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1、(10)授权公告号 CN 103004463 B (45)授权公告日 2013.10.16 CN 103004463 B *CN103004463B* (21)申请号 201210368161.7 (22)申请日 2012.09.28 CCTCC No.M2012307 2012.08.09 A01G 1/04(2006.01) (73)专利权人 贵阳中医学院 地址 550002 贵州省贵阳市市东路 50 号贵 阳中医学院微生物教研室 (72)发明人 梁建东 田维毅 王平 韩洁 何光志 王文佳 蔡琨 (74)专利代理机构 北京联创佳为专利事务所 ( 普通合伙 ) 11362 代理人 张浩宇 (。
2、54) 发明名称 一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实体 人工培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高雄山虫草子实体低产孢 菌株及子实体人工培养方法。该菌株为高雄山虫 草子实体低产孢菌株 A1105， 其子实体的人工培 养方法包括种子液制备、 人工培养基制备、 接种、 培养、 收获等步骤。 在本发明的人工培养方法下该 菌株可发育形成产孢极低的子实体， 有效解决了 现有技术在高雄山虫草人工培养中子实体生长过 程会产生大量分生孢子的技术难题， 保障了生产 人员的健康安全， 同时也提高了高雄山虫草子实 体的产量， 在高雄山虫草的人工培养中有良好的 应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int。
3、.Cl. 审查员 许炎炎权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103004463 B CN 103004463 B *CN103004463B* 1/1 页 2 1. 一种高雄山虫草子实体低产孢菌株 A1105， 保藏号为 ： CCTCC M2012307。 2. 根据权利要求 1 所述的高雄山虫草子实体低产孢菌株， 其特征在于 ： 分离自罹病昆 虫标本， 在 Czapek 琼脂培养基上， 25下培养 21 天时， 菌落平均直径为 32mm， 正面白色到 肉色， 。
4、粉质， 背面白色到褐色， 菌落平展、 薄， 边缘整齐， 未见形成环带或放射沟， 未见角变现 象， 未见形成孢梗束。 3.一种如权利要求1或2所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法， 其特征在于 ： 包含以下步骤 ： （1） 人工培养基制备 ： 取去皮的小麦粒 100g， 用清洁水浸泡 12h， 滤去多余水分后放入 培养盒内， 采用高压间歇灭菌法灭菌 2-3 次备用， 每次灭菌温度控制在 115， 时间控制在 40min ； （2） 将 A1105 菌株摇瓶培养制成种子液， 向培养基上接种种子液 45ml， 置于 25下暗 培养 10 天左右， 见有转色迹象时， 转入 16和 22下 , 交替。
5、变温培养各 12h ； 其中在 22 时， 见光培养 12h， 光照强度为 200xl， 在 16时， 暗培养 12h ； 25 天后即可收获子实体。 4. 根据权利要求 3 所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 所述培养盒体积为 13cm8cm11cm， 步骤 （2） 所述培养基体积为 13cm8cm3.5cm。 5. 根据权利要求 3 所述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述 A1105 菌株摇瓶培养的温度为 25， 转速 250r/min， 培养 4 天， 菌丝段达 107ml-1。 6. 根据权利要求 3 所述的。
6、高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法， 其特征在于 ： 在步 骤 （2） 所述子实体第一次收获后补水， 按照与第一次培养相同的方法， 进行二次培养。 权 利 要 求 书 CN 103004463 B 2 1/3 页 3 一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实体人工培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物及其子实体的人工培养方法， 尤其是一种高雄山虫草低产 孢菌株及其子实体的人工培养方法， 属于真菌培养技术领域。 背景技术 0002 高 雄 山 虫 草Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz. 1941（= Isaria tenuipes peck （1。
