂(Labrasol/VE-siRNA)(图10的D)来代替制剂 E的“HCO-60/LA”，并用与实施例2记载的方法同样的方法进行了向肝组 织的传递试验。所述传递试验中，将用共聚焦激光显微镜观察小鼠的肝脏 组织的冷冻切片的结果示于图10A～D。另外，图10A～D的各面板分为4 部分，分别为：左上表示TO-PRO(注册商标)-3的蓝色荧光的检测结果， 右上表示FITC-phalloidin的绿色荧光的检测结果，左下表示Cy3的红色荧 光的检测结果，右下表示将左上、右上和左下的荧光的检测结果重合而得 的结果。
由图10A～D的结果可知，即使在使用HCO-60/LA以外的上皮透过性 亢进化合物的情况下，尽管传递效率的程度存在差异，但显示出能够将生 理活性物质传递至肝组织。但是，在使用表面活性剂Labrasol(注册商标) 时，虽然确认向肝组织移动，但基本无法确认向肝实质细胞内的传递(图 10D)，在使用螯合剂即枸橼酸时，确认到与使用HCO-60/DHA(长链不饱 和脂肪酸)时(图10A)相同程度地促进向肝实质细胞的传递效果，在使用癸 酸钠(中链脂肪酸盐)时，促进向肝实质细胞的传递效果最优异。另外，虽 然未在图中显示结果，但使用HCO-60/EPA(长链不饱和脂肪酸)、或使用 HCO-60/油酸(长链不饱和脂肪酸)来代替HCO-60/LA时，也显示了与使用 HCO-60/DHA时同等程度以上的促进传递的效果。
由以上结果明确了：在本发明的药物组合物中，即使在使用 HCO-60/LA以外的上皮透过性亢进化合物时，也可能将生理活性物质向肝 组织传递，但将长链不饱和脂肪酸、中链脂肪酸制成胶体分散体系的形态 等特定物质特别有效。
实施例10
[VE-siRNA的副作用试验]
为了调查VE-siRNA对小鼠的副作用，进行了如下所述的血液试验。
对小鼠每隔2小时共计3次直肠给药HCO-60/LA/VE-siRNA。给药方 法按照实施例3记载的方法进行。最终给药的3小时后采取小鼠血清，测 定IFN-α值。另外，分别测定从最终给药24小时后的小鼠采取的血清中 的Cre、ALT、Na、K的值。在给药了HCO-60/LA/VE-siRNA的小鼠与仅 给药PBS的小鼠之间，比较这些值。将其结果示于表1。
[表1]
由表1的结果可知，给药了HCO-60/LA/VE-siRNA的小鼠组中，与仅 给药PBS的小鼠组相比，各值未见显著差异。该结果表示即使给药 VE-siRNA也不会对生物体产生副作用。
实施例11
[荧光标记VE-siRNA向各组织的传递试验]
为了确认VE-siRNA的传递是否为肝细胞特异性的，进行了如下的向 肝细胞以外的脏器的传递试验。
对小鼠单次直肠给药实施例2的制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)。给药 方法按照实施例3记载的方法进行。最终给药4小时后从小鼠摘出肺、肾 脏、脾脏、心脏、骨格肌和脑。各脏器摘出的方法按照实施例2记载的方 法进行。进而，用与实施例2记载的方法同样的方法进行了向各组织的传 递试验。但是，在肺、肾脏、脾脏、心脏、骨格肌、脑中的任一组织中均 未明确确认出Cy3信号。该结果和先前示出的肝中的结果启示了荧光(Cy3) 标记VE-siRNA主要向肝脏传递。
实施例12
[作为VE-siRNA的中空栓剂的给药]
作为VE-siRNA的直肠给药剂型，尝试了用固体制剂或半固体制剂即 栓剂的制剂化来代替液状制剂即灌肠剂。首先，使用能够填充液状或固体 制剂的中空栓剂来进行评价。
(1)中空栓剂的制备
加温熔解10g油脂性栓剂基质(SUPPOCIREAM PASTILLES,GATTEFOSSE社制)，添加并混合1～10g大豆油，制备了栓剂 用基质。此外，添加了10g大豆油的基质的熔点为约32℃。使以约50℃ 熔解的栓剂基质流入预先冷却至-20℃的栓剂模型中，在基质和模型的接触 部分固化的时间点，将中心轴附近的未固化的部分的基质拔出，通过以上 方法制备了中空栓剂。
(2)含有Cy3标记VE-siRNA的中空栓剂的制备
用实施例2的制剂E(HCO-60/LA/VE-siRNA)使LA的最终浓度为 100mM，向其添加作为粘膜保护剂的牛磺酸(最终浓度100mM)，在冷却下 进行短时间超声波处理，从而制备了混合胶束液。将退火后冻结干燥的 Cy3标记VE-siRNA(1mg)溶解于主混合胶束液，并注入上述实施例12(1) 的中空型栓剂中，然后用同栓剂基质进行密封，从而制备了含有Cy3标记 VE-siRNA的中空栓剂。此外，在Cy3标记VE-siRNA(1mg)的混合胶束液 中添加PBS制成总量200μL的灌肠剂，作为阳性对照制剂。