7、879） =Isaria japonica Yasuda （1915） =Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson（1974） = Paecilomyces japonica ） 是一种优良的虫草资源， 它在抗癌、 抗抑郁、 抗 虫、 抗菌、 抗病毒及调节免疫力等方面有明显作用。它的抗癌成分乙酰环氧单端孢烯二醇 （4 acetoxyscirpene -3,15diolAETD） 的抗癌活性比目前用于临床癌症病患者 治疗用的顺铂强约 4-6 倍 , 且毒性低， 安全范围大。因此， 高雄山虫草无论作为药物开发还 是作为保健品应用都具有广阔前景。在韩国， 高雄山虫草已经。
8、应用于食品及保健品中。由 于高雄山虫草的野生资源稀少， 利用人工培养生产其子实体， 是对高雄山虫草进行人工开 发的必由之路。 0003 但目前在高雄山虫草人工培养中存在的主要问题之一是在子实体生长过程中会 产生大量的分生孢子， 当这些分生孢子大量存在时， 对提高虫草子实体产量和生产人员的 健康安全都造成了较大影响， 因此， 寻找低产孢的高雄山虫草菌株和人工培养方法是当前 高雄山虫草子实体人工培养中重点需要解决的问题。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题在于， 提供一种高雄山虫草子实体低产孢菌株及子实 体的人工培养方法。在该人工培养方法下该菌株可发育形成产孢极低的子实体， 在高雄山 虫。
9、草的人工培养中具有良好的应用前景。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 0006 本发明提供的高雄山虫草， 属于粪壳菌纲、 肉座菌目、 麦角菌科、 虫草属， 菌株为高 雄山虫草子实体低产孢菌株 A1105（Cordyceps takaomontana A1105)， 菌株保藏号为 ： CCTCC M 2012307， 于 2012 年 8 月 9 日在中国典型培养物保藏中心 （地址 ： 中国 . 武汉 . 武 汉大学） 保藏。 0007 上述的高雄山虫草子实体低产孢菌株A1105分离自罹病昆虫标本， 在Czapek琼脂 培养基上， 25下培养 21 天时， 菌落平均直。
10、径为 32mm， 正面白色到肉色， 粉质， 背面白色到 褐色， 菌落平展、 薄， 边缘整齐， 未见形成环带或放射沟， 未见角变现象， 未见形成孢梗束。 0008 本发明的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法， 包含以下步骤 ： 0009 （1） 人工培养基制备 ： 取去皮的小麦粒 100g， 用清洁水浸泡 12h， 滤去多余水分后 放入培养盒内， 采用高压间歇灭菌法灭菌 2-3 次备用， 每次灭菌温度控制在 115， 时间控 制在 40min ； 0010 （2） 将 A1105 菌株摇瓶培养制成种子液， 向培养基上接种种子液 45ml， 置于 25 说 明 书 CN 103004463 B 3。
11、 2/3 页 4 下暗培养 10 天左右， 见有转色迹象时， 转入 16和 22下， 交替变温培养各 12h ； 其中在 22时， 见光培养 12h， 光照强度为 200xl， 在 16时， 暗培养 12h ； 25 天后即可收获子实体。 0011 上述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中， 步骤 （1） 所述培养盒体积为 13cm8cm11cm， 步骤 （2） 所述培养基体积为 13cm8cm3.5cm。 0012 前述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中， 步骤 （2） 所述 A1105 菌株摇瓶 培养的温度为 25， 转速 250r/min， 培养 4 天， 菌丝段达 107ml-1。
12、。 0013 前述的高雄山虫草低产孢子实体人工培养方法中， 在步骤 （2） 所述子实体第一次 收获后补水， 按照与第一次培养相同的方法， 进行二次培养， 共计可收获近双倍产量。 0014 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明提供的是一种高雄山虫草子实体低产孢菌株 及子实体的人工培养方法， 在该人工培养方法下该菌株可发育形成产孢极低的子实体， 有 效解决了现有技术在高雄山虫草人工培养中， 子实体生长过程中会产生大量分生孢子的技 术难题， 保障了生产人员的健康安全， 同时也提高了高雄山虫草子实体的产量， 在高雄山虫 草的人工培养中有良好的应用前景。 附图说明 0015 图 1 是本发明的高雄山虫。