(3)肝传递性的体内（invivo）评价
使大鼠(Wistar、雄、7周龄、体重180g)绝食一晚，在给药药剂的2 小时前，分三次每隔30分钟每次1.2mL给药给予浓缩牛奶(乳脂肪成分 20%)。在最后一次给予牛奶开始30分钟后，用戊巴比妥钠麻醉，通过肛 门部给药各制剂后，将肛门部结扎。给药4小时后，按照实施例2记载的 方法，摘出肝脏和大肠，通过共聚焦显微镜观察siRNA的分布。图11表 示观察肝脏组织的结果。图11a表示给药灌肠剂时的结果，图11b表示给 药中空栓剂时的结果，图11c表示图11b的框内的放大图。另外，图11a～c 的各面板分为4部分，分别为：左上表示TO-PRO(注册商标)-3的蓝色荧 光的检测结果，右上表示FITC-phalloidin的绿色荧光的检测结果，左下表 示Cy3的红色荧光的检测结果，右下表示将左上、右上和左下的荧光的检 测结果重合而得的结果。
如图11所示，在给药灌肠剂时(图11a)、给药中空型栓剂时(图11b、 c)的任一情况下，均检测到基于Cy3的明确的荧光，可以确认VE-siRNA 向肝脏移动-分布。
实施例13
[作为使用了多孔性微粒的栓剂给药VE-siRNA]
中空栓剂的制造工序略显繁杂，另外，在中空栓剂内部填充液状制剂 时，给药栓剂而液状制剂释放到肠内后，与灌肠剂同样面临在肠道腔内的 稀释、酶分解等课题。另一方面，作为在中空栓剂内部填充固体制剂来制 备通常的栓剂的方法，可以考虑将VE-siRNA混合胶束液冻结干燥后均质 添加在栓剂基质中的方法，但在VE-siRNA混合胶束液的冻结干燥制剂的 品质控制方面存在较多问题。因而，发明人等考察了如下方法：通过使用 具有较多中空部的多孔性微粒，将VE-siRNA的混合胶束液简便地粉末固 体化，将其均质地混合分散在常用的油脂性栓剂基质中，从而制备栓剂。 根据该制剂，可以获得如下优点：制造工序简单的优点、保护在多孔性微 粒内中保持的VE-siRNA不受肠道腔内的酶的分解、稀释的优点。
(1)多孔微球(p-MS)的制备
将2g乙基纤维素(日新化成社制、STD7cps)溶解在16g丙酮中(A液)。 另外，将7g甘油与1g5%聚乙烯醇(KURARAYCO.,LTD制、 KURARAYPOVAL220C)水溶液混合(B液)。使用乳化机(Physcotron(注册 商标)、MICROTECCO.,LTD.制)在A液中将B液乳化处理1分钟(油相)。 另一方面，制备混合了45g甘油和5g5%聚乙烯醇(KURARAYCO.,LTD制、 KURARAYPOVAL220C)水溶液的液体，在利用THREE-ONEMOTOR以 600rpm进行搅拌下，注入油相，搅拌1分钟。将所得乳化液立即注入到 500mL的纯化水中，进行搅拌，使油相固化后，使用开口20μm的筛并减 压过滤p-MS。滤取的p-MS用100mL的纯化水洗涤2次后，用少量的纯 化水再次悬浊，冻结干燥。将用扫描型电子显微镜观察所得多孔性微球的 结果示于图12。
(2)含有Cy3标记VE-siRNA的p-MS栓剂的制备
将Cy3标记VE-siRNA(10mg/mL)/50mMLA/HCO-60的混合胶束40μL 含浸在9mgp-MS中后，在JAPOCIRE(注册商标)NA15PASTILLES:大豆 油=9:1的混合基质500μL中均质混合-分散，制作含有Cy3标记 VE-siRNA/p-MS的栓剂(图13)。另外，作为对照制剂，制备了灌肠剂形式 的、将含有上述高浓度混合胶束/Cy3标记VE-siRNA的p-MS分散在500μL 生理盐水中而成的溶液。此外，上述的“JAPOCIRE(注册商标)NA15 PASTILLES”是指Gattefosse公司制的栓剂用基质的1种，具体而言，是碳 原子数为12～18的饱和脂肪酸的半合成甘油三酯基质(羟值10；熔点 34.5±1.0)。在日本，可以从例如CBC株式会社购买所述制品。
(3)p-MS制剂的肝移动性的体内（invivo）评价
按照实施例12，对绝食一晚的大鼠(Wistar、雄、4周龄、体重80g) 分三次每隔30分钟每次0.5ml地给予浓缩牛奶(乳脂肪成分20%)，然后， 在最后一次给予牛奶开始30分钟后，用戊巴比妥钠麻醉，洗涤肠道后， 通过肛门部给药各制剂。给药后将肛门部结扎，将大鼠放在伯尔曼箱（ボ ールマンケージ）内。给药6小时后，按照实施例2记载的方法，摘出肝 脏、大肠、肾脏、心脏、肌肉、小肠，通过共聚焦显微镜法观察给药各制 剂后的siRNA的分布。图14表示给药对照用p-MS灌肠剂(图14a)或给药 p-MS栓剂制剂(图14b)后的肝脏的组织像。图14a和b的各面板纵向分 为4部分，分别为：最上面表示TO-PRO(注册商标)-3的蓝色荧光的检测 结果，上数第二个表示FITC-phalloidin的绿色荧光的检测结果，上数第三 个表示Cy3的红色荧光的检测结果，最下面表示将上面的3个荧光的检测 结果重合而得的结果。
图14a、b的任一情况下，在一部分的区域均观察到基于Cy3的荧光 的VE-siRNA的移动。尤其是给药p-MS栓剂制剂时，虽然荧光的强度自 身较低，但在多个肝细胞内检测到Cy3的荧光。
图15表示调查同样给药后6小时后的大肠组织中的Cy3-VE-siRNA 的分布的结果。图15a和b表示观察大肠上部的粘膜组织的结果，图15c 和d表示观察大肠下部的粘膜组织的结果。另外，图15a和c表示给药 p-MS灌肠剂时的结果，图15b和d表示给药p-MS栓剂时的结果。
给药p-MS栓剂时，与大肠下部(图15d)相比，在大肠上部的粘膜组 织内可确认到Cy3的显著移动-残留(图15b)。另一方面，给药p-MS灌肠 剂时，大肠下部(图15c)中与给药栓剂时为同等程度，基本上未确认大肠 上部的Cy3的移动-残留(图15a)。另外，给药p-MS灌肠剂和p-MS栓剂 后的小肠、肌肉、心脏、肾脏中基本上未检测到Cy3。该结果暗示了：Cy3 标记VE-siRNA通过制备成p-MS栓剂，较之大肠部，会更有效地传递至 肝细胞中。
如此，显示了VE-siRNA不仅可以作为灌肠剂，而且通过使用中空栓 剂也可以进行作为栓剂的制剂化。另外，还表明：通过进一步使用多孔性 微粒，可以将液体制剂容易地均质分散在油脂性栓剂基质中来制造栓剂， 可以更有效地传递至肝脏组织中。
实施例14
[以转甲状腺素基因为靶基因的VE-siRNA的基因表达抑制效果]
作为除了以小鼠apoB基因为靶基因的siRNA以外的、本发明的生理 活性物质，尝试了使用以转甲状腺素(TTR)基因为靶基因的siRNA的试验。 作为所述siRNA，合成并使用由以下构成的siRNA：由序列号 3(5’-GUAACCAAGAGUAUUCCAUUUUUACUA-3’)构成的有义链(27mer) 和由序列号4(5’-UAGUAAAAAUGGAAUACUCUUGGUUACAC-3’)的反 义链(29mer)。
(1)VE-siRNA的合成
在相对于TTR基因的上述siRNA的反义链5’末端用磷酸键共价键合 属于维生素E的天然型同分异构体之一的α-生育酚(Toc)来作为脂蛋白导 入物质，制作VE-siRNA。
(2)含有VE-siRNA的灌肠剂的制备
除了使用上述实施例14(1)中得到的VE-siRNA来代替上述实施例2(1) 中使用的VE-siRNA之外，按照上述实施例2(1)记载的方法，制备了灌肠 剂(HCO-60/LA/VE-siRNA)。另外，作为对照，将PBS与混合胶束液混合， 制备成对照灌肠剂(HCO-60/LA/PBS)，用以代替VE-siRNA。
(3)肝传递性的体内（invivo）评价
将带有人转甲状腺素(hTTR)基因的转基因小鼠即hTTRV30MTg小鼠 (雌、6月龄、体重30g、一组5只)用戊巴比妥钠麻醉，轻微地按摩小鼠下 腹部使其排出肛门部附近残留的粪便，然后通过各自的肛门部给药上述(2) 中制备的各灌肠剂(一次给药量：10mg/kg)。给药后，在用夹子夹住肛门部 的状态下，将小鼠静置20分钟，然后松开夹子，将小鼠放回通常的饲育 箱。该给药方法如下进行：每隔4小时、一日3次、连续5日。在给药前 以及给药开始后第6日、第9日、第12日的时间点进行采血，将全血离 心分离来采取血清。测定各血清中的hTTR的浓度(mg/dL)。将给药前的血 清和给药开始第12日的血清中的hTTR的浓度(mg/dL)示于图16。如图16 可知，实践证明了通过给药由相对于TTR的VE-siRNA和本混合胶束形成 的灌肠剂，可以抑制血清中的TTR分泌蛋白质。
工业实用性
本发明涉及疾病治疗的领域，更详细而言，可以适用于涉及经大肠吸 收用药物组合物的领域。