13、草菌株 A1105 在 Czapek 琼脂培养基上培养性状 （正面） ； 0016 图 2 是本发明的高雄山虫草菌株 A1105 在 Czapek 琼脂培养基上培养性状 （背面） ； 0017 图 3 是采用本发明的菌株及方法培养获得的高雄山虫草子实体。 0018 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。 具体实施方式 0019 实施例 1。 0020 1、 人工培养时种子液的制备 0021 1.1 材料与方法 0022 1.1.1 材料 0023 1）菌株 ： 如图 1、 图 2 所示， 高雄山虫草 A1105， 分离自野外采集的虫生标本， 在 Czapek 琼脂培养基上， 25下。
14、培养 21 天时， 菌落平均直径为 32mm， 正面白色到肉色， 粉质， 背面白色到褐色， 菌落平展、 薄， 边缘整齐， 未见形成环带或放射沟， 未见角变现象， 未见形 成孢梗束。 0024 2） 培养基 ： 0025 菌种活化培养基 ： PDA 培养基。 0026 高雄山虫草液体培养基 : 马铃薯 200g 煮沸 30min 滤汁， 加入葡萄糖 20g， 加水 至 1000ml， 121， 灭菌 25min， 备用。 0027 1.1.2 方法 ： 将活化好的菌株 A1105， 用打孔器沿菌落边缘打孔后接入装有高雄 山虫草液体培养基的 250ml 三角瓶中， 装液量为 50ml， 置于 25。
15、， 250r/min 下培养 4 天。 0028 1.2 结果 ： 培养4天后备用。 将培养液混匀后作为种子接种到灭好菌的人工培养 基中。 0029 2、 高雄山虫草生产子实体的人工培养基制备 0030 2.1 实验材料 说 明 书 CN 103004463 B 4 3/3 页 5 0031 2.1.1 材料 ： 小麦。 0032 2.1.1其他材料及仪器 ： 较密闭的透光容器 （培养盒或罐头瓶） ， 人工气候箱或人工 气候室等。 0033 2.2 方法 0034 2.2.1 预处理 0035 将一定量去皮的小麦 （比如 100g 小麦） ， 放入体积为 13811cm 的培养盒中， 根 据小。
16、麦品种的不同经水浸泡 12h 左右备用。 0036 2.2.2 灭菌 0037 将浸泡好的小麦滤去多余的水分， 然后采用高压间歇灭菌法灭菌 2-3 次备用， 每 次灭菌温度控制在 115， 时间控制在 40min ； 0038 3、 高雄山虫草子实体生产的人工培养及结果 0039 3.1 接种 ： 将培养好的种子液用无菌处理的喷枪均匀喷施在培养基的表面 （1383.5cm 体积的培养基上可喷洒 45ml 的种子液） ， 然后放入培养箱。 0040 3.2 培养 ： 在 25下进行暗培养 10 天左右， 见菌丝密集布满整个培养基， 并有转 色迹象时， 改变培养条件为22， 12h见光培养， 光照。
17、强度为200xl左右为宜， 然后再改变培 养条件为 16 ,12h 暗培养， 两者交替进行。 0041 3.3 结果 ： 在培养 4 周左右时即可收获。可用剪刀等将子实体从培养基上切下来 保鲜或烘干保存。在本例中， 每个培养面积为 138cm 大的培养基上可生产出鲜重为 35g 左右， 干重为 8g 左右的子实体， 子实体的平均长度在 5-6cm， 直径为 1-2mm （见图 3） ； 经计数 检测， 每克鲜重子实体所含有的分生孢子数目仅为 3.6107， 相对很小。因此， 该菌株和该 条件下有利于低产孢子实体的产生。收获后可根据实际情况适当补水后进行二次培养， 培 养方法同第一次， 每盒进行。
18、二次培养后共计可以收获虫草子实体鲜重70g左右， 干重16g左 右。 0042 本发明中 ： 培养时可根据使用的小麦品种不同， 适当增减浸泡时间 ； 灭菌时采用 间歇灭菌这样灭菌更彻底， 而且可以在相对较低温度 （115） 下灭菌， 以延长培养盒的使用 寿命， 节约成本 ； 培养时光照度不宜过高， 过高会促使子实体产分生孢子， 且子实体形态易 变形。 另外， 培养中菌株选择也较为重要， 有的菌株在子实体刚形成不久就开始在子实体表 面形成较多的白色分生孢子， 这种菌株不宜使用。 0043 本发明的实施方式不限于上述实施例， 在不脱离本发明宗旨的前提下做出的各种 变化均属于本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103004463 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103004463 B 6 